מיקרודיסקציה רב-שכבתית ופרופיל פונקציונלי-מבני של ענפי עורקי הכליה האנושיים

מטרת המחקר שלנו היא לבסס שיטות סטנדרטיות לבידוד והערכה תפקודית של ענפי עורקי הכליה האנושיים, לחשוף מנגנונים של תפקוד לקוי של כלי הדם ולהנחות טיפולים ממוקדים. מחקרים קודמים הסתמכו על מודלים של בעלי חיים או הדמיה עקיפה, כאשר מיוגרפיית החוט שלנו משקפת ישירות את תפקוד עורק הכליה האנושי במבחנה. השיטה שלנו מאפשרת ניתוח מדויק של כלי דם ספציפיים לאדם, התגברות על מגבלות מינים ושיפור פיתוח תרופות תרגומיות.

כדי להתחיל, ודא שרקמת הכליה נשארת שקועה במלואה בנוזל במהלך ההובלה כדי לשמור על חיוניות הרקמה ושלמות המבנה. זהה חזותית את מישור העטרה על ידי איתור הילום הכליה ויישור החתך כך שיעבור הן דרך אגן הכליה והן דרך הגבול הקמור לרוחב. בעזרת אזמל סטרילי, חצו את הכליה לאורך מישור העטרה הזה כדי ליצור שני חצאים סימטריים, וחשפו מבנים פנימיים, כמו פירמידות הכליה והעמודים.

תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש במספריים ובמלקחיים של מיקרו-דיסקציה כדי להפריד בקפידה את העורקים האינטרלובריים, הקשתיים והבין-אוניים בצלחת תרבית בעלת תחתית שחורה בגודל 10 סנטימטרים. לאחר מכן, הסר בעדינות את כל הרקמות והשומן שמסביב מהעורקים המנותחים באותה צלחת תרבית עם תחתית שחורה בגודל 10 סנטימטרים כדי לנקות אותם ביסודיות. בעזרת מספריים מיקרו-דיסקציה, חתכו את העורקים הנקיים לטבעות באורך של כשני מילימטרים למחקרי תפקוד כלי הדם.

הכנס בזהירות את חוט ההנחיה הראשון לטבעת עורקי בכלי. כופפו צד אחד של חוט ההנחיה בזווית של 90 מעלות, והעבירו את הטבעת העורקית עם החוט לתוך החדר. לפני קיבוע הטבעת העורקית על מחזיק הדגימה, רשום את אורך הכלי.

הניחו את הטבעת בין שני המחזיקים, וקראו את סולם המיקרומטר, כאשר חלוקת סולם אחת שווה ל-10 מיקרומטר. הפחיתו את ערך קנה המידה הראשוני שנמדד כאשר המחזיקים פשוט נוגעים זה בזה כדי לחשב את אורך ורוחב הטבעת העורקית. לאחר מכן, קבע את הטבעת העורקית על מחזיק הדגימה מסוג צדפה באמצעות הברגים המצורפים למכשיר, והדק אותם בכיוון השעון.

לאחר מכן, השחילו חוט מנחה שני דרך הטבעת העורקית. סובב את החוט בכיוון השעון סביב ברגי הקיבוע בשני הקצוות, והדק אותו בחוזקה לפני השטח של מחזיק המדגם. בחר הגדרות נורמליזציה מתפריט DMT, והגדר את כיול העינית כמילימטר אחד לכל חלוקה, לחץ היעד כ-13.3 קילופסקל, IC1/IC100 כ-0.9, זמן ממוצע מקוון כשלוש שניות וזמן עיכוב כ-60 שניות.

בחר את הערוץ המתאים לעורק היעד ופתח את מסך הנורמליזציה מתפריט DMT. בשדות המתאימים, הזן את נקודות הקצה של רקמות מכיוון ש-a1 שווה לאפס ו-a2 שווה לאורך הכלי הנמדד במילימטרים. הזן את קוטר החוט כ-40 מיקרומטר, והזן את קריאת המיקרומטר מהסולם.

לחץ על הוסף נקודה כדי לשמור את הנתונים. כעת החל מתיחה פסיבית והמתן שלוש דקות. הזן את קריאת המיקרומטר החדשה כנקודה הבאה ולחץ על הוסף נקודה.

הוסף לתא חמישה מיליליטר של תמיסת יון אשלגן 60 כדי לגרום להתכווצות בתיווך אשלגן של הכלי. כדי לשטוף את תמיסת יוני האשלגן 60, הוסף חמישה מיליליטר תמיסת קרבס שלוש פעמים. כדי להעריך התכווצות תלוית ריכוז הנגרמת על ידי פנילפרין, יש למרוח פנילפרין מצטבר במרווחים של חצי לוג מ-10 בחזקת שלילי תשע עד 10 בחזקת שלילי ארבע טוחנות.

לבדיקת סמים נוספת, שטפו את התא בחמישה מיליליטר חמים של תמיסת קרבס לפחות חמש פעמים עד שהמתח חוזר לקו הבסיס ונשאר יציב למשך 10 דקות לפחות. העורק האינטרלובר נותח בהצלחה ממדולה הכליה, והראה דופן כלי דם עבה ורקמת שומן סביב שדרשה הסרה זהירה כדי לשמור על שלמות המבנה. העורק הקשתי בודד בצומת הקורטיקומולרי, והציג דופן כלי דם דקה יותר ומסלול מקושת.

העורק הבין-לובולרי זוהה עובר באופן ליניארי דרך קליפת הכליה עם דופן דקה מאוד ומשולב היטב עם רקמת קליפת המוח. ניתוח היסטולוגי גילה כי לעורק האינטרלובר יש את דופן כלי הדם העבה ביותר עם אדוונטיציה מובהקת, בעוד שהעורקים הקשתיים והבין-אוניים הפגינו דפנות דקות יותר בהדרגה ופחות שכבות שרירים חלקות. נורמליזציה של העורקים כללה מתיחות מכניות חוזרות ונשנות וגירוי המושרה על ידי אשלגן, תוך יצירת תנאי מתח בסיסיים יציבים על פני דגימות.

תוספת מצטברת של פנילפרין מ-10 בחזקת שלילי 9 עד 10 בחזקת ריכוזים שליליים של ארבע מולאריות גרמה להתכווצויות חזקות יותר בהדרגה בטבעות העורקים באופן תלוי מינון. בעורקים מכווצים מראש של פנילפרין, הגדלת ריכוזי האצטילכולין מ-10 בחזקת שלילי שמונה עד שלוש כפול 10 בחזקת שלילי חמש טוחנת יצרה הרחבת כלי דם תלוית ריכוז.