הדפסה השקועה של תאים על גבי משטח שונה באמצעות זרימת Microspotter רציפה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדפיס פיברובלסטים מסוג T three על משטח מצופה בסרום. דבר זה מושג תחילה על ידי ספיחה מוקדמת של סרום על משטח לתרבית רקמות. השלב השני הוא הדפסת תרחיף של פיברובלסטים על המשטח באמצעות מיקרו-ספוטר (micro spotter) בעל זרימה רציפה, ולאחריה אינקובציה של התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים.

בשלב הבא, תאים מודפסים וכן תאים שנזרעו באמצעות תרבית תאים סטנדרטית נצבעים ב-propidium iodide ונצפים תחת מיקרוסקופ הפוך לצורך השוואה. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית להערכת חיוניות התאים, צפיפותם ומורפולוגייתם בנקודות זמן רלוונטיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון pin printing, הוא שראש ההדפסה יוצר אטם מעל הפני השטח, מה שמאפשר להדפיס תאים בעודם טבולים במצע גידול תאים.

בעוד שהדפסה שקועה של תאים שימושית לסריקת מועמדים לתרופות חדשות לצורך בדיקת בטיחות ויעילות, הדפסה שקועה באופן כללי שימושית גם ליישומים אחרים. לדוגמה, ניתן לנתח מועמדים לתרופות חדשות מול פרוסות רקמה, או להשתמש בשיטה זו כמודל למערכות איברים. לדוגמה, מודל פרפוזיה של כבד.

בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקשו בביצועה, מכיוון שבמהלך הכנת המדפסת (priming) והדפסת התאים, אוויר אינו יכול להיכנס לצינורות שכן הדבר עלול לגרום למות התאים. לתחילת העבודה, הפשיר תאי NIH 3T3 במשך שתיים עד שלוש דקות באמבט מים נער עם טמפרטורה של 37 °C. השהה מחדש את התאים ב-5 mL של מצע גידול מלא וסבב בצנטריפוגה ב-1500 Gs למשך שלוש דקות.

הסר את עליון התרבית מבלי להפריע למשקע התאים. לאחר מכן, השהה את התאים בחמישה מיליליטר של מצע העשרה והעבר 10 µL של תרחיף התאים למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.5 מיליליטר. כעת, הוסף 10 µL של trypan blue לתרחיף התאים וערבב באמצעות קצה הפפיטה. פפיט 10 µL של התאים הצבועים אל תוך תא של המוציטומטר.

לפני ספירת התאים בהגדלה של 10x, ספרו את התאים החיים, הנראים ככדורים לבנים קטנים, בארבעה מתוך תשעת הריבועים הגדולים. ספרו רק את התאים החיים שאינם נראים בכחול כהה כתוצאה מצביעת ה-trypan blue. חשבו את מספר התאים הממוצע לריבוע גדול, ובכך תקבלו את מספר התאים כפול 10,000 תאים למיליליטר בתרחיף התאים המקורי.

לאחר מכן, זרעו תאים בצפיפות של 100, 000 תאים למיליליטר בנפח כולל של חמישה מיליליטר בכל בקבוק T 25. גדלו את התאים עד להגעה ל-70 עד 80% confluence לפני תחילת הניסויים. להכנת משטח ההדפסה, השתמשו בטוש כדי לסמן מלבן בגודלו של ראש ההדפסה בתחתית של polystyrene 12 שעבר טיפול לתרבית רקמות.

בעזרת פפטה, העבירו 50 µL של סרום עגל עוברי (fetal bovine serum) אל האזור המלבני בלוחית הבארים ופזרו אותו על פני כל האזור. השאירו את לוחית הבארים בתוך מטאב בסטרילי למשך לילה, כדי לאפשר לכתם הסרום להתייבש לחלוטין. כדי להתחיל בהדפסה טבולה, שטפו את ראש ההדפסה במים מזוקקים.

לאחר מכן, מלאו צלחת פטרי בנפח 60 מילימטר במים מזוקקים והניחו את ראש ההדפסה על פני השטח; הזרים מים מזוקקים דרך כל אחת מהקוים למשך שתי דקות בקצב של 150 microliters per minute באמצעות משאבה פנאומטית. לאחר מכן, השליכו את המים מצלחת הפטרי ומלאו אותה במים נקיים. לאחר מכן, הניעו את ראש ההדפסה למעלה ולמטה בתוך המים שלוש פעמים.

מקם את ראש ההדפסה במרכז מעל הנקודה המצופה בסרום בפלטת 12 הבארים שהוכנה מראש. לאחר מכן, בצע הטרייה (prime) לראש ההדפסת באמצעות Prewarm. השלם את המדיום ל-300 microliters לכל תעלה.

במקרה של ביצוע מספר הדפסות, יש להוסיף שטיפה במלבין בנוסף לשטיפה במים בין ההדפסות. יש להמשיך בהדפסת התאים התלויים בריכוז של 50,000 תאים למיליליטר על פני השטח, ובקצב של 60 microliters לדקה. 100 microliters לכל תעלה.

לאחר הדפסת התאים, מקם את ראש ההדפסה בעמדת העגינה השמאלית כנגד המשטח ואת המניפולד (manifold) בתוך אינקובטור לתרביות תאים. הגדר את התנאים ל-5% carbon dioxide ו-37 degrees Celsius למשך שעתיים. לאחר דגירה של שעתיים, הסר את ראש ההדפסה והנח את המכסה על צלחת התרבית.

הזמן שבו מסירים את ראש ההדפסה נחשב לנקודת הזמן של שעת האפס. לצורך השוואה, מבוצעת גם תרבית תאים סטנדרטית. הוסיפו 1 mL של מצע חיפוי שחומם מראש לאחת מלוחות 12 הבארים שעליהם נטפטפו סרומים, ולאחר מכן קחו 1 mL מהתרחיף התאי שנותר והעבירו אותו באמצעות פיפטה לבאר אחת בלוח 12 הבארים.

פעולה זו תניב תרבית המכילה 50,000 תאים בצלחת. הנח את פלטת תרבית התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. לאחר דגירה של שעתיים, התחל את תזמון הפעולות כדי להבטיח עקביות בין הדגימות המודפסות לדגימות הזריעה.

נקודה זו נחשבת לנקודת הזמן של שעת האפס. לאחר 0, 2, 24 ו-48 שעות, הכין תאים מכל אחת משתי השיטות לצורך הדמיה על ידי צביעה ב-propidium iodide, שנספג רק בגרעין של תאים מתים. ראשית, שטוף בעדינות את התאים שלוש פעמים עם 1 mL של phosphate buffered saline עם סידן ומגנזיום כדי להסיר שאריות.

בשלב הבא, הוסיפו מיליליטר אחד של מצע גידול שחומם מראש לכל כלי גידול, ולאחר מכן מיקרוליטר אחד של תמיסת מלאי propidium iodide. דגרו את התאים הצבועים ב-propidium iodide בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות לפני דימות התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך בהגדלות של 10x ו-40x. לבסוף, השליכו את התאים למכל פסולת ביולוגית מתאים.

שורת תאי הפיברובלסט, תאי NIH three T three, הודפסו או נזרעו על פני שטח שקוע. לאחר ההדפסה והזריעה, התאים הודגמו ויזואלית כדי להעריך את הצפיפות והמורפולוגיה בנקודות זמן רלוונטיות. התמונות הראו כי התאים בעלי פנוטיפים כמעט זהים בכל נקודת זמן ובכל הגדלה.

על סמך נתונים אלו, נקבע כי ההדפסה היעילה הייתה מינימלית. חיוניות התאים הוערכה באמצעות צביעה ב-propidium iodide, והיא גילתה כי החיוניות של התאים המודפסים לא הייתה שונה באופן מובהק מזו של התאים שהושבצו בכל נקודת זמן. ההבדל העיקרי בין שתי השיטות להצמדת התאים לפני השטח הוא צפיפות התאים.

צפיפות התאים המודפסים יורדת בנקודת הזמן של שעתיים ביותר מ-50% הן בתאים שהושתלו והן בתאים המודפסים. נדרש מחקר נוסף כדי לקבוע את הסיבה לירידה זו. עם זאת, יחסי הצפיפות המודפסת הכוללים, בהשוואה לתאים שהושתלו, נותרים גבוהים באופן משמעותי.

צפיפות התאים המודפסים בתא הזרימה הייתה גבוהה פי 10 בקירוב בכל נקודת זמן בהשוואה לתאים שנזרעו, בהתחשב בכך שהתאים הודפסו באותה צפיפות של הזריעה, אך בשטח קטן יותר. בנקודת הזמן הסופית, התאים נמצאים באותה צפיפות, דבר הנובע ככל הנראה מניידות תאים ומגבלות של צריכת משאבים. מאז פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי גילוי התרופות ללימוד השפעותיהן של רעילות ויעילות של תרופות על תאים, ובחקר סרטן, מחלות לב ותחומים נדרשים אחרים.

באמצעות שימוש בהדפסת תאים טבולה בשילוב עם טכנולוגיות אחרות, כגון היצמדות ותאי-היצמדות ניתנים לתכנות, נוכל להרחיב את יישומי הטכניקה לתאי התלייה לצורך הרחבת סקרים לגילוי ופיתוח תרופות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מוצקה של אופן הדפסת תאים באמצעות טכניקת ההדפסה הטבולה שלנו.