הנדסת 3D Flipwell לפיתוח מערכות אסינכרוניות לטיפולים טוקסיקולוגיים ואימונומודולטוריים בתאי חיידקים, מעיים ומערכת החיסון

פיתחנו מערכת קו-קולטורה תלת-ממדית המדמה את סביבת רירית המעי כדי לחקור את ההסברים הסדרתיים ולהערכת תגובות התרופות שיכולות לשמש לסינון סמים ולהבנת אינטראקציות תאי ריריות. קבוצות שונות פיתחו מספר מערכות תרביות שונות למידול סביבת רירית המעי באמצעות טכניקות ביו-הנדסה מורכבות מאוד. אבל במקום זאת, פיתחנו מערכת קו-קולטורה שקל הרבה יותר ליצור באמצעות חומרים זולים יותר.

מערכת הקו-קולטורה שלנו גילתה שתרופה חלבונית מפעילה תגובות מתואמות בין חיידקי המעי, האפיתל ותאי החיסון, מפעילה את חסינות המארח ככל הנראה באמצעות מטבוליטים חיידקיים ומתווכת תקשורת בין מינים. מטרתנו לחקור הן זנים אירוביים והן אנרוביים והן את המטבוליטים שלהם כדי לחשוף השפעות מווסתות מערכת חיסון, ולסלול את הדרך לאסטרטגיות אימונותרפיות חדשות המבוססות על מטבוליטים של חיידקים. כדי להתחיל, פתחו כיסוי צלחת פטרי והניחו אותו בצד.

הנח להב סכין על קצה תחתית הצלחת פטרי. קחו פינצטה סטרילית ותחזיקו בעדינות את התחתית כלפי מעלה כדי להוציא אותה מהאריזה. ביד השנייה, קח את להב הסקלפל הסטרילי והביא אותו אל ההכנסה.

בתנועה בצורת C, חורצים את הממברנה בקצה והחליקו בעדינות את להב הסכין סביב תחתית ההכנסה, תוך שמירה קרובה לקיר הפלסטיק. חתכו את ממברנת ה-PET והשתמשו בפינצטה השנייה כדי להסיר אותה. לאחר מכן השתמשו בלהב הסקלפל כדי לגרד שבבי ממברנה לבנים ולנקות את הקצה והשפה של ההכנסה.

לאחר מכן, מרח בעדינות טיפה של סיליקון בקוטר 2-3 מ"מ סביב לתחתית ההכנסה, תוך זהירות לא לגעת בממברנה. הרימו את סט המלקחיים הסטריליים השני והרימו בזהירות את ההכנסה הראשונה ללא הממברנה מתוך התרמיל המגן. הביא את שני ההרכבות יחד מלמטה למטה כך שהחישולים התחתונים יתיישרו.

כאשר הערימות של פליפול מודבקות, הניחו אותה בתוך החבילה הסטרילית המקורית או בצלחת פטרי עמוקה לייבוש למשך 72 שעות. השתמש במכסה של צלחות פטרי שצוינו כדי לכסות את מכלול הערימה. כדי לעקר את מרכבי הארומה, השתמשו במלקחיים סטריליים לתליית ערימת הפליפוול על שפת שפת צלחת פטרי העמוקה שנקבעה.

לאחר מכן, סגור את סרט הזכוכית של ארון הבטיחות הביולוגית והדליק את האור האולטרה-סגול. כדי לבדוק דליפה לפני ציפוי קולגן, הוסף תחילה 500 מיקרוליטר של PBS סטרילי או מים דה-יוניים סטריליים. למחרת, שאפו את הנוזל המשמש לבדיקה לפני הייבוש של הערימות במשך שעה-שעתיים בתוך ארון הבטיחות הביולוגית.

כדי לצפות את הממברנה בקולגן, פתח את מכסה צלחת פטרי ותן לפליפול לתלות על שפת צלחת הפטרי. הוסיפו בזהירות 200 מיקרוליטר של תמיסת קולגן לצד אחד של ערימת ההכנסה. שאיפת תמיסת הקולגן אחרי שעה, ואז פיפטה של 200 מיקרוליטר PBS סטרילי. לאחר שאיפת ה-PBS, מכסים את צלחת פטרי במכסה ותנו לממברנה להתייבש במשך 60 דקות בתוך הארון.

כאשר הממברנה יבשה, השתמשו במלקחיים או פינצטה סטרילית, הפכו את הפליפוול לצד הנגדי ותנו לו לתלות על שפת צלחת הפטרי. כדי להכין את ההכנסת החיידקית, יש להניח שני סטים של מלקחיים סטריליים ואת הכנסות ל-24 בארות בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. עם פינצטה סטרילית, הרם את התוספת מהתיק הסטרילי שלו.

עם הסט השני של פינצטה או מלקחיים, שבור את הרגליים הפלסטיק הקטנות בתחתית ההכנסה. בדקו את התוספת עם 24 בארות על ידי התאמתה בתוך אחת מערימות ההכנסה הסטריליות של פליפוול קו-קולטור או בתוך האינסרטים המקוריים עם 12 בארות. כדי להתחיל לזרוע את הפליפולים, זרעו 500 מיקרוליטר מקווי תאי האפיתל בכל צד של הצד האפיקלי של הפליפול.

כסו את ההרכבות במכסה צלחת פטרי, ואז דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני במהלך הלילה עד שהתאים מתחברים. פתח את מכסה צלחת פטרי ושאף את מדיום ה-DMEM מהצד האפיקלי של ערימת הפליפול. עם מלקחיים סטריליים, הרימו את הפליפוול בזהירות מהוו וסובבו אותו ב-180 מעלות.

עם הסט השני של מלקחיים סטריליים, תפסו את ערימת הפליפול מהוו השני שפונה כלפי מעלה. לאחר מכן הורד את המכלול חזרה לצלחת פטרי ותלה את הקרס מעל שפת צלחת הפטרי. הוסף 500 מיקרוליטר של תליית תאי THP-1 לצד האפיקלי של ערימת ההכנסת הקו-קולטור.

כוונו את מדיום HT-29 לתאי האפיתל של המעי הגס על ידי הוספת מדיה לצלחת פטרי של באר עמוקה. כדי להסיר בועות אוויר, החזיקו את ערימת הפליפול בזרוע עם מלקחיים סטריליים. הנמיך בזהירות מחט גבאג' בתוך ומתחת למכלול ההכנסה, והניח בעדינות רבה את הקצה הרך אל בועת האוויר.

בזהירות ובלאט מאוד משכו את הבוכנה למעלה וצפו בבועת האוויר נעלמת לאט. לאחר מכן הוציאו בזהירות את המחט והמזרק מהפליפוול. לאחר שהוסרו בועות האוויר באמצעות מחט גאוויג', תרבעו את שני סוגי התאים באינקובטור תרבית התאים.

עם מלקחיים, מניחים את התוספת בתוך צלחת פטרי סטרילית וכסו עם המכסה. העבר את צלחת פטרי עם הפליפולים לארון הבטיחות הביולוגית והניח בצד הנגדי של הצלחת עם תוספות חיידקיות. הוציא 300 מיקרוליטר של מדיום DMEM מהצד האפיקלי של הפליפוול כדי לאפשר את הכנסת החיידקים, ואז לכסות עם מכסה צלחת פטרי.

כעת, הוסיפו 50 עד 100 מיקרוליטר של תרבית Bacillus subtilis לתוספות החיידקים של 24 בארות והכניסו אותה לצד העליון של Flipwell. סובב את הזרוע ותלה אותה מהשפה של ערימת ההכנסת של פליפוול קו-קולטור. החזק את הערימה עם הסט השני של מלקחיים סטריליים.

לאחר דגירה של שלוש שעות, השתמשו במלקחיים סטריליים כדי להסיר את הכנסת החיידקים מהפליפוול. הניחו את ה-Flipwell בתוך צינור חרוטי בנפח 50 מיליליטר ללא פירוק. כדי לפרק את ה-Flipwell למיקרוסקופיה אלקטרונית, החזק אותו בשתי הידיים וסובב כל חלק מודבק בערימה.

סובב את האינסרט עם הממברנה ומניח אותו כשהממברנה פונה כלפי מעלה. החזק את ההכנסה, חתך בזהירות את הממברנה עם להב סכין, ואז מניח אותו בתוך צינור בנפח 1.7 מיליליטר המכיל תמיסת אלדהיד פרפורמית. למיקרוסקופיה קונפוקלית, מוסיפים 300 מיקרוליטר של PBS סטרילי לצד האפיקלי.

הסר בזהירות את הערימה מהצלחת פטרי לאחר שהוצאת ה-PBS. עכשיו, הפוך את ה-Flipwell והוסיף 300 מיקרוליטר של PBS לצד ה-RPMI הפונה כלפי מעלה של ערימת ההכנסת Flipwell Co-Culture, ואז שאיפת את המלח עם הפוספאט. באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר, יוצרים טיפה גדולה של PBS.

סובב את מכלול האינסרט כדי להיפרד לתוך האינסרטים. לאחר מכן מקמו בזהירות את ערימת ה-Flipwell עם תאי THP-1 מעל טיפת 200 מיקרוליטר של PBS. הוסיפו 200 מיקרוליטר של בופר חדירות לצד העליון עם תאי אפיתל במעי הגס ומשאירים ל-10 דקות.

לצביעה אימונופלואורסצנטית, יש פיפטה של 300 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני לחלק העליון של ההכנסה. הוסיפו 300 מיקרוליטר נוגדן ראשוני לבאר של צלחת 12 בארות, ואז הניחו את התוספת בתוך הבאר מעל הטיפה. כסה היטב את הנוגדן.

הצביעות הראו עלייה דרמטית בהפרשת הריר במחלקת האפיתל של המעי לאחר טיפול בספיאפטרין, כפי שמעיד עלייה בחלבון הסמן האפיתל CK20 ובחלבון הריר MUC2. במונוקולטורות THP-1, טיפול בספיפטרין הגביר משמעותית את הביטוי של סמן המקרופאג M1 CD80, תוך הפחתה של ויסות סמן מקרופאג M2 CD163, מה שמעיד על קיטוב M1. מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת חשפה הפרשת ריר מוגברת מתאי אפיתל בתרבות משותפת שטופלו בספ.

טיפול בספיאפטרין גרם למורפולוגיה של מקרופאגים הדומה לפנוטיפ M1 הן במונוקולטורות והן בקו-קולטורלצות. תאי חיידקים במונוקולטורה מטופלת בספיפטרין הציגו משטחים מקומטים האופייניים להיווצרות ביופילם.