קולגן אני Assay Organotypic: פלטפורמה חשילה לבחינת התנהגות תא בהקשר 3-Dimensional

המטרה הכוללת של הליך זה היא להקים רקמה כמו מטריצת קולגן תלת מימדית כדי לחקור את תפקוד התא. זה מושג על ידי מיצוי קולגן מגידי זנב חולדה. לאחר מכן, סיבי קולגן מורכבים מחדש בנוכחות פיברובלסטים כדי לאפשר לפיברובלסטים לכווץ את ג'ל הקולגן.

בשלב השלישי, תאי הגידול יושבים על גבי המטריצה בשלב האחרון. המטריצה מודגרת על גבי רשת מתכת ליצירת ממשק נוזל אוויר המאפשר פלישה של תאי הגידול לתוך המטריצה. בסופו של דבר, ניתן לבצע צביעה אימונוהיסטוכימית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לנתח נדידת תאים של סינתזת מטריצות, כולל פלישת תאי גידול ואינטראקציות בין סוגי תאים שונים.

לכן שיטה זו מתאימה באופן אידיאלי להסתכלות על פלישה וגרורות, וגם להסתכל על התפתחות הגידול. ב-S תלת-ממדי מורכב, אנו יכולים להסתכל על דברים כמו התמיינות, הישרדות תאים וצמיחת תאים. אך בפרט, אנו יכולים להסתכל על האופן שבו תאי גידול מתקשרים עם סטרומה במהלך אירועי מפתח של פלישה.

אחד החלקים המוקדמים ביותר של גרורות סרטן עצמו להקמת תרביות פיברובלסטים משתלי עור. ראשית הניחו כמה טיפות של MEM בתוספת פניצילין, סטרפטומיצין ואזור פטריות בתחתית צלחת פטרי. לאחר מכן הכניסו ביופסיות אגרוף של ארבעה מילימטר שנרכשו מאמה אנושית לתוך הצלחת.

לאחר מכן, לבסוף, קוצצים את הביופסיה לחתיכות קטנות על ידי נדנוד להב אזמל מספר 24 כנגד תחתית צלחת הפטרי. מניחים את תמיסת הרקמות בבקבוק תרבית רקמות בגודל 25 סנטימטר מרובע. לאחר מכן שפכו אמצעי גידול פיברובלסטים ראשוניים על הרקמה.

זה מספיק כדי לכסות את פני הבקבוק, אבל זה לא מספיק כדי שהרקמה תצוף. דגרו את הבקבוק במשך שלושה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO2, ולאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר של מצע גידול פיברבלסט ראשוני לאחר שלושה ימים נוספים. דגירה. החלף את המדיה עם מצע גידול ראשוני טרי של סיבים.

אם התאים כמעט מתלכדים, ניתן לפצל אותם אחד עד ארבעה לצלוחיות חדשות עם מדיה טרייה. התחל בשטיפת זנבות החולדה ב-70% אתנול מצנן בקבוק של 0.5 חומצה אצטית טוחנת בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את הגידים מזנבות העכברושים. ראשית, הסר את העור מכל זנב חולדה בודד.

לאחר מכן, נתק את הגיד מליבת האזור הפרוקסימלי של הזנב. לבסוף, הסר את הגיד לכיוון האזור הדיסטלי של הזנב באמצעות מלקחיים בשיניים. לאחר הסרת הגידים, הוסיפו 250 מיליליטר של 0.5 חומצה אצטית טוחנת לבקבוק חרוטי מזכוכית.

חלץ גרם אחד של גיד לכל 250 מיליליטר חומצה על ידי ערבוב בארבע מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לאחר מיצוי הגיד. צנטריפוגה את תמיסת החומצה והגידים ב-7, 500 פעמים G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן השליכו את הגלולה. לאחר מכן הוסיפו נפח שווה של 10% משקל לנפח NACL לסופרנטנט וערבבו במשך 30 עד 60 דקות נוספות לאחר שלב הערבוב השני.

גלולה את הפתרון. הפעם בשעה 10,000 פעמים, G, השליכו את הסופרנטנט ואדום ממיסים את המשקעים בחומצה אצטית מולרית של 0.25 עם ערבוב נוסף במשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, דיאליזה של תמיסת הקולגן כנגד שישה עד שמונה שינויים של שישה ליטרים של כ-17.5 מילי-מולרית חומצה אצטית.

לאחר כדור הדיאליזה יש לצרוך את הקולגן ב-30,000 פעמים G למשך 1.5 שעות. לבסוף, העבירו את הסופרה נאטין לבקבוק סטרילי והתאימו את ריכוז הקולגן לכשני מיליגרם למיליליטר עם חומצה אצטית של 0.5 מילי-מולרית שצוננה קודם לכן, ולאחר מכן השאירו את הקולגן על קרח. ראשית, בחר שלוש צלוחיות T 75 של פיברובלסטים ראשוניים מתלכדים.

שים מיכל FCS בארבע מעלות צלזיוס להתקרר. לאחר מכן, הוסף 75 מיליליטר של קולגן זנב העכברוש שהוכן בעבר לבקבוק סטרילי מקורר מראש מזכוכית של 100 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים תשעה מיליליטר של 10 XMEM תוך כדי ערבוב התערובת.

הוסף שישה מיליליטר של 0.22 נתרן הידרוקסיד רגיל, האטה כאשר מתקרבים למיליליטר האחרון. כדי להבטיח שהצבע הסופי יהיה בין כתום לוורוד. טריפסין מסתכל על הפיברובלסטים ואז מגלגל את התאים ב-400 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

במהלך הסיבוב הרכיבו 36 כלי פלסטיק בגודל 35 מילימטר. השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של ה-FCS שהתקרר מראש, והוסיפו מיד את הפיברובלסטים לקולגן. מערבבים ומערבבים צלחת כ -2.5 מיליליטר מתערובת הקולגן פיברובלסטים למנה של 35 מילימטר במהירות האפשרית.

הימנעות מבועות והתייצבות הקולגן. מניחים את הכלים בחממה למשך 10 דקות כדי לאפשר לקולגן ליצור ג'ל רופף, ולאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של מצע גידול פיברבלסט לכל מנה. לאחר מכן נתק את מטריצת פיברבלסט הקולגן מדפנות המנה בעזרת פיפטה, החזיר את הכלים לחממה.

למחרת, הוסף עוד מיליליטר של מצע גידול Fiberblast לכלים. לאחר מכן החליפו את המדיה כל יומיים במשך שמונת הימים הבאים. במהלך תקופה זו, כל מטריצת פיברובלסטים של קולגן צריכה להתכווץ בין כ -3.5 סנטימטרים לקוטר של כ -1.5 סנטימטרים לפני תחילת השלב הבא הזה, לעקר את כל המלקחיים והציוד באתנול.

לאחר מכן בעזרת מלקחיים מעוקרים קהים, העבירו בעדינות מטריצה מכווצת לבאר של צלחת 24 בארות, וודאו שהמטריצה לא מתקפלת. לאחר מכן, בחר בקבוק של תאים למחקר סכיני טריפס וגלול את התאים כמו קודם, ולאחר מכן השהה מחדש את התאים בלוחית המדיה מיליליטר אחד של תרחיף התא על גבי המטריצה, והנח את המטריצה המכווצת באינקובטור עד שהתאים גדלו כמעט למפגש עד לראש המטריצה. כשלושה עד חמישה ימים לאחר חיטוי רשתות נירוסטה חתוכות מראש ליצירת חצובות לפני מקום השימוש, רשת סטרילית בצלחת פלסטיק של שישה סנטימטרים מוסיפה מספיק אמצעי גידול כדי לכסות את הרשת.

יצירת ממשק נוזל האוויר היא החלק העדין ביותר בהליך זה. יש להניח את המטריצה על הרשת ולאחר מכן לשאוב בעדינות את המדיום כך שהמטריצה עדיין שקועה בחלקה מלמטה ומוזנת מלמטה. זה יוצר שיפוע כימו-טקטי ומאפשר לתאים למעלה להתחיל לפלוש לתוך המטריצה.

לאחר מכן ניתן להעריך את התנהגות התא בהגדרה זו במשך 21 יום ומעלה. הניחו מטריצה על הרשת. לאחר מכן שאפו בעדינות את המדיה עד שתחתית המטריצה נמצאת במגע עם המדיה, אך לא מכוסה על ידה.

ממשק נוזל האוויר אמור להיראות דומה לסצנה הזו כאן. לאחר מכן, העבירו מטריצה שחדרה למשטח ישר. חותכים את המטריצה לשניים בעזרת אזמל טרי, ואז מרימים את המטריצה עם האזמל ומעבירים אותה ל-4% PFA.

תקן את המטריצה למשך הלילה בטמפרטורת החדר בשני האיורים הבאים, תאי אדנוקרצינומה של צינור הלבלב או תאי P DAC היו מרובדים על מטריצה אורגנוטיפית. באיור הראשון, ניתן לראות תאי P dac לא פולשניים בשכבה על גבי המטריצה, ואילו באיור השני הזה נצפים כאן תאי P dac פולשניים שחדרו למטריצה, ניתן לראות כאן מקבילה לעור חי המראה אפידרמיס מרובד על רכיב עור קולגנוס מכווץ פיברובלסטים. ניתן לראות תאי פרקינסון פולשניים בירוק מקיימים אינטראקציה עם פיברובלסטים באדום, המקדמים פלישה של תאי PDX למטריצה האורגנוטיפית.

תאי הפרקינסון הפולשניים המוצגים כאן שוב בירוק מוצגים בתוך מטריצת הקולגן, אשר מצולמת באמצעות דור הרמוני שני, ומוצגים בסגול אתרים של פירוק מטריצה נראים כחורים כהים בתוך המטריצה הסגולה. באיור זה C 8 1 61 מוצגים תאי מלנומה הפולשים למקבילה עורית קולגנית מכווצת פיברובלסטים, כמו גם התבוננות בהתנהגות של תהליכים בסיסיים של חלבונים פלואורסצנטיים במהלך בדיקה זו. אתה יכול גם להשתמש ב-asay זה יחד עם צביעה אימונוהיסטוכימית כדי להסתכל על סמני התפשטות תאים והבדלים בהישרדות התאים, וכו'.