מבחן פרופיל תרומבוס: פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה לאפיון מקיף של תרומבוגנזה ביומכנית
January 9th, 2026
עבודה זו מתארת בדיקה מיקרופלואידית המשתמשת במאמץ גזירה כדי להפעיל יצירת קרישי דם בדם ומאפיינת את הקריק באמצעות ממדים מרובים של קריאה. הבדיקה יכולה למדוד את הנטייה הפרותרומבוטית של דגימות דם, ולכן היא שימושית באבחון מחלות, גילוי תרופות, וכן במחקרים מכניים בסיסיים הקשורים לטרומבוזיס.
פיתחנו שיטה חדשה שיכולה ללכוד כראוי את התכונות הביומכניות של טרומבוזה וגם לזהות חריגות פרותרומבוטיות בבני אדם. כדי להתחיל, השתמשו בוויפר סיליקון לייצור תבנית מאסטר פוטוריזיסט SU8 באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית המבוססת על העיצוב, ומאובטחים את התבנית הראשית בתחתית צלחת פטרי באורך 15 סנטימטר באמצעות סרט. הכינו את תערובת הפולידימתילסילוקסן, או PDMS, על ידי ערבוב בסיס הפרה-פולימרי וחומר הקיבוש מערכת האלסטומר הסיליקוני ביחס משקל של 10 ל-1.
שפוך את תערובת ה-PDMS לתבנית הראשית. לאחר מכן מניחים את הצלחת המכילה תערובת ה-PDMS במייבש ואקום כדי להסיר גזים. יש לרפא תרמית את תערובת ה-PDMS על ידי הנחתה באינקובטור עם טמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
לאחר הסרת הדגימה מהאינקובטור, חתכו בזהירות את ה-PDMS המיובש מהתבנית הראשית, וחתכו את ה-PDMS המקובש ליחידות שבב נפרדות. באמצעות מחט פרוב, נקב חורים במיקומים המיועדים ליצירת הכניסה והיציאה. במכסה כימיקלים, השתמש במגבון משימה רטוב ב-75% אתנול כדי לנקות את הזכוכית ולייבש אותן.
לאחר מכן, באמצעות גנרטור בתדר גבוה, מטפלים בסליידי הזכוכית למשך 30 שניות ובשבבי ה-PDMS למשך 20 שניות. יישר כל שבב עם מחסנית זכוכית ולחץ בעדינות את השבב על משטח הזכוכית כדי לקשור אותו. עכשיו מחברים את המכשירים תרמית על ידי הכנסתם לתנור עם טמפרטורה של 150 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
לאחר ההדבקה, אחסן את המכשירים בטמפרטורת החדר בתנאים ללא אבק. לאחר מכן, באמצעות מלקחה, הסר את החלק הפלסטי של מחטי הגשוש וכופף את צינורות המתכת ל-90 מעלות כדי ליצור מחברים למכשירי מיקרופלואיד. לאחר הגדרת התגובות להצמידת פיברינוגן והנוגדנים הנדרשים עם אלקסה פלואור, צנטריפוגה את עמודות הטיהור ב-1,100 גרם למשך שתי דקות כדי להסיר את בופר האחסון.
לאחר השלכת הזרימה, טען את תמיסת התגובה על עמודת הטיהור המותקנת בבקבוק איסוף תואם ובצנטריפוגה ב-1,100 גרם למשך חמש דקות לקציר התערובת הנדרשת. באמצעות ספקטרופוטומטר, מדוד את הספיגה של החלבון ואות הצבע. חשב את ריכוז החלבון ואת היחס המולרי בין פלואורסצנציה לחלבון.
אחסן את הצבעים בארבע מעלות צלזיוס בחושך. הוסיפו הפארין לבופר הטירוד לריכוז סופי של 0.32 יחידות למיליליטר לכל 10 מיליליטר דם שיאספו, והכינו את המזרק על ידי שאיבת 500 מיקרוליטר של בופר טירוד ב-pH 7.4. לאחר איסוף הדם באמצעות ורידיות במזרק המכיל הפארין, העבר אותו לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר ושמור על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
דילל מונומר פקטור פון וילברנד לשני מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS. ציפו מראש את מכשירי המיקרופלואיד במונומבר מדולל של פקטור פון וילברנד ודגרו אותם במשך שעה בטמפרטורת החדר. עכשיו דגרו את דגימת הדם עם חיישן פלואורסצנטי 1 או הגדר 2 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, חבר מכשיר מיקרופלואידי עם מחברי כניסה ויציאה וצינורות. חבר את הקצה השני של מחבר הכניסה לצינור המכיל PBS, ואז חבר את הקצה השני של מחבר היציאה למזרק. התקן את המזרק על משאבת מזרק ואת המכשיר המיקרופלואידי על מיקרוסקופ הפוך.
תמרנו ידנית את שלב המיקרוסקופ כדי לאתר את אתר ההיצרות. מלאו את ערוץ המיקרופלואיד והצינור ב-PBS באמצעות משאבת המזרק בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה. בדקו את המכשיר כדי לוודא שאין בועות אוויר סביב אתר ההיצרות.
חברו את צינור הכניסה לדגימת הדם והעבירו את הדגימה דרך תעלת המיקרופלואיד באמצעות משאבת המזרק בקצב זרימה של 0.018 מיליליטר לדקה. במיקרוסקופ הפוך, הגדר את זמן החשיפה והרווח לכל ערוץ פלואורסצנציה בתוכנה. בצע הדמיית פלואורסצנציה רב-צבעונית בזמן אמת על ידי חילופי ערוצים בין ארבעת הערוצים והפעלת פלואורו-4 אחד בכל פעם.
כוונו את מישור המיקוד לקרישת הדם והקליטו אותות פלואורסצנטיים באתר ההיצרות למשך 15 עד 30 דקות. לניתוח נתונים, פתח את קובץ הנתונים באמצעות גרסה 1.53 של ImageJ. השתמשו בערוץ C SZ 22 fit כדי לזהות את קווי המתאר של הקרישה.
לאחר מכן, באמצעות בחירות פוליגונים, בחר בערך את אזור הקרם. לכל ערוץ, יש להסיר אות רקע על ידי בחירת תמונה, בחירת Adjustment, ואז בחירת Threshold. לבסוף, מדוד את השטח ואת עוצמת האות הממוצעת בתוך הקרישה על ידי בחירת ניתוח ובחירה במדידה.
תמונות מצב מייצגות הראו קרישי דם שנוצרו בדם בריא בערוץ הסטנוטי עם טסיות, פיברינוגן, פקטור פון וילברנד ו-P-סלקטין שהודגמו באמצעות סט חיישנים 1, וטסיות, פוספטידילסרין, אינטגרין אלפא IIb בטא 3, אינטגרין אלפא IIb בטא 3 מופעל באמצעות סט חיישנים 2. תמונת ערוץ פלואורסצנציה בודד עובדה על ידי בחירת אזור הקרישה, הסרת אות הרקע ומדידת שטח האות והבהירות הממוצעת לאפשר ניתוח כמותי. ניתוח רציף של עוצמת האות הפלואורסצנטי לאורך זמן יצר עקומת אות לעומת זמן להצטברות טסיות במהלך היווצרות קרישי דם.
לכל נקודת זמן, התקבלו עוצמות אות כוללות עבור ארבעה סמנים ביולוגיים בקבוצת חיישנים אחת וארבעה ביוסמנים בקבוצת חיישנים שתיים. גודל הטרומבוס חושב ונוצר פרופיל קרישי דם שבעה-ממדיים. נכון להיום, אין ביואסאי זמין להערכת הנטייה הפרותרומבוטית של מטופלים אנושיים, ועבודתנו מנסה למלא פער זה.
על ידי זיהוי הפעילות הביומכאנית של דגימות דם, הבדיקה שלנו יכולה להעריך באופן מקיף את התכונות הפרותרומבוטיות של הנבדקים. ניתן לפתח את הבדיקה שלנו לבדיקה קלינית לזיהוי נטייה פרותרומבוטית אצל מטופלים, וניתן גם להשתמש בה לסינון תרופות אנטי-טרומבוטיות מהדור הבא.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a novel thrombus profiling assay that integrates microfluidics with multi-color fluorescence imaging to comprehensively characterize biomechanical thrombogenesis. The method enables detailed analysis of thrombus formation under arterial shear conditions, providing seven distinct readouts related to thrombus size, composition, and platelet activation. This assay addresses the need for a robust bioassay to evaluate prothrombotic tendencies in humans and assess the efficacy of anti-thrombotic agents.
Key Study Components
Area of Science
- Hematology
- Bioengineering
- Microfluidics
- Thrombosis research
Background
- Thrombosis involves abnormal accumulation of platelets and clotting factors in blood vessels.
- Arterial thrombosis is often linked to elevated shear stress due to arterial stenosis.
- Biomechanical factors, such as blood flow, play a critical role in thrombus formation.
- Existing assays have not fully captured the biomechanical aspects of thrombogenesis.
Purpose of Study
- To develop an assay that profiles biomechanical thrombogenesis in detail.
- To enable comprehensive evaluation of prothrombotic tendencies in human blood samples.
- To provide a platform for testing anti-thrombotic agents and understanding arterial thrombosis mechanisms.
Methods Used
- Fabrication of microfluidic devices using PDMS and photolithography.
- Surface coating of microchannels with von Willebrand factor.
- Perfusion of heparinized human blood labeled with fluorescent biomarkers through stenotic microchannels.
- Real-time multi-color fluorescence imaging to monitor thrombus formation at the site of stenosis.
- Quantitative image analysis using ImageJ to measure thrombus area, biomarker signal intensity, and generate seven-dimensional thrombus profiles.
Main Results
- The assay successfully visualized and quantified thrombus formation under biomechanical (shear) conditions.
- Seven key parameters, including thrombus size and multiple biomarker signals, were measured simultaneously.
- Distinct profiles were generated for platelet accumulation, fibrinogen, von Willebrand factor, P-selectin, phosphatidylserine, and integrin activation.
- The method enabled continuous monitoring and quantitative analysis of thrombus development over time.
Conclusions
- This thrombus profiling assay fills a critical gap in evaluating biomechanical thrombogenesis.
- It offers a comprehensive tool for assessing prothrombotic risk and screening anti-thrombotic drugs.
- The approach can be further developed for clinical diagnostics and mechanistic studies of arterial thrombosis.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Biomechanical thrombogenesis presents a critical challenge in cardiovascular drug discovery, as traditional assays often fail to capture the complexity of thrombus formation under arterial shear conditions. The microfluidics-based thrombus profiling assay enables comprehensive, quantitative characterization of thrombus size, composition, and platelet activation, directly supporting predictive confidence in early-stage anti-thrombotic agent evaluation. This platform advances portfolio decision-making by providing mechanistic insights and robust risk assessment for candidate therapies targeting arterial thrombosis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of biomechanical pathways driving arterial thrombosis.
- Supports functional validation of targets involved in platelet activation and aggregation.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying multiple thrombus biomarkers simultaneously.
- Improves predictive confidence for triaging anti-thrombotic candidates.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microfluidic systems for high-content screening of anti-thrombotic compounds.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative multi-parametric readouts.
- Enables scalable, platform-based evaluation of compound efficacy under physiologically relevant shear conditions.
- Supports reliable comparison of compound effects on thrombus formation and biomarker expression.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro thrombus formation with disease-relevant arterial shear profiles.
- Provides translational biomarker data for continuity from discovery to preclinical validation.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on comprehensive thrombus profiling.
- Supports mechanistic studies of arterial thrombosis relevant to human pathology.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational biomarker validation for anti-thrombotic drug development.
- Discovery Biology: Quantifies biomechanical triggers and pathways of thrombogenesis for hypothesis testing and biological de-risking.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in a physiologically relevant context.
- Analytics: Generates seven-dimensional thrombus profiles, enabling robust statistical comparison across conditions and compounds.
- Translational Research: Aligns in vitro findings with disease-relevant arterial thrombosis mechanisms for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microfluidic and imaging platform adaptable to diverse anti-thrombotic R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anti-thrombotic target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales multi-parametric thrombus analysis for cross-program comparability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of anti-thrombotic candidates based on comprehensive mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence imaging, and quantitative image analysis.
- Demands access to specialized instrumentation, including microfabrication and multi-channel fluorescence microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- May require adaptation for different blood sources or disease models to ensure translational relevance.
- Dependent on robust statistical analysis to interpret multi-dimensional thrombus profiles.
