מבחן פרופיל תרומבוס: פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה לאפיון מקיף של תרומבוגנזה ביומכנית

פיתחנו שיטה חדשה שיכולה ללכוד כראוי את התכונות הביומכניות של טרומבוזה וגם לזהות חריגות פרותרומבוטיות בבני אדם. כדי להתחיל, השתמשו בוויפר סיליקון לייצור תבנית מאסטר פוטוריזיסט SU8 באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית המבוססת על העיצוב, ומאובטחים את התבנית הראשית בתחתית צלחת פטרי באורך 15 סנטימטר באמצעות סרט. הכינו את תערובת הפולידימתילסילוקסן, או PDMS, על ידי ערבוב בסיס הפרה-פולימרי וחומר הקיבוש מערכת האלסטומר הסיליקוני ביחס משקל של 10 ל-1.

שפוך את תערובת ה-PDMS לתבנית הראשית. לאחר מכן מניחים את הצלחת המכילה תערובת ה-PDMS במייבש ואקום כדי להסיר גזים. יש לרפא תרמית את תערובת ה-PDMS על ידי הנחתה באינקובטור עם טמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר הסרת הדגימה מהאינקובטור, חתכו בזהירות את ה-PDMS המיובש מהתבנית הראשית, וחתכו את ה-PDMS המקובש ליחידות שבב נפרדות. באמצעות מחט פרוב, נקב חורים במיקומים המיועדים ליצירת הכניסה והיציאה. במכסה כימיקלים, השתמש במגבון משימה רטוב ב-75% אתנול כדי לנקות את הזכוכית ולייבש אותן.

לאחר מכן, באמצעות גנרטור בתדר גבוה, מטפלים בסליידי הזכוכית למשך 30 שניות ובשבבי ה-PDMS למשך 20 שניות. יישר כל שבב עם מחסנית זכוכית ולחץ בעדינות את השבב על משטח הזכוכית כדי לקשור אותו. עכשיו מחברים את המכשירים תרמית על ידי הכנסתם לתנור עם טמפרטורה של 150 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר ההדבקה, אחסן את המכשירים בטמפרטורת החדר בתנאים ללא אבק. לאחר מכן, באמצעות מלקחה, הסר את החלק הפלסטי של מחטי הגשוש וכופף את צינורות המתכת ל-90 מעלות כדי ליצור מחברים למכשירי מיקרופלואיד. לאחר הגדרת התגובות להצמידת פיברינוגן והנוגדנים הנדרשים עם אלקסה פלואור, צנטריפוגה את עמודות הטיהור ב-1,100 גרם למשך שתי דקות כדי להסיר את בופר האחסון.

לאחר השלכת הזרימה, טען את תמיסת התגובה על עמודת הטיהור המותקנת בבקבוק איסוף תואם ובצנטריפוגה ב-1,100 גרם למשך חמש דקות לקציר התערובת הנדרשת. באמצעות ספקטרופוטומטר, מדוד את הספיגה של החלבון ואות הצבע. חשב את ריכוז החלבון ואת היחס המולרי בין פלואורסצנציה לחלבון.

אחסן את הצבעים בארבע מעלות צלזיוס בחושך. הוסיפו הפארין לבופר הטירוד לריכוז סופי של 0.32 יחידות למיליליטר לכל 10 מיליליטר דם שיאספו, והכינו את המזרק על ידי שאיבת 500 מיקרוליטר של בופר טירוד ב-pH 7.4. לאחר איסוף הדם באמצעות ורידיות במזרק המכיל הפארין, העבר אותו לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר ושמור על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

דילל מונומר פקטור פון וילברנד לשני מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS. ציפו מראש את מכשירי המיקרופלואיד במונומבר מדולל של פקטור פון וילברנד ודגרו אותם במשך שעה בטמפרטורת החדר. עכשיו דגרו את דגימת הדם עם חיישן פלואורסצנטי 1 או הגדר 2 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, חבר מכשיר מיקרופלואידי עם מחברי כניסה ויציאה וצינורות. חבר את הקצה השני של מחבר הכניסה לצינור המכיל PBS, ואז חבר את הקצה השני של מחבר היציאה למזרק. התקן את המזרק על משאבת מזרק ואת המכשיר המיקרופלואידי על מיקרוסקופ הפוך.

תמרנו ידנית את שלב המיקרוסקופ כדי לאתר את אתר ההיצרות. מלאו את ערוץ המיקרופלואיד והצינור ב-PBS באמצעות משאבת המזרק בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה. בדקו את המכשיר כדי לוודא שאין בועות אוויר סביב אתר ההיצרות.

חברו את צינור הכניסה לדגימת הדם והעבירו את הדגימה דרך תעלת המיקרופלואיד באמצעות משאבת המזרק בקצב זרימה של 0.018 מיליליטר לדקה. במיקרוסקופ הפוך, הגדר את זמן החשיפה והרווח לכל ערוץ פלואורסצנציה בתוכנה. בצע הדמיית פלואורסצנציה רב-צבעונית בזמן אמת על ידי חילופי ערוצים בין ארבעת הערוצים והפעלת פלואורו-4 אחד בכל פעם.

כוונו את מישור המיקוד לקרישת הדם והקליטו אותות פלואורסצנטיים באתר ההיצרות למשך 15 עד 30 דקות. לניתוח נתונים, פתח את קובץ הנתונים באמצעות גרסה 1.53 של ImageJ. השתמשו בערוץ C SZ 22 fit כדי לזהות את קווי המתאר של הקרישה.

לאחר מכן, באמצעות בחירות פוליגונים, בחר בערך את אזור הקרם. לכל ערוץ, יש להסיר אות רקע על ידי בחירת תמונה, בחירת Adjustment, ואז בחירת Threshold. לבסוף, מדוד את השטח ואת עוצמת האות הממוצעת בתוך הקרישה על ידי בחירת ניתוח ובחירה במדידה.

תמונות מצב מייצגות הראו קרישי דם שנוצרו בדם בריא בערוץ הסטנוטי עם טסיות, פיברינוגן, פקטור פון וילברנד ו-P-סלקטין שהודגמו באמצעות סט חיישנים 1, וטסיות, פוספטידילסרין, אינטגרין אלפא IIb בטא 3, אינטגרין אלפא IIb בטא 3 מופעל באמצעות סט חיישנים 2. תמונת ערוץ פלואורסצנציה בודד עובדה על ידי בחירת אזור הקרישה, הסרת אות הרקע ומדידת שטח האות והבהירות הממוצעת לאפשר ניתוח כמותי. ניתוח רציף של עוצמת האות הפלואורסצנטי לאורך זמן יצר עקומת אות לעומת זמן להצטברות טסיות במהלך היווצרות קרישי דם.

לכל נקודת זמן, התקבלו עוצמות אות כוללות עבור ארבעה סמנים ביולוגיים בקבוצת חיישנים אחת וארבעה ביוסמנים בקבוצת חיישנים שתיים. גודל הטרומבוס חושב ונוצר פרופיל קרישי דם שבעה-ממדיים. נכון להיום, אין ביואסאי זמין להערכת הנטייה הפרותרומבוטית של מטופלים אנושיים, ועבודתנו מנסה למלא פער זה.

על ידי זיהוי הפעילות הביומכאנית של דגימות דם, הבדיקה שלנו יכולה להעריך באופן מקיף את התכונות הפרותרומבוטיות של הנבדקים. ניתן לפתח את הבדיקה שלנו לבדיקה קלינית לזיהוי נטייה פרותרומבוטית אצל מטופלים, וניתן גם להשתמש בה לסינון תרופות אנטי-טרומבוטיות מהדור הבא.