הדפסה השקועה של תאים על גבי משטח שונה באמצעות זרימת Microspotter רציפה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדפיס שלושה T שלושה פיברובלסטים על משטח מצופה סרום. זה מושג על ידי סרום ספיחה ראשון על משטח תרבית רקמה. השלב השני הוא הדפסת תרחיף של פיברובלסטים על פני השטח באמצעות מיקרו ספוטר זרימה רציפה, ואחריו דגירה של התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר מכן, תאים מודפסים כמו גם תאים שנזרעו באמצעות תרבית תאים סטנדרטית נצבעים בפרופידיום יודיד ומודגמים תחת מיקרוסקופ הפוך להשוואה. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשת להערכת כדאיות התא, הצפיפות והמורפולוגיה בנקודות זמן רלוונטיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הדפסת סיכות, הוא שראש ההדפסה יוצר אטימה על פני השטח, ומאפשר להדפיס תאים כשהם שקועים במדיה סלולרית.

בעוד שהדפסה שקועה של תאים שימושית לסינון מועמדים לתרופות חדשות לבטיחות ויעילות, הדפסה שקועה באופן כללי שימושית גם ליישומים אחרים. לדוגמה, אנו יכולים לנתח מועמדים לתרופות חדשות מול פרוסות רקמה, או להשתמש בהן כמודל למערכות איברים. לדוגמא, מודל שפע כבד.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שבמהלך תחול המדפסת והדפסת התאים, אוויר לא יכול להיכנס לקווים או שהוא עלול לגרום למוות של תאים. כדי להתחיל להפשיר NIH שלושה T, שלושה תאים למשך שתיים-שלוש דקות באמבט מים רועדים ב-37 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של מדיה שלמה וצנטריפוגה ב-1500 Gs למשך שלוש דקות.

הסר את נוזל התא מבלי להפריע לכדורית התא. לאחר מכן השעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר מדיה והעבירו 10 מיקרוליטר מתרחיף התא לצינור מיקרו צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטר של טריאם כחול לתרחיף התא וערבבו עם קצה הפיפטה 10 מיקרוליטר מהתאים המוכתמים לתא ציטומטר המו.

לפני ספירת התאים בהגדלה של פי 10, ספרו את התאים החיים הדומים לכדורים לבנים קטנים עבור ארבעה מתוך תשעת הריבועים הגדולים. ספרו רק את התאים החיים שאינם נראים כחולים כהים מהכתם הכחול הטריפני. חשב את מספר התאים הממוצע לכל ריבוע גדול, וכתוצאה מכך מספר התאים כפול 10,000 תאים למיליליטר בתרחיף התא המקורי.

לאחר מכן תאי זרע בצפיפות של 100,000 תאים למיליליטר עם סה"כ חמישה מיליליטר בכל בקבוק T 25. תרבית התאים לשטף של בין 70 ל-80% לפני תחילת הניסויים. להכנת משטח ההדפסה, השתמש בטוש כדי לסמן מלבן בגודל ראש ההדפסה בתחתית פוליסטירן 12 שטופל בתרבית רקמות.

ובכן צלחת פיפטה 50 מיקרוליטר של סרום בקר עוברי לאזור המלבני ומפזרת אותו על כל האזור. בעזרת הקצה, השאירו את צלחת הבאר בקולט אדים סטרילי למשך הלילה כדי לאפשר לנקודת הסרום להתייבש לחלוטין. כדי להתחיל בהדפסה שקועה, שטוף את ראש ההדפסה במים מזוקקים.

לאחר מכן מלאו צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר במים מזוקקים ועגנו את ראש ההדפסה על המים המזוקקים בזרימה השטחית דרך כל אחד מהקווים למשך שתי דקות במהירות של 150 מיקרוליטר לדקה באמצעות משאבה פנאומטית. לאחר מכן השליכו את המים מצלחת הפטרי ומלאו אותם במים נקיים. לאחר מכן, הזז את ראש ההדפסה למעלה ולמטה במים שלוש פעמים.

עגן את מרכז ראש ההדפסה מעל הנקודה המצופה בסרום בצלחת 12 הבארות שהוכנה מראש. לאחר מכן יש להניח את ראש ההדפסה עם Prewarm. מדיה מלאה ב-300 מיקרוליטר לערוץ.

אם אתה מבצע הדפסות מרובות, הוסף שטיפת אקונומיקה בנוסף לשטיפת המים בין ההדפסות. המשך להדפיס את התאים התלויים בריכוז של 50,000 תאים למיליליטר על פני השטח, וב -60 מיקרוליטר לדקה. 100 מיקרוליטר לערוץ.

לאחר הדפסת תאים, הנח את ראש ההדפסה הנותר מעוגן על פני השטח והסעפת בחממת תרבית תאים. הגדר ל -5% פחמן דו חמצני ו -37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר הדגירה של שעתיים, הסר את ראש ההדפסה והניח את המכסה על צלחת התרבות.

השעה שבה מסירים את ראש ההדפסה נחשבת לנקודת הזמן של שעת האפס. לשם השוואה, מבוצעת גם תרבית תאים סטנדרטית. הוסף מיליליטר אחד של מדיה חמה מראש לאחת מ-12 צלחות הבאר המנוקדות בסרום, ואז קח מיליליטר אחד ממתלה התאים הנותר והכניס אותו לבאר אחת של צלחת 12 הבארות.

זה יפיק תרבית המכילה 50,000 תאים בצלחת. מניחים את צלחת תרבית התאים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר הדגירה של שעתיים, התחל בתזמון לעקביות בין דגימות מודפסות לזריעה.

נקודת זמן זו נחשבת לנקודת הזמן של שעת האפס. לאחר 0, 2, 24 ו-48 שעות, הכינו תאים מכל אחת משתי השיטות להדמיה על ידי צביעה בפרופידיום יודיד, המשולב רק בגרעין התאים המתים. ראשית, שטפו בעדינות את התאים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מי מלח תפוחים פוספט עם סידן ומגנזיום כדי להסיר פסולת.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מצע התרבות הקדם-חם לכל כלי תרבית, ולאחר מכן מיקרוליטר אחד של יודיד פרופידיום. תמיסת מלאי דוגרת על התאים המוכתמים בפרופידיום יודיד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני הדמיית התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 10 ו-40. לבסוף השליכו את התאים במיכל ביולוגי מתאים.

קו התאים הפיברובלסטים, NIH שלושה T, שלושה תאים, הודפסו או נזרעו על משטח שקוע. לאחר ההדפסה והזריעה, התאים הודגמו כדי להעריך את הצפיפות והמורפולוגיה בנקודות זמן רלוונטיות. התמונות הראו כי לתאים יש פנוטיפים כמעט זהים בכל נקודת זמן ובכל הגדלה.

על סמך נתונים אלה, ההדפסה האפקטיבית נקבעה כמינימלית. כדאיות התאים הוערכה באמצעות צביעת פרופידיום יודיד, וגילתה כי הכדאיות של התאים המודפסים לא הייתה שונה באופן משמעותי מהתאים היושבים בכל נקודת זמן. ההבדל העיקרי בין שתי השיטות להצמדת התאים לפני השטח הוא צפיפות התאים.

צפיפות התאים המודפסים פוחתת בנקודת הזמן של שעתיים ביותר מ- 50% הן בתאים יושבים והן בתאים מודפסים. יש צורך במחקר נוסף כדי לקבוע את הגורם לירידה זו. עם זאת, יחסי הצפיפות המודפסים הכוללים בהשוואה לזרעים נשארים גבוהים משמעותית.

צפיפות התאים המודפסים בתא הזרימה הייתה צפופה בערך פי 10 בכל נקודת זמן מאשר התאים שנזרעו בהתחשב בתאים הודפסו באותה צפיפות כמו זריעה, אך בשטח קטן יותר. בנקודת הזמן הסופית, התאים נמצאים באותה צפיפות, מה שככל הנראה נובע מתנועתיות התאים ומגבלות צריכת משאבים. מאז פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי גילוי תרופות לחקור את ההשפעות של רעילות ויעילות תרופות על תאים ועזרי סרטן, מחלות לב ותחומי ביקוש גבוהים אחרים.

על ידי שימוש בהדפסת תאים שקועים בשילוב עם טכנולוגיות אחרות כגון היצמדות, הידבקות תאים ניתנת לתכנות, אנו יכולים להרחיב את טווח ההגעה של הטכניקה לתאי השעיה לגילוי מורחב של תרופות וסינון פיתוח. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לך הבנה מוצקה כיצד להדפיס תאים באמצעות טכניקת ההדפסה השקועה שלנו.