Name: Microfluidic זרימה ציימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: למדו שימוש בלחדרי זרימה מיקרו-נוזליים עם דם מחודש לבחינת תפקוד טסיות מאוחסנות ומנגנוני המוסטאסיס על קולגן במבחנה. שיטה זו מאפשרת הערכת איכות מרכזי טסיות לטיפול בטרומבוציטופניה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למחברים אין אישורים.

פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות אתיות המוסדיות למחקר על דגימות אנושיות והסכמתם התקבלה מכל התורמים מעורבים. אישור הניסויים שתוארו כאן הושג מלוח הסקירה המוסדי של בית החולים האוניברסיטאי אנטוורפן. הערה: סימנים טמפרטורה הם תמיד בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין. 1. הגדרה קאמרית הכנת תזרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lanes הכנה, Tubing סיכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס ההשעיה קולגן במרץ לדלל 1/20 בפתרון גלוקוז איזוטוני שקיבלת מספק לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. הערה: אנו משתמשים קולגן גיד סוסים, בעיקר מורכבים מסוג I סיבים. אני קולגן מסוג הסוס הוא המכונה לעתים קרובות כמו &quot;הורם&quot; קולגן הוא תקן הזהב עבור סוג זה של assay 9 הם הסטוריות כמו גם סיבות ביולוגיות. סוג האדם III קולגן יכול לשמש גם, אבל הדואר הסיבים מעיל פחות טוב והתגובה טסיות אינה כה חזקה. משטחים ציפוי אחר יכול לשמש גם, למשל פון Willebrand Factor (VWF), פיברינוגן, פיברונקטין, laminin, vitronectin, thrombospondin-1 או שילובים של אלה 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח biochip הפנויה חדשה מהמכל של הספק. מידות biochips כאן הם השתמשו 0.4W x 0.1H 20L x במ&quot;מ 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 0.8 μl לנתיב (ים) של biochip microfluidic על קצה אחד של השבב ולסמן כמו לשקע. ודא כי השביל מלא 5/6 עם קולגן המכיל פתרון ציפוי ערוך 1.1.1. ודא שאין בועות אוויר. הערה: ערוצים הם מצופים חלקית כדי למנוע הצטברות של סיבי קולגן בכניסה של הערוץ (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות או לילה במכל humidified והסגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את ערוצי מצופה ידי pipetting חסימת חיץ (1.0% (w / v) בסרום שור אלבומיןד 0.1% (w / v) גלוקוז 10 מ&quot;מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) שנאגרו מלוחים (HBS; 0.9% (w / v) NaCl, pH 7.4) בקצה השני ומארק כמו מפרצון. ודא כי השביל מלא לחלוטין עם למאגר חסימת הימנעות בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים צינורות באריכות שווה (12 ס&quot;מ). השתמש באחת לכל ליין ולהתחבר כל צינורות עם סיכה. לדוגמא, ניסוי השוואת שני תנאים, לרוץ בשני עותקים ידרוש מארבע רצועות צינורות וארבע סיכות כדי להיות מוכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את צינורות עם מים מזוקקים באמצעות מזרק ומחט G 26 או המחברים המצורפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את הצינורות עם חסימת חיץ. חנות במיכל סגור humidified למשך תקופה מינימלית של 1 שעה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שאיבת יריעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המשאבה ואת סעפת עם מים מזוקקים, להסיר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב למאגר החסימה לרדת מנתיב biochip (ים) באמצעות קצה 10 μl קבועים במוצא. נקה את פני השטח שלbiochip עם אבק דיוק חינם לנגב ואלכוהול מפוגל טכנולוגיה להסרת טביעות ואבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את biochip על במת מיקרוסקופ אוטומטית. אם יותר נתיב אחד משמש בו זמנית בטווח אחד, לחבר את מפצל סעפת שמונה נתיבים לשקע biochip. הערה: מפצל שמונת נתיבי הסעפת הוא חתיכת החומרה (איור S1) מחובר למשאבה ואת biochip. היא מאפשרת הפעלת כל הכניסה (שמונה) הנתיבים על biochip או שילוב של נתיבים אשר יכול להיות מוגדר מפעיל התוכנה הנלווית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סיכות בצינור כדי לתקן אותם כניסת biochip. מניחים את הקצה השני של הצינור (ללא פינים) במבחנה חרוטי 1.5 מ&quot;ל מלא HBS. יש לשטוף את כל צינורות נתיבי המחוברים שלהם עם 1 מיליליטר HBS באמצעות המשאבה, כדי להסיר שארית חיץ חסימה גרועה דבקה קולגן. </li></ol></li></ol> 2. הכנת דגימות דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף והפרדהדם מלא טרי מן מתנדב בריא. 17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את מיליליטר דם הראשון בצינור פוניו המכיל חומצת Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) כפי קרישה ובאופן בלעדי להשתמש מדגם זה עבור ספירת דם מלאה (CBC) עם נתח המטולוגיה אוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף נפח של דם בתוך קרישה מתאימה באמצעות צינורות פונו. תרופות נגד קרישת דם סטנדרט לניסויי תא זרימה הם הפרין או הירודין כאשר הפיברין היווצרות אינו חלק מפרוטוקול הניסוי ו נתרן ציטרט כאשר הוא. הערה: הפרין שמש נוגד קרישה לכל הניסויים שתוארו בתוצאות. הערה: כמות הדם תלויה במספר ניסויים להתבצע. כ 1 צינור (7 מ&quot;ל) במשך 3 נתיבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצינורות על כינון מחדש דם ממתינים מסובב. הערה: assay אמור להסתיים בתוך 3 שעות של phlebotomy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 250 גרם להכין פלזמה עשירה בטסיות (PRP). אין להשתמש ההפסקה צנטריפוגות כדי למנוע הפרעה של הגלולה הארוזה בצורה רופפת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר יותר מ צינור אחד נאסף, לרכז את הדם בתוך שפופרת צנטריפוגה חרוטי יחיד. הערה: צנטריפוגה יכול להיעשות לאט יותר או פחות זמן, בהתאם לתשואות PRP ו דיפרנציאלי תא &quot;זיהום&quot; עדיף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר וזורק את PRP ומעייל באפי מניב תאי דם אדומים ארוזים עם כמה טסיות. הערה: ספירת הטסיות בשבריר התא האדום הארוז היא 13 ± 5 x 10 3 לכל μl (ממוצע ± סטיית התקן, n = 12) בממוצע בידינו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כינון דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצת דם ההפשרה AB (רזוס D שלילי) פלזמה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו -20 שניות לעמוד 4 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ההמטוקריט של כדוריות הדם האדומות הארוזות ערוכות 2.1.5 באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של טסיות דם בבנק הדם מוכן tha תרכיז הטסיותt ישמש כדי לשקם את שבר התא האדום לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את נפח תאי הדם האדומים ארוז ותרכיז טסיות שיניבו 40 המטוקריט% ו -250 x 10³ טסיות / μl במדגם 1 מ&quot;ל. הערה: כותרות יעד אחרות של תאים ניתן להגדיר באופן שרירותי, בהתאם לפרוטוקול המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ארוז כדוריות דם אדומות ופלזמה לתוך צינור טרי באמצעות קצה pipet מקוטע ולהוסיף תרכיז הטסיות עד נפח דגימה של 1 מיליליטר הוא הגיע. הערה: בהתאם המשתנים שנבחנו, חלק פלזמה צריך להיות שווה בכל דגימות מחדש כי יש פלזמה השפעה משמעותית על קצב היווצרות פקיק. למשל, חזר הפשרה הקפאה או פלזמה שנלקחו מתורמים שונים או על תרופות נגד קרישת דם שונים עשויים להשפיע על התוצאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הדם מחדש בעדינות על ידי היפוך ולבצע CBC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מדגם שליטה &quot;ריק&quot;, שבו היקף חלק טסיות מוחלףעל ידי אותו נפח של 0.9% (m / v) נתרן כלורי במים כדי לקבוע את הריכוז של טסיות אנדוגני (כלומר טסיות בנקאית בלתי דם) בדם מחדש באמצעות CBC. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תִיוּג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 1 מ&quot;ל מחדש דם במבחנה המכילה 1 μl 5 מ&quot;מ Calcein AM (5 מיקרומטר הריכוז הסופי). הערה: צבעי תאים אחרים יכולים לשמש 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. </li></ol></li></ol> 3. Assay זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס האובייקטיבי על סיבי הקולגן הדבקים בתחתית הנתיבים. באופן אידיאלי, להשתמש שלב בניגוד או התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) הגדרות עבור האסטרטגיה מתמקד הפעם. בחר &#39;גדר Z הנוכחי עבור אזורי אריח נבחרים&#39; בתוכנת הניסוי כדי לתקן את העמדות-Z שנבחרו באופן דיגיטלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור של עניין (ROI) בנתיב (XY) בתוכנת הניסוי של מ &#39;icroscope שיירשמו במהלך הניסוי. הערה: ROI יכול להיות כל שטח הפנים נבחר באופן שרירותי בתוך סמטה זלוף. רצוי לא לנתח היווצרות פקיק קרוב in- ו לשקע של נתיב כך כדי למנוע תופעות לוואי של פרופיל הזרימה משתנה באזור זה, גם אם זה קטן יחסית. שטח הפנים ROI צריך להכיל מספר לא מבוטל של טסיות או thrombi לאפשר פילוס של האות. בפרוטוקול זה ההחזר על ההשקעה הוא המצרפי תפור דיגיטלית של שלוש תמונות שוות בגודלן Side-by-side וכתוצאה מכך 0.62 מ&quot;מ 2 באמצע השביל 2 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את הדגימות בעדינות על ידי היפוך ולמקם הבאים אלה אל biochip על הבמה האוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצינורות שמחוברים כשהמפרצון של biochip ב המבחנות המכילות דגימות הדם מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת סנטימטר / 50 דיין 2 (או מדגיש גזירה אחר כרצונך) לערוצים צמודים בקבוקוניםהמכיל את דגימות הדם מחדש באמצעות התוכנה של המשאבה. הערה: מאמצי גזירה אחרים יכולים לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות שיא כל 15 שניות למשך 5 דקות בזמן אמת באמצעות תוכנת הרכישה ולהתנסות של המיקרוסקופ. הערה: סדרות עתיות אחרות יכולות לשמש תלוי ניסוי ההגדרה. הערה: אנו משתמשים בדרך כלל בהגדלת 100X (אובייקטיבי 10X ו 10X עדשות), אך גבוהה (או נמוכה) גדלה יכולה לשמש בקלות כחלופה. </li></ol> 4. יש לשטוף היטב את <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף היטב את כל הצינורות מחוברים לשקע ומחובר הסעפת הרבה או משאבת שימוש במים מזוקקים, ואחריו חומצת נתרן (אקונומיקה) 0.5% (v / v) ולבסוף 0.1 M NaOH במים. מחק את הצינורות מוצמדים כניסת biochip כפסולת מסוכנת. </li></ol> ניתוח 5. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע קינטיקה צמיחה פקיק עם תוכנת ניתוח התמונה. הפקודות הבאות הן ספציפיות עבור ZEN2012. <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את ניתוח תמונת תוסף כדי לקבוע את כיסוי השטח של טסיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את סף הקרינה על כרטיסיית ניתוח אינטראקטיבית כדי להגדיר את עוצמת פיקסל כי בקורלציה עם איתות חיובית, כלומר טסיות דבקה או טסיות דבקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צור שולחנות ליצור גיליון אלקטרוני באופן אוטומטי שיכיל את פני שטחים הנפרדים (ב מיקרומטר 2) של אלה &quot;אובייקטים&quot; המכילים פיקסלים עם אות בין הספים שנבחרו. זה מבוצע עבור כל נקודת זמן. הערה: לאחר ספי קרינה כבר בחרו, תוכנת הניתוח מזהה אוטומטית &#39;חפצים&#39; בשדה הנוף אשר עונים על הקריטריונים. אובייקטים אלה הם thrombi, אגרגטים טסיות קטנים או טסיות אחת ולכסות מספר פיקסלים. כל אובייקט מופיע בגיליון האלקטרוני בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור לגיליונות אלו בפורמט XML ולפתוח אותם בתוכנית גיליון אלקטרוניעבור חישובים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחומים סה&quot;כ השטח של האובייקטים שנבחרו על ידי סיכום ולחלק את התוצאה על ידי השטח הכולל של השדה המדיד (מיקרומטר 2). זה יניב את כיסוי שטח היחסי (%). האם כך עבור כל נקודת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש כיסויי משטח אלה בתפקוד של זמן זלוף לחשב את השיפוע על ידי רגרסיה ליניארית, מניב את הקינטית הצמיחה פקיק של מצב מסוים. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+at+work+in+primary+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Platelets at work in primary hemostasis.</a> Blood Rev. 25, 155-167 (2011).</li>
<li>Stalker, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+in+the+hemostatic+response+and+its+relationship+to+the+platelet-signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network.</a> Blood. 121, 1875-1885 (2013).</li>
<li>Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+platelet+adhesion+to+artery+subendothelium+is+mediated+by+factor+VIII-Von+Willebrand+factor+bound+to+the+subendothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium.</a> Nature. 279, 636-638 (1979).</li>
<li>Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+platelet+adhesion+by+arrest+onto+fibrinogen+or+translocation+on+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor.</a> Cell. 84, 289-297 (1996).</li>
<li>Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+in+vitro+thrombus+formation+with+novel+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices.</a> Platelets. 23, 501-509 (2012).</li>
<li>Varga-Szabo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium+sensor+STIM1+is+an+essential+mediator+of+arterial+thrombosis+and+ischemic+brain+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction.</a> J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).</li>
<li>Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+geometries+exacerbate+pathological+thrombus+formation+poststenosis+in+a+von+Willebrand+factor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner.</a> Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).</li>
<li>Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hemostasis+in+flowing+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hemostasis in flowing blood.</a> Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).</li>
<li>Roest, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chamber-based+assays+to+measure+thrombus+formation+in+vitro%3A+requirements+for+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization.</a> J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).</li>
<li>Heemskerk, J. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+surfaces+to+measure+thrombus+formation+under+flow%3A+possibilities+for+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization.</a> J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).</li>
<li>Shrivastava, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+platelet+storage+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Apher+Sci%22%5BJournal%5D)">The platelet storage lesion.</a> Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).</li>
<li>Miyaji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+platelet+aggregation+of+platelet+concentrate+during+storage+recovers+in+the+body+after+transfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion.</a> Transfusion. 44, 891-899 (2004).</li>
<li>Goodrich, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+in+vitro+platelet+quality+measurements+with+in+vivo+platelet+viability+in+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects.</a> Vox Sang. 90, 279-285 (2006).</li>
<li>Van Aelst, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboflavin+and+amotosalen+photochemical+treatments+of+platelet+concentrates+reduce+thrombus+formation+kinetics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro.</a> Vox Sang. 108, 328-339 (2015).</li>
<li>Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+c+light+pathogen+inactivation+treatment+of+platelet+concentrates+preserves+integrin+activation+but+affects+thrombus+formation+kinetics+on+collagen+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro.</a> Transfusion. , (2015).</li>
<li>de Witt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+platelet+function+defects+by+multi-parameter+assessment+of+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation.</a> Nat Commun. 5, 4257(2014).</li>
<li>Cazenave, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+washed+platelet+suspensions+from+human+and+rodent+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood.</a> Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).</li>
<li>Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+platelet+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Dynamics of platelet thrombus formation.</a> J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).</li>
<li>Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+randomized+trial+of+a+prophylactic+platelet+transfusion+trigger+of+10+x+10%289%29+per+L+versus+30+x+10%289%29+per+L+in+allogeneic+hematopoietic+progenitor+cell+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients.</a> Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).</li>
<li>Neeves, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+variability+in+platelet+accumulation+on+type+1+fibrillar+collagen+in+microfluidic+flow+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one+%22%5BJournal%5D)">Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays.</a> PloS one . 8, e54680(2013).</li>
<li>Born, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+blood+platelets+by+adenosine+diphosphate+and+its+reversal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal.</a> Nature. 194, 927-929 (1962).</li>
<li>Cattaneo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+Standardization+of+Light+Transmission+Aggregometry%3A+A+Consensus+of+the+Working+Party+from+the+Platelet+Physiology+Subcommittee+of+SSC%2FISTH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH.</a> J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).</li>
<li>Deckmyn, H., Feys, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+quality+control+of+platelets+for+transfusion%5BTitle%5D)+AND+%22ISBT+Sci+Series%22%5BJournal%5D)">Assays for quality control of platelets for transfusion.</a> ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).</li>
<li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoagulants+%28thrombin+inhibitors%29+and+aspirin+synergize+with+P2Y12+receptor+antagonism+in+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis.</a> Circulation. 108, 2697-2703 (2003).</li>
<li>Casari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+Willebrand+factor+mutation+promotes+thrombocytopathy+by+inhibiting+integrin+alphaIIbbeta3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3.</a> J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).</li>
<li>Gitz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+platelet+survival+after+cold+storage+by+prevention+of+Glycoprotein+Ib%CE%B1+clustering+in+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts.</a> Haematologica. , (2012).</li>
<li>Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Quality+Testing+of+Blood+Platelet+Transfusions+with+Dynamic+Light+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Part+Syst+Char%22%5BJournal%5D)">Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering.</a> Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).</li>
<li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers+-+a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide.</a> Platelets. 23, 229-242 (2012).</li>
<li>Zwaginga, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-based+assays+for+global+assessment+of+hemostasis.+Part+2%3A+current+methods+and+considerations+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future.</a> J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).</li>
<li>Zwaginga, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-based+assays+for+global+assessment+of+hemostasis.+Part+1%3A+Biorheologic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations.</a> J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ניסויי תא זרימת microfluidic הם כלים מצוינים כדי לחקור את תפקוד הטסיות ב זורם דם משמשים כדי להעריך המוסטאסיס במבחנה בהקשרי ניסיוני. למרות סטנדרטיזציה עני מעבדתיות 9, אנו מראים כי בתוך המעבדה שלנו וריאצית ניסיוני מקובל. זה מאפשר להשוות באופן מהימן (זיווג) דגימות בתוך מחקר נתון. זו קבלה תוקף באמצעות התופעה מתועדת היטב של נגע אחסון טסיות, וזאת כפועל יוצא מזיק של אחסון טסיות בתנאי בנק דם 11. יתר על כן, פרסמנו את ההשפעה לאחרונה של שלוש טכנולוגיות איון הפת...

המוסטאסיס מחייב פעילות המשולבת ומוסדר של תאים, חלבונים, יונים ורקמות בהקשר spatiotemporal הוגבל 1. פעילות מבוקרת עלולה להוביל לדימום או פקקת ותחלואה או תמותה בתוך הספקטרום של הפרעות הקשורות לקרישת דם. ניסוי תא זרימת microfluidic הוא טכניקה מאתגרת מחקה המוסטאסיס במבחנה. גישה זו מאפשרת חקירה של יחסי הגומלין המורכבים של תהליכים להשתתף המוסטאסיס עם תפקיד מוביל עבור טסיות דם. בעקבות פציעה של כלי דם, טסיות לדבוק מטריקס subendothelial החשוף (glyco) חלבונים על מנת למנוע אובדן דם. בעקבות הידבקות, טסיות להפעיל המצרפי בתגובה אוטומטית ואיתות paracrine אשר בסופו של דבר מוביל להיווצרות של רשת טסיות, על מנת לייצב את הפיברין וכתוצאה מכך משרד, פצע איטום פקיק 2. בניגוד לרוב בדיקות תפקוד טסיות אחרות, התנסותמפעלים עם תאי זרימה לקחת בחשבון את הפרמטר הפיזי של זרימת הדם ולכן השפעת rheology על תאים המשתתפים ביומולקולות 3,4. ניסויי תא זרימה יצרו תובנות ציון דרך המוסטאסיס ופקק על ידי שינוי פרמטרים מרכזיים משפיעים (תת) עוצר דמום תהליכים, כולל מטריצה ​​הדבקה, פרופילי rheology וזרימה, הרכב הסלולר, הנוכחות של רעלים או סמים, כוח יוני ועוד רבים. בשני העשורים האחרונים, ניסויי תא זרימה נמוכה תפוקה מחייבת כרכי מדגם גדולים (10-100 מיליליטר) התפתחו תאי microfluidic לעתים קרובות מורכב של תאי לוחות מקבילים קטנים וכוללים טכנולוגיה מודרנית עבור מרוססת דם מלא בתנאי גזירת קיר מבוקרים 5. Microscaling גדל באופן משמעותי את תפוקת assay בעיקר מפני התקנת החומרה פשטה ופחות נפח (דם) נדרש, טיוח הניסוי לנגיש יותר versatile. למשל, דם בחיות מעבדה קטנות כעת ניתן להשתמש ללא צורך להקריב בעלי חיים. דגימות דם של עכברים מהונדסים גנטית ובכך סייעו בזיהוי מולקולות מפתח קידום או עיכוב המוסטאסיס וב תובנות בסיסיות רומן 6. מעבדות מחקר מיוחדים לעתים קרובות עדיין להשתמש בתאי לזרום בהתאמה אישית למשל מ polydimethylsiloxane (PDMS) 7 כי polymerizes על תבניות lithographed אשר ניתן blueprinted ידי התוכנה. התא וכתוצאה מכך הוא זול, חד פעמי יכול להיות מפורקים בקלות לניתוח פוסט הוק. יתר על כן, בעצם כל עיצוב של כלי, bifurcations כולל או פניות חדות יכול להיבנות על פי פקודה. יתרון זה הוא גם החסרון שלה מאז סטנדרטיזציה כבר הייתה הבעיה העיקרית עם ניסויי תא זרימה, ו PDMS בהתאמה אישית בתאים לא סייעו זה. נוסף על הנושא המסוים הזה, ציפוי (תנאים), בדיקות ניאון, נוגד קרישה, טמפ &#39;erature והזמן בין דיגום ואנליזה כולם גרוע טופלו 8. התקינה של משתנים אלה הוא מאתגר, אבל בכל זאת נדרש להתיר השוואה של התוצאות בין המעבדות. נושא זה הוא הנושא העיקרי של האגודה הבינלאומית על פקקת ו haemostasis ב ועדת משנה מדעי ותקינה על Biorheology 9,10. תרכיזים טסיות (PC) הם בעירוי בחולים הסובלים ממחלות שונות הגורמות תרומבוציטופניה ו / או דימום. אבל טסיות PC ידועה להוריד את רמת רגישות, במיוחד פונקציה של זמן אחסון 11, תהליך הידרדרות צמוד הזדקנות המכונה גם נגע אחסון טסיות. לעתים הוא טען כי טסיות כגון לשחזר במחזור בעירוי פעם 12, אבל הראיות לכך הוא נדיר. יתר על כן, את הפונקציונליות של טסיות ממציא מחשב אינה נבחנה שיגרתית משום שהיחסים בין מבחנים כאלהיעילות טיפולית או מניעת מחלות היא 13 ברור. תאי זרימה microfluidic להציע אמצעי לחקור את תפקוד הטסיות במחשב כדי לייעל את שרשרת מניפולציות בין איסוף המנפיקה. זהו כלי מחקר רב עוצמה עבור השוואה ישירה (זיווג) של המחשב כפי שפרסמנו בעבר 14,15 והוא מתואר כאן.

<table><tbody><tr><td>צינור ואקטיינר BD עם EDTA&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368856</td><td></td></tr><tr><td>צינור ואקטיינר BD עם Heparin</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>צינור ואקטיינר BD עם נתרן ציטראט</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366575</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin צינור דם</td><td>Roche</td><td>6675751 001</td><td></td></tr><tr><td>BD Eclipse</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368650</td><td>מחט לאיסוף דם עם מחזיק מחובר מראש</td></tr><tr><td>קצות פיפטה 100-1,000</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה 2-200</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>739280</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה 1-10</td><td>אפנדורף</td><td>A08928</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת 5 מ"ל</td><td>שפופרת חרוטית 11691380</td><td></td><td></td>Simport</tr><tr><td>15 מ"ל</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>1888271</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת חרוטית 50 מ"ל</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>מגבונים מדויקים</td><td>Kimtech</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Fluoro+ Biochips</td><td>Cellix</td><td>188V8CF-400-100-02P10</td><td>בשם <חזק>איור S1</חזק> A כ-'Biochip'Vena8</td></tr> <tr><td>צינורות</td><td>Cellix</td><td>TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td><td>נקרא ב<חזק>איור S1</חזק> B כ'צינורות חד פעמיים'Vena8</td></tr> <tr><td>Needles</td><td>Cellix</td><td>SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td><td>נקרא ב<חזק>איור S1</חזק> B כ'פינים'</td></tr> <tr><td>מחברים לכבלי כניסה בודדים של שבבים ביולוגיים</td><td>Cellix</td><td>CONNECTORS-B1IC-PACK100</td><td></td></tr><tr><td>Multiflow8 connect</td><td>Cellix</td><td>MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS</td><td>נקרא ב<חזק>איור S1</חזק> B כ'צינורות לשימוש חוזר' ו'מפצל'קופסה</td></tr> <tr><td>לחה</td><td>Cellix</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Software משאבה מיקרופלואידית</td><td>Cellix</td><td>N/A</td><td>Venaflux Assay</td></tr><tr><td>Horm Collagen</td><td>Takeda/Nycomed</td><td>1130630</td><td>קולגן גיד סוסים מקומי (סוג I) תוסף</td></tr> <tr><td>תמיסת גלוקוז איזוטונית לדילול קולגןתמיסת מלח חוצצת HEPES (HBS)</td> <td>בהכנה ביתית</td><td></td><td>10 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינאתיאנסולפונית חומצה (HEPES) תמיסת מלח חומצית (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)</td></tr> <tr><td>חסימת מאגר</td><td>בתכשיר ביתי</td><td></td><td>1.0% (w/v) אלבומין בסרום בקר ו-0.1% (w/v) גלוקוז ב-HBS</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>אקונומיקה 10%</td> <td>בבית הכנה</td><td>בבית</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M NaOH</td><td>הכנה ביתית הכנה</td><td></td><td></td>בבית</tr><tr><td>אלכוהול מפוגל</td><td>Fiers</td><td>T0011.5</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix</td><td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td><td>עם Multiflow8. נקרא ב-<חזק>איור S1</חזק> A כ'משאבה' ו'סעפת'מיקרוסקופ</td></tr> <tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td> מצויד במיקרוסקופ <td>תוכנת קוליברי-LED ומצלמת CCD ברזולוציה גבוהה</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>מנתח המטולוגיה</td><td>Sysmex</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>Eppendorf</td><td>521-0095</td><td></td></tr><tr><td>טסיות דם אינקובטר</td><td>Helmer</td><td>PF-48i</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים דגירה</td><td>GFL</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה</td><td>מותג</td><td>A03429</td><td></td></tr><tr><td>צינור רולר</td><td>Ratek</td><td>BTR5-12V</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר עגינה סטרילי</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>אוטם צינורות</td><td>Terumo BCT</td><td>AC-155</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

טסיות דם המוכנות לעירוי מאבדות בהדרגה את התפקוד ההמוסטטי במהלך האחסון. ניתן לחקור את תפקוד הטסיות באמצעות מגוון ניסויים (עקיפים) במבחנה, אך אף אחד מהם אינו מקיף כמו תאי זרימה מיקרופלואידיים. בפרוטוקול זה, הבנייה מחדש של דם טרי טרומבוציטופני עם טסיות דם מאוחסנות משמשת להדמיית עירוי טסיות דם. לאחר מכן, הדגימה המשוחזרת מוחדרת לתאי זרימה מיקרופלואידיים המחקים המוסטזיס על חלבוני מטריצה תת-אנדותליים חשופים. ניתן למדוד את ההשפעות של תרומת דם, הובלה, הפרדת רכיבים, אחסון והשבתת פתוגן בעיצובי ניסוי זוגיים. זה מאפשר השוואה אמינה של ההשפעה שיש לכל מניפולציה בהכנת מרכיבי הדם על המוסטזיס. התוצאות שלנו מדגימות את ההשפעה של מחזור הטמפרטורה, קצב הגזירה, ריכוז הטסיות ומשך האחסון על תפקוד טסיות הדם. לסיכום, פרוטוקול זה מנתח את תפקוד טסיות בנק הדם וזה מסייע בסופו של דבר באופטימיזציה של שרשרת העיבוד כולל פלבוטומיה, הובלה, הכנת רכיבים, אחסון ועירוי.

כדי להדגים וריאצית תוך assay, שלוש דגימות דם כולו זהות מחדש היו perfused זמנית מעל משטחים מצופים קולגן (איור 1). זה הביא מקדם השונה של 8.7%. נתון זה מצביע על וריאצית תוך assay מקובל intralaboratory המתיר השוואה מהימנה בין דגימות קשורות. המפרצון של תא הזרימה המסחרי אנו מתארים כאן הוא בניצב תא המדידה וזה יכול לגרום מעט סוער במקום זרי...

עירוי טסיות דם והמוסטזיס עוצבו באמצעות בנייה מחדש של דם ותאי זרימה מיקרופלואידיים כדי לחקור את תפקוד טסיות הדם. הנתונים מדגימים את ההשלכות של נגע אגירת טסיות דם על המוסטזיס, במבחנה.

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לדמות עירוי טסיות in vitro ולבחון זאת באמצעות המוסטזיס על קולגן, תוך שימוש בזרימה הידרודינמית ומיקרוסקופיה בזמן אמת. מטופלים עם תרומב ציטופניה מטופלים בריכוזי טסיות מאוחסנים. השיטה שלנו נועדה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי התרומבוזיס וההמוסטזיס, עם דגש מיוחד על האיכות והתפקוד של ריכוזי טסיות מאוחסנים אלו.הערך המוסף של טכניקה זו הוא שהיא מדמה זרימת דם, ובכך לוקחת בחשבון השפעות ראולוגיות על התאים והביומולקולות המשתתפים. השיטה הנוכחית מעריכה קישוריות של טסיות דם לקולגן. עם זאת, ניתן להחיל אותה גם על רקמות דביקות אחרות, כולל פלאק אתרוסקלרוטי, תאים אנדותלייליים, או חלבוני מטריקס ספציפיים כגון Von Willebrand factor ופיברינוגן.התחל בהכנת הביוצ'יפ. ערבב במערבל (Vortex) ודלל תמיסת מקור של קולגן ביחס של 1 ל-20 בתמיסת גלוקוז איזוטונית של היצרן עד לריכוז סופי של 50 micrograms per milliliter. לאחר מכן, העבר בפיפט 0.8 microliters לתוך הנתיבים של ביוצ'יפ חד-פעמי חדש.מלאו את כל הנתיבים בקצה אחד של השבב, וסמנו אותו כקצה היציאה. לאחר מכן, בדקו את השבב כדי לוודא שכל נתיב מלא בפתרון עד ל-5/6 מגובהו, ושאין בועות אוויר. לאחר מכן, הדגירו את השבב בטמפרטורה של 4 °C למשך ארבע שעות או לילה שלם במיכל סגור ולח. בהמשך, חסמו את הערוצים המקודדים על ידי הזרקת תמיסת חסימה לקצה השני של הנתיבים. לאחר מכן, חתכו עבור כל נתיב קטעי צינורית באורך 12 סנטימטרים, וחברו סיכה לכל קטע צינורית כדי לאפשר את חיבורם לביוצ'יפ. שטפו את קטעי הצינורית במים מזוקקים באמצעות מזרק ומחבר.לאחר מכן, הראו אותם בבופר חסימה ואטמו אותם בתוך מכל לח, למשך שעה אחת לפחות. בשלב הבא, הכינו את המשאבה ואת הסעפת. ראשית, שטפו את המשאבה ואת הסעפת במים מזוקקים כדי להסיר בועות אוויר.בשלב הבא, הצמידו את הביוצ'יפ לבמה של המיקרוסקופ האוטומטי. הכניסו קצה אחד של הצינורות לשפופרת 1.5 milliliter מלאה ב-HBS, ולאחר מכן חברו את הקצה השני לכניסות של הביוצ'יפ. הכניסו את פיני המניפולד ליציאות של הביוצ'יפ.לאחר מכן, שטפו את המערכת ב-HBS באמצעות המשאבה. בצורה זו יוסרו שאריות של תמיסת חסימה או קולגן שלא נצמד היטב. בכך נשלמת הכנת תא הזרימה.התחילו באיסוף של דגימות דם שנגב recently ממתנדבים בריאים אל תוך מבחנה קונית לצנטריפוגה. סובבו את הדגימה למשך כ-15 דקות ב-250 Gs. אין להשתמש בבלם, שכן הוא יעורר את השכבה התחתונה שאינה דחוסה. הסירו והשליכו את הפלזמה העשירה בטבחיות ואת שכבת ה-buffy coat.שמרו את תרכיז כדוריות הדם האדומות המכיל כמה שפחות טסיות, לצורך הכנת הדם המשוחזר. כעת, התחילו בהפשרה של 4 mL של פלזמה מסוג AB בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות ו-20 שניות. בינתיים, קבעו את ההמטוקריט של תרכיז כדוריות הדם האדומות שהוכן באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטי.לאחר מכן, קבע את ריכוז הפלטלטים של תרכיז פלטלטים שהוכן בבנק דם, לצורך שימוש בשחזור של דם מלא. חשב את הנפחים הדרושים עבור מיליליטר אחד של דם שחזור עם 40% hematocrit ו-250,000 פלטלטים למיקרוליטר. כעת, באמצעות טיפ פיפטה קצוץ, העבר את הנפח הדרוש של תאי דם אדומים, פלזמה ותרכיז פלטלטים לריכוז הרצוי, עד לנפח סופי של מיליליטר אחד.ערבבו את הדם השוחזר באמצעות היפוכים עדינים, ובצעו ספירת דם מלאה. לאחר מכן, קחו מבחנה למיקרוצנטריפוגה מוכנה המכילה Calcein AM, והוסיפו אליה 1 mL של דם שוחזר. ערבבו את הדם עם הצבע באמצעות היפוכים עדינים.לאחר מכן, הדגרירו את הדם המשוחזר למשך חמש דקות ב-37 °C. בתוכנה, בחרו את אזור העניין (ROI) בנתיב הפרפוזיה. התמקדו בסיבי הקולגן ההדבקים לתחתית הנתיבים בהגדלה של 100x.במידה וניתן, השתמשו בניגודיות פאזה (phase contrast) או בניגודיות התערבות דיפרנציאלית (differential interference contrast). בחרו באפשרות set current Z for selected tile regions כדי לקבע באופן דיגיטלי את מיקומי ה-Z שנבחרו. המיקוד האופטי לפני הפרופוזיה צריך להיות על קולגן של אמלובלסטים, אך הדבר עלול להיות מאתגר.חלופה היא לכוון את פוקוס המיקרוסקופ אל הפלטלטית הראשונות שנצמדו. כעת, ערבבו בעדינות את הדגימות ומקמו אותן לצד הביוצ'יפ. לאחר מכן, הכניסו את הצינור המחובר לנתיב הנצפה אל תוך הדם המשוחזר.בשלב הבא, באמצעות התוכנה השולטת במשאבה, הפעל לחץ של 50 dyne לסנטימטר רבוע כדי להעביר את דגימת הדם לנתיב והתחל את הניסוי. במהלך הניסוי, הקלט תמונות מדי 15 שניות במשך חמש דקות. קבע את קינטיקת צמיחת הקריש באמצעות תוכנה לניתוח תמונות.במקרה זה, נעשה שימוש ב-Zen 2012. התחל בפתיחת תוסף ניתוח התמונות (image analysis) כדי לקבוע את כיסוי הפנימי של הטסיות. הגדר את סף הפלואורסצנציה בלשונית הניתוח האינטראקטיבי (analyze interactive) כדי להגדיר את עוצמת הפיקסלים המתאימה לאות חיובי, אשר יגיע מטסיות נצמדות.לאחר מכן, השתמשו באפשרות "create tables" כדי להפיק באופן אוטומטי גיליון נתונים עם רשימה של שטחי הפנים של האותים החיוביים עבור כל נקודת זמן. שמרו גיליונות אלו בפורמט XML, ופתחו אותם בתוכנת גיליונות נתונים לצורך חישובים נוספים. בכל נקודת זמן, חשבו את סך שטחי הפנים של האובייקטים שנבחרו, והביאו ערך זה כאחוז השטח המכוסה.לאחר מכן, שרטטו את הנתונים כפונקציה של זמן הפרפוזיה, וחשבו את השיפוע באמצעות רגרסיה ליניארית. פעולה זו ממדלת את קינטיקת גדילת התסחיף של אותו תנאי ניסויי ספציפי. שלוש דגימות זהות של דם שלם ששוחזרו הועברו בפרפוזיה בו-זמנית על פני שטח מצופים בקולגן.תוצאה זו הניבה מקדם וריאציה של 8.7%, המצביע על שונות פנים-בדיקתית ופנים-מעבדתית מקובלת לצורך השוואת הבדיקות. העברה של דם סומללה על ידי הרכבה מחדש של הדם עם הרכיב החסר. בוצעו מספר הרכבות מחדש בריכוזי טסיות יורדים.כצפוי, ספירות טסיות נמוכות יותר הובילו לפחות היצמדות כפונקציה של זמן הפרפוזיה. לאחר מכן נחקרה השפעתן של טמפרטורות נמוכות יותר לאחר איסוף הדם ובמהלך הפרפוזיה. נמצא כי קרישי דם נוצרו לאט יותר כאשר הדם קורר לטמפרטורת החדר.בהשוואה לדגימה שנשמרה ב-37 °C לאורך כל המחקר. בזמן הסירקולציה, טסיות דם נקשרות לאתרי פגיעה בכלי הדם בתנאים של מאמץ גזירה גבוה בדופן. כצפוי, שינוי קצב הגזירה בתאי הזרימה המיקרופלואידיים שינה את סך היצמדות הטסיות.תנאים אלו משנים גם את קינטיקת צמיחת הקריש. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות הבנה טובה של אופן ביצוע ניסויי תא תזרים מיקרופלואידי באמצעות דם רקומי (reconstituted blood) לבחינת האיכות והתפקוד של תרכיזי טסיות מאוחסנים. ניתן לבצע טכניקה זו בערך שבע שעות.ניסויים בתא זרימה מיקרופלואידי סללו את הדרך לחוקרים בתחום של עירוי טסיות לבחון את ההשפעה של משתני תרומה, הכנה ואחסון. דוגמה רלוונטית אחת היא השבתת פתוגנים. הצגנו דוגמה של נבדק ניסויי אחד בלבד.עם זאת, ניתן להשתמש בשינויים בריכוז הסידן, במאמץ הגזירה ובציפויים של פני השטח כדי לענות על שאלות מחקר שונות. בדומה להליך זה, ניתן לבצע מדידות נוספות בתאי זרימה מיקרופלואידיים כדי לענות על שאלות נוספות. לדוגמה, ביצועיהם של טסיות דם מאוחסנות בתהליך קרישה בזרימה.

microfluidic-flow-chambers-using-reconstituted-blood-to-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנחנו המתאר שיטה תאים חסיד נתונים ללחץ הזרימה למינרית גזירה במעגל תזרים סטרילי מתמשך. הדבקה של התאים, מורפולוגיה ניתן ללמוד דרך תא שקוף, דגימות שהתקבלו במעגל לניתוח המטבוליט ותאי שנקטפו לאחר חשיפה גזירה לניסויים עתידיים או תרבות.

במקביל, צלחת תזרים לשכת ואת מעגל זרימה רציפה להערכת ובתאים אנדותל תחת מתח זרימה למינרית שאר

שיטת לתרבות monolayer תא האנדותל לאורך כל פני השטח הפנימי של המכשיר 3D microfluidic עם כלי הדם בגודל הערוצים (&lt;30 מיקרומטר) מתואר.

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

פרוטוקול זה משכפל את זרימת דם פיזיולוגית או פתולוגי במבחנה כדי לסייע בקביעת תגובת תא בפתולוגיות מחלה. על ידי החדרת לחץ דעיכת הקאמרית במורד הזרם של משאבת דם, זרימת דם בכלי הדם ברחבי ניתן סכמה והוטלה על monolayer של האנדותל של כלי דם או תרבות משותפת כוזב.

במבחנה הדגם של פיזיולוגי ופתולוגיים זרימת דם עם בקשה לחקירות של שיפוץ תא דם

מאמר זה מתאר מודל ניסיוני של המוסטאסיס המודד פונקציה וקרישה טסיות זמנית. טסיות קרינת הפיברין נמדדות בזמן אמת, וקצב הידבקות טסיות דם, קרישת שיעור, והתחלה של קרישה נחושה. המודל משמש כדי לקבוע מאפיינים טסיות procoagulant תחת זרם מתרכז עבור עירוי.

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

אנו מציגים מודל מחלת כלי דם במבחנה לחקור אינטראקציות דם שלם עם אנדותל נגזר המטופל. מערכת זו מאפשרת לחקור תכונות טרומבוגניות של תאי אנדותל ראשוניים בנסיבות שונות. השיטה מתאימה במיוחד להעריך את הטיפול situ thrombogenicity ונוגדי קרישה בשלבים שונים של קרישה.

במודל מחלה מיקרופלוידיקית במבחנה ללמוד אינטראקציות דם-אנדותל שלם ודינמיקת קריש דם בזמן אמת

מוצג כאן פרוטוקול עבור מודל לולאה מודינמית מתוקנן במבחנה. מודל זה מאפשר לבדוק את תאימות ההמו-תאימות של צינורות זינג'ן או סטנטים של כלי דם בהתאם לתקן ISO (הארגון הבינלאומי לתקינה) 10993-4.

מודל לולאה המודינמית במבחנה כדי לחקור את תאימות Hemocyto והפעלת תא מארח של מכשירים רפואיים כלי דם

ניתן להעריך את תפקוד טסיות הדם תחת זרימה ולדמות החייאה המוסטטית באמצעות מכשיר מיקרופלואידי, שיש לו יישומים ברפואת טראומה ועירוי.

מיקרופלואידיקה בהערכת תפקוד טסיות הדם

אנו מציגים את הליך הייצור ותפעול של מכשיר microfluidic המשחזר microenvironments סרטני...

מכשיר microfluidic ליצירה מחדש של גידול microenvironment<em&gt; במבחנה</em

Dielectrophoresis (DEP) היא שיטה יעילה לתפעל תאים. מעגלים מודפסים (PCB) יכול לספק אלקטרודות זול, לשימוש חוזר ויעיל מניפולציה מגע חופשי בתוך התא מכשירים microfluidic. על ידי שילוב של PDMS מבוססי ערוצי microfluidic עם coverslips על PCBs, אנחנו מדגימים מניפולציה חרוז תא הפרדה בתוך מכשירים microfluidic רב.

חרוזים ועל הפרדת תאים ריבוי ערוצים מכשירים microfluidic שימוש dielectrophoresis ו זרימה למינרית

מחקר זה השתמש במערכת microfluidic צלחת רב גם, להגדיל באופן משמעותי את התפוקה של מחקרים מתגלגלים תא תחת זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. לאור החשיבות של מתגלגל תא בתא רב שלבי ביות מפל ואת החשיבות של ביות התא הבאה משלוח מערכתי של אוכלוסיות אקסוגניים של תאים בחולים, מערכת זו מציעה פוטנציאל כפלטפורמת הקרנה כדי לשפר את הטיפול המבוסס על תאים.

ניתוח שיטתי של במבחנה תא רולינג באמצעות מערכת microfluidic צלחת רב גם

למדו שימוש בלחדרי זרימה מיקרו-נוזליים עם דם מחודש לבחינת תפקוד טסיות מאוחסנות ומנגנוני המוסטאסיס על קולגן במבחנה. שיטה זו מאפשרת הערכת איכות מרכזי טסיות לטיפול בטרומבוציטופניה.

Microfluidic זרימה צ'יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי

גלה סרטונים נוספים