פרוטוקול מיקרוסקופ מיקום מולקולה בודדת רב-תוויות לחקר כרומטין בסביבה גרעינית צפופה
5 ביוני 2026
אנו מציגים פרוטוקול צביעה וניתוח מיקרוסקופ מיקום כרומטין חד-מולקולי (SMLM) בשלושה צבעים, המאפשר מיפוי שכפול של אאוכרומטין, הטרוכרומטין ו-RNAP II לניתוח מרחבי. פרוטוקול זה מאפשר תיוג רב-צבעוני יעיל בסביבות גרעיניות צפופות, כולל מטרות הקשורות לכרומטין, ומאפשר גילוי סימולטני אמין.
המחקר שלנו בוחן את ההרכב האפיגנטי של תחומי אריזת הכרומטין, וכיצד גורמים רגולטוריים מעצבים את המבנה והתפקוד שלהם. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לחקירת קשרים מרחביים בין מטרות לסביבות תאיות צפופות, כמו הגרעין. כדי להתחיל, שקלו את אלבומין הסרום של הבקר, כך שהריכוז הסופי בנפח הבופר הנדרש לניסוי יהיה 3%. הוסף את אלבומין הסרום של הפר לצינור צנטריפוגה.
הטה את צינור הצנטריפוגה לזווית של 45 מעלות כדי לפזר את גבישי האלבומין בסרום הבקר, ואז להוסיף PBS לצינור. זה מונע הצטברות של הגבישים. אפשר לכל גבישי האלבומין בסרום בקר להתמוסס באופן טבעי בטמפרטורת החדר ולהימנע מרעד או מערבולת.
לאחר שהגבישים מומסים במלואם, הוסף את טריטון X-100 כדי להגיע לריכוז סופי של 0.2%. אם נשארים גבישים, יש פיפטה למעלה ולמטה את התמיסה מספר פעמים כדי לערבב את התמיסה לאט מבלי ליצור בועות. קח את התאים החיים מהאינקובטור. הסר את מדיום תרבית התאים מהצלחת.
שטוף את התאים על ידי הוספת מספיק PBS כדי לכסות את התאים, ואז הפיפט את ה-PBS. לאחר מכן, יש לפיפטה מספיק תמיסה קיבועית כדי לכסות את התאים ולהשאיר אותם להתייצב למשך 10 דקות. באמצעות איזון, שקלו בורוהידריד נתרן להכנת תמיסת הקפאה של 0.1%.
הוסיפו את בורוהידריד הנתרן לצינור צנטריפוגה. להוציא את תמיסת הקיבע מהמנה. לאחר מכן, הוסיפו מספיק PBS לצלחת כדי לכסות את פני התא.
הנח את הצלחת על שייקר למשך חמש דקות כדי לשטוף את התאים. לאחר מכן, הוסיפו את נפח ה-PBS הנדרש לנתרן בורוהידריד בצינור הצנטריפוגה. מערבב את הצינור כדי לערבב את תמיסת הקירור.
הוציאו את המנה מהשייקר והשליכו את ה-PBS מהצלחת. הוסיפו מספיק תמיסת הקירור כדי לכסות את פני השטח של המנה. לאחר מכן, מניחים את המנה על שייקר למשך שבע דקות כדי לכבות אוטופלואורסצנציה בתאים.
השליכו את תמיסת הקירור שנותרה בצינור הצנטריפוגה למיכל הפסולת הכימית הנוזלית המסומנת כראוי. הוציאו את הצלחת מהשייקר ואז הוציאו את תמיסת ההקפאה מהצלחת. לאחר מכן, הוסיפו מספיק PBS למנה כדי לכסות את פני השטח.
הנח את הצלחת על שייקר למשך חמש דקות כדי לשטוף את התאים. לאחר הדגירה, הסר את ה-PBS וחזר על השטיפה עם PBS פעמיים נוספות. עכשיו, הוסיפו מספיק בופר חוסם למנה כדי לכסות את פני השטח.
דגרו את הצלחת על שייקר למשך לפחות שעה אחת כדי לחדור את ממברנות התא ולחסום אתרי הקשר. להכנת תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית, העבר את הנפח הנדרש של מאגר הבופר החוסם לצינור צנטריפוגה חדש. הוסף את נפח הנוגדנים הראשוני הנדרש לבופר החוסם כדי להגיע לריכוז הסופי שנקבע על ידי היצרן.
לאחר מכן, החליפו את הבופר החוסם בכמות מספקת של תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית שתכסה את פני הכלי ודגרו על שייקר למשך שעה עד שעתיים או למשך הלילה. לאחר דגירה ראשונית של נוגדנים, יש להחליף את תמיסת הנוגדנים הראשית בבופר שטיפה. לאחר מכן, מניחים את הצלחת על שייקר למשך חמש דקות כדי לשטוף את התאים.
חזור על השטיפה של השטיפה פעמיים נוספות לסך הכל שלוש שטיפות נוספות. הכינו את תמיסת צביעת נוגדנים משנית לפי הריכוז המומלץ. חשב את נפח תמיסת הצביעה הכולל על ידי הוספת 0.5 מיליליטר לנפח הנדרש לכיסוי התאים.
העבר את הנפח המחושב מהבופר החוסם לצינור צנטריפוגה חדש להכנת תמיסת הצביעה. לאחר מכן, מוסיפים את נפח הנוגדנים המשני המתאים לבופר החוסם כדי לקבל את הריכוז הסופי הנכון. עטוף את צינור הצנטריפוגה המכיל את תמיסת צביעת הנוגדנים המשנית בנייר אלומיניום, וערבבו את התמיסה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
הוסיפו מספיק תמיסת צביעת נוגדנים משנית לצלחת כדי לכסות את פני השטח. הנח את המנה על שייקר למשך 40 דקות כדי לחבר פלואורופורים למטרות התאיות המסומן. כסו את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנת פלואורופור.
לאחר 40 דקות, בצע שתי שטיפות PBS כפי שהודגם קודם. אם מעדיפים אחסון, הוסיפו מספיק PBS לצלחת כדי לכסות את פני התא לפני האחסון. עטוף את התבנית בפארפילם כדי למנוע אידוי נוזלי, ואז בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנת פלואורופור.
שמור את הצלחת העטופה בארבע מעלות צלזיוס עד שהיא מוכנה לצילום. פרוטוקול הצביעה הסדרתי יצר תמונות dSTORM ייצוגיות בשלושה צבעים של כרומטין עבור קווי תאים מרובים, כולל תאי BJ Fibroblast, HeLa ותאי MCF 10A. צינור הניתוח הוערך באמצעות מערכי נתונים מדומים המייצגים התפלגויות טורואידליות ומרחביות אקראיות אחידות נורמליות, המעוגנות למיקומי אשכולות הטרוכרומטינים.
דפוסי ארגון מרחבי מובחנים יצרו פרופילי היסטוגרמה אופייניים למרחקים כאשר ניתחו קואורדינטות מיקום ביחס למרכזי הטרוכרומטין. סמנים ממופרדים במרחב במבנה כורואידלי רגיל יצרו צפיפות מפרקים מינימלית, מה שהוביל לפרופיל התפלגות שטוח. דפוסי סימון חופפים מדומים בתצורה אקראית נורמלית יצרו ירידה בצפיפות המפרק ככל שהמרחק הולך וגדל מנקודות ייחוס.
זיהוי מבוסס סריקת DB של דומיינים הטרוכרומטין אפשר סיווג לתחומים קטנים, בינוניים וגדולים בהתבסס על רדיוס אפקטיבי. ניתוח מרחק כמותי הראה כי RNA פולימראז II ו-H3K27ac ממוקמים סמוך לגבולות ההטרוכרומטין בתחומים קטנים, בינוניים וגדולים. ניתוח צפיפות המפרקים הראה שיא של H3K27ac ו-RNA פולימראז II מחוץ לגבולות אשכולות ההטרוכרומטין.
באמצעות פרוטוקול זה, חוקרים יכולים לחקור את הארגון הלא מסודר לכאורה של הכרומטין כדי לחקור את הקשר בין מבנהו, אלמנטים רגולטוריים ותוצאות תפקודיות. לאחר הליך זה, ניתוחים חישוביים מבוססי תמונה או ענן נקודתי שונים יכולים להפיק תכונות מבניות כמותיות מנתונים מרחביים, בהתאם לשיטת ההדמיה שבה משתמשים. חוקרים יכולים להרחיב את שיטת התיוג הזו על ידי אופטימיזציה של סמנים נוספים וניצול נתונים רב-ערוציים לאפשר ניתוחים מתקדמים ומקיפים יותר.
Overview
This article presents a sequential immunolabeling protocol for robust three-color single molecule localization microscopy (SMLM) in dense nuclear environments, enabling high-fidelity imaging of chromatin components. The method includes optimized buffer formulations, fluorophore selection, and antibody validation strategies to minimize crosstalk and signal degradation. It is integrated with a computational analysis pipeline that uses localizations from one target as spatial anchors to quantify inter-target distances, local densities, and multi-label co-affinity. The protocol is demonstrated in BJ Fibroblast, HeLa, and MCF 10A cells and supports detailed nanoscale spatial analysis of chromatin architecture.
Key Study Components
Area of Science
- Cell Biology
- Microscopy
- Chromatin Biology
Background
- Chromatin exhibits multiscale organization from nucleosomes to micron-scale domains, requiring high-resolution and specific imaging approaches.
- Single molecule localization microscopy (SMLM), particularly STORM, enables nanoscale mapping of epigenetic marks.
- Multi-label imaging in the nucleus faces challenges such as reduced antibody accessibility, non-specific binding, and fluorophore instability.
- Existing protocols often lack robustness in dense subcellular environments like the nucleus.
Purpose of Study
- To develop a sequential immunolabeling protocol optimized for high-density nuclear environments.
- To enable robust three-color SMLM with minimal crosstalk and reduced signal degradation.
- To integrate the protocol with a computational pipeline for quantitative spatial analysis of chromatin components.
- To provide a reproducible framework for multi-component imaging in dense subcellular environments.
Methods Used
- Sequential immunolabeling with optimized buffer formulations and fluorophore selection.
- Blocking with 3% BSA, fixation, and quenching with 0.1% sodium borohydride to reduce autofluorescence.
- Primary and secondary antibody incubations with washing steps to minimize non-specific binding.
- dSTORM imaging under buffered conditions to stabilize fluorophores.
- Computational analysis using localizations from one target as seed points to measure inter-target distances and joint densities.
- DB scan-based clustering to categorize heterochromatin domains by effective radius.
Main Results
- The protocol produced representative three-color dSTORM images in BJ Fibroblast, HeLa, and MCF 10A cell lines.
- Simulated data showed distinct distance histogram profiles based on spatial organization of markers relative to heterochromatin centroids.
- RNA polymerase II and H3K27ac were localized near heterochromatin boundaries across small, medium, and large domains.
- Joint density analysis revealed peak colocalization of H3K27ac and RNA polymerase II just outside heterochromatin cluster boundaries.
- The analysis pipeline enabled quantification of structural features from spatial point cloud data derived from SMLM.
Conclusions
- The sequential immunolabeling protocol enables reliable, high-fidelity three-color SMLM in dense nuclear environments.
- Integration with computational analysis allows nanoscale quantification of chromatin spatial organization.
- The method provides a reproducible framework for studying spatial relationships between chromatin components and regulatory factors.
- Researchers can extend the approach by optimizing additional markers for comprehensive multi-target analysis.
- This protocol advances the investigation of chromatin structure-function relationships in native cellular contexts.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical bottleneck in chromatin research: achieving robust, multiplexed super-resolution imaging in the dense nuclear environment where antibody accessibility and signal stability are major limitations. By enabling quantitative nanoscale mapping of epigenetic marks and regulatory factors relative to heterochromatin domains, it provides a mechanistic de-risking tool for target validation in epigenetic drug discovery. The integrated computational pipeline transforms raw localization data into actionable spatial metrics, supporting predictive confidence in early-stage target hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of spatial relationships between chromatin marks, transcription factors, and heterochromatin to clarify mechanistic hypotheses in epigenetic regulation.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible framework for multiplexed target co-localization studies in dense subcellular environments.
- Predictive Value: Quantifies nanoscale proximity and co-affinity between targets, supporting target prioritization based on spatial context and functional relevance.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated, high-fidelity three-color SMLM data suitable for assay standardization and reproducibility assessment in nuclear target engagement studies.
- Scalability: Supports extension to additional markers via sequential labeling, enabling scalable multi-parameter chromatin architecture profiling.
- Analytical Output: Produces quantifiable spatial features such as inter-target distances, local densities, and joint density profiles for downstream screening hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of chromatin organization in disease-relevant cell models, linking epigenetic target modulation to structural outcomes.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase spatial insights with preclinical validation by providing consistent, quantifiable nuclear imaging readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables mechanistic de-risking of epigenetic targets through direct visualization of their nanoscale chromatin environment and regulatory neighbors.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, where spatial chromatin context informs target druggability and mechanism of action. It enables screening-ready assay development by delivering standardized, multiplexed nuclear imaging data with quantitative outputs. The computational pipeline provides analytics-ready spatial metrics that support cross-functional comparison of compound or genetic perturbations on chromatin architecture.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping epigenetic marks and regulatory factors relative to heterochromatin domains.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible three-color SMLM data with minimized crosstalk for reliable compound effect assessment in nuclear targets.
- Analytics: Generates inter-target distance measurements, local density maps, and joint density profiles from localization data to quantify spatial relationships.
- Translational Research: Connects nanoscale chromatin organization findings to preclinical continuity through standardized, quantifiable spatial readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized protocol for multi-target nuclear imaging applicable across chromatin-focused discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in epigenetic target validation through direct nanoscale spatial mapping of chromatin components and regulators.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and signal fidelity in multiplexed nuclear SMLM via optimized blocking, antibody validation, and buffer formulations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in epigenetic target programs by providing spatial context that predicts functional target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets based on validated chromatin localization and co-affinity with key regulatory elements.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy, immunostaining, and point cloud analysis for accurate data interpretation.
- Dependent on SMLM-capable instrumentation and stable fluorophore selection compatible with sequential labeling and buffering conditions.
- Necessitates cross-team standardization of antibody validation, blocking efficiency, and quenching protocols to minimize batch variability.
- Involves adaptation considerations for different chromatin targets, including epitope accessibility and antibody penetration in fixed dense nuclei.
- Limited by the sequential nature of staining, which increases total protocol time and requires careful optimization to avoid target loss or signal degradation over multiple rounds.
