מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

המטרה הכוללת של ניסוי מיקרופלואידי זה היא למדוד בו זמנית שקיעת טסיות דם בהיווצרות פיברין על משטח תגובתי בתנאי זרימה באמצעות מיקרוסקופ וידאו בזמן אמת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום רפואת עירוי לגבי ההשפעות של הכנת תרכיז טסיות על האופי הקרישי של דם מועבר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת ניתוח בו זמנית של תפקוד טסיות הדם והקרישה בזרימה, ומאפשרת לבחון את יחסי הגומלין בין שני התהליכים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי קרישת טסיות הדם המושרה במסלול מגע, ניתן ליישם אותה גם לחקר המסלול החיצוני על ידי ציפוי בגורם רקמה שומנית. מי שתדגים את ההליך תהיה רוזלי דבלו, טכנאית מהמעבדה. התחל את הגדרת תא הזרימה של מיקרופלואידיקה על ידי פיפטינג של 0.8 מיקרוליטר של קולגן טרי משוחזר לחמש שישיות מאורך כל תעלה בקצה אחד של שבב מיקרופלואידית חד פעמי חדש עם שמונה תעלות מקבילות ישרות ותיוג קצה זה של השבב כשקע.

דגרו את השבב הביולוגי בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות בכלי לח ואטום. בתום הדגירה, מלאו את התעלות המקודדות במספר שווה של תעלות בצורת Y בשבב ערבוב עם מאגר חוסם. מחזירים את השבב למיכל למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הנח סיכה בקצה אחד של שניים באורך שמונה סנטימטרים וחתיכות צינור באורך אחד ושני סנטימטרים ובשני הקצוות של חתיכת צינור אחת באורך 46 ס"מ עבור כל תעלה בשימוש. לאחר מכן, השתמש בתוכנת Nanopump כדי לשטוף את כל נוזלי המשאבה בצינור המחובר במים מזוקקים ומזרק בסיכת מחבר המזרק כדי למלא את כל שאר הצינורות במאגר חוסם. לאחר מכן, תקן את השבב המקודד על שלב המיקרוסקופ האוטומטי באמצעות שקע מספריים במעבדה כדי לתקן את השבב המערבב באותו גובה כמו שלב המיקרוסקופ.

השתמש בסיכות בצינורות שמונה סנטימטר כדי לקבע את חלקי הצינורות הללו לכניסת השבב המערבב ולהכניס את הקצה החופשי של כל צינור לבקבוקון של מי מלח חוצץ HEPES. כעת, חבר את השבב הביולוגי המקודד לשבב הערבוב עם חתיכת הצינור של 46 סנטימטר בקו גמיש, אך ישר. חבר סיכת מחבר מזרק לצינור התואם לאור של משאבת השטיפה.

לאחר מכן, חבר את הסיכה לקצה החופשי של חתיכת הצינור בשני סנטימטרים וקבע את הקצה השני של הצינור לשקע השבב המקודד. לאחר מכן, שטפו את כל הצינורות והתעלות עם מיליליטר אחד של HBS. כדי להכין את משאבות הזילוף, פתח את תוכנת Microfluidic Perfusion Pump Driver ולחץ פעמיים על סמל המזרקים כדי לאתחל את המשאבות.

בחר את סוג המזרק שישמש ונתק את משאבת השטיפה ואת צינורות שני הסנטימטרים המחוברים אליה. חבר את הצינור המנותק של שני סנטימטרים עם סיכת מחבר המזרק שלו למנעול האור של חתיכת צינור פסולת עבה דופן והשתמש במזרק כדי למלא את הצינור בעל הקירות העבים בתמיסת פפסין סטנדרטית. לאחר מכן, אבטח את הקצה הפתוח של הצינור בעל הקירות העבים בעזרת מהדק קוצ'ר.

הצמד את הצינור לשקע השבב המקודד. נתק את שני הצינורות מתא זרימת הערבוב יחד והשליך את מיכלי HBS. לאחר השגת דגימת הדם במיכלי נתרן ציטראט מפונים, צנטריפוגה את הצינורות והעבירו את הפלזמה העשירה בטסיות לצינור צנטריפוגה חדש.

סובב שוב את המיכלים עם פלזמה עשירה בטסיות. לאחר מכן, העבירו את הפלזמה הדלה בטסיות הדם לצינור צנטריפוגה אחר. לאחר מכן, השתמש במחט בגודל 21 כדי לנקב את החלק התחתון של מיכלי הנתרן ציטראט כדי לאפשר לתאי הדם האדומים הארוזים לטפטף לתוך צינור חרוטי חדש.

לאחר איסוף כל תאי הדם האדומים הארוזים, יש להרכיב מחדש בעדינות את הדם על ידי שילוב של תאי דם אדומים ארוזים מופרדים עם פלזמה דלה בטסיות ולהוסיף טסיות דם שהוכנו לעירוי כדי לקבל דגימות עם ריכוז המטוקריט של 40% ו-2.5 פעמים 10 לחמישית טסיות דם למיקרוליטר לנפח סופי של 2.5 מיליליטר ולקבל ספירת דם מלאה. לאחר מכן, הוסף 13 מיקרוליטר של פיברינוגן עם תווית פלואורופור לצינור חרוטי מפוליסטירן. ואחריו מיליליטר אחד של הדם המחודש.

מערבבים עוד מיליליטר אחד של דם עם שני מיקרוליטרים של צבע טסיות פלואורסצנטי ומוסיפים יחד את דגימות הדם המסומנות יחד. לאחר מכן, הפוך בעדינות את דגימות הדם המעורבות ודגר את התאים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לפני תחילת בדיקת הזילוף, מקד את אופטיקת המיקרוסקופ לסיבי הקולגן המודבקים לתחתית התעלה הראשונה.

באמצעות תוכנת הרכישה, הגדר אזור עניין בערוץ הנבחר. טען מיליליטר אחד של מאגר קרישה שחומם מראש למזרק של מיליליטר אחד והתקן את המזרק על משאבת הזילוף. לאחר היפוך עדין שני, טען את הדם למזרק של שני מיליליטר והתקן את המזרק על משאבת הזילוף.

לאחר מכן, השתמש בסיכת מחבר מזרק כדי לחבר את שני המזרקים לחתיכה אחת של צינור שמונה סנטימטר ולהפעיל את המחברים והצינורות ב-400 מיקרוליטר לדקה. כאשר כל הצינורות מלאים במאגר קרישה או בדם, הצמד את הקצה השני של שני הצינורות לרגליים המפוצלות של התעלה בצורת Y בשבב הערבוב. לאחר מכן, הסר את מהדק קוצ'ר ביציאת צינור הפסולת והתחל את הזלוף במהירות של 4.4 מיקרוליטר לדקה עבור מאגר הקרישה ו-44 מיקרוליטר לדקה עבור הדם המחודש.

הקלט תמונות כל 10 שניות למשך 30 דקות בזמן אמת, וסיים את המשאבות ורכישת התמונות לאחר 30 דקות או כאשר האות הופך לרווי. לאחר מכן, השליכו את כל הצינורות והמזרקים כפסולת מסוכנת ביולוגית. סרטון זה מספק דוגמה מצוינת להצטברות פקקת טסיות דם ושקיעת פיברין.

בתחילת הזלוף, הטסיות נדבקו למשטח הריאקטיבי, וכתוצאה מכך עלייה מתמדת בפלואורסצנטיות הירוקה שנרשמה. במהלך שלב ההדבקה הזה, יש מעט פלואורסצנטיות סגולה המצביעה על כך שהפיברין נוצר רק בשוליים. עם תחילת הקרישה, הפיברין הפלואורסצנטי האלים משקע במהירות כאשר הקרינה הירוקה של הטסיות מצטברת בערך באותו קצב.

לכן ניתן להסיק רגע של תחילת קרישה כגורם מכריע של פוטנציאל הקרישה של טסיות הדם. תוספת של מעכב טריפסין תירס לדם המחודש אינה משפיעה על הידבקות טסיות הדם, אך הקרישה אינה מתחילה למשך כל ניסוי הזלוף. על ידי הגדלת מספר הטסיות בדגימה משוחזרת, קצב ההדבקה, ההצטברות והקרישה עולה באופן ליניארי.

רגע ההופעה מתקצר משמעותית על ידי הגדלת ריכוז הטסיות, מה שמרמז על כך שנדרש מספר סף של טסיות מופעלות כדי לעורר קרישה. יתר על כן, בניתוח זוגי של תעלות המצופות בקולגן בלבד, או בשילוב עם גורם רקמה שומני רקומביננטי, הופעת הקרישה מהירה משמעותית, אם כי לא הקצב הכולל של הקרישה, ולא הצטברות טסיות הדם, שונים בין התנאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניסוי בתא זרימה מיקרופלואידית עם דם משוחזר בעל תווית כפולה לניתוח בו זמנית של תפקוד טסיות הדם והקרישה.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום רפואת עירוי לחקור את האינטראקציות בין טסיות דם וקרישה תחת זרימה. בסרטון זה, התמקדנו בהדגמת ניסוי סטנדרטי. אך ניתן להכניס שינויים בציפוי פני השטח, מתחי המגן או ריכוז הסידן כדי לענות על שאלות מחקר ספציפיות מעניינות.