שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב ארבידופסיס

אנו מספקים כאן פרוטוקול יעיל ואמין עבור immunostaining, הקרינה הכלאה באתר, מכתים DNA ואחרי הדמיה בביציות thaliana ארבידופסיס כל הר כמותיים, ברזולוציה גבוהה. שיטה זו השתמשה בהצלחה כדי לנתח שינויי הכרומטין ואדריכלות גרעינית.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין את Arabidopsis Vues להכלאה של הר שלם וצביעה חיסונית. זה מושג על ידי קיבוע ניצני פרחים טריים בתמיסה המקבעת. השלב השני הוא לנתח ולהטמיע בזהירות vues ברפידות אקרילאמיד מיניאטוריות ישירות על שקופיות מיקרוסקופיה.

לאחר מכן, עיבוד הרקמות מאפשר בירור וחדירה של רקמות. השלב האחרון הוא לדגור את הדגימות המטופלות בתמיסת נוגדנים לצביעה חיסונית או בדיקה מסומנת לפלואורסצנט בהכלאה C שתיים. בסופו של דבר, הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה ואחריה שחזור תלת מימדי, מאפשרת ניתוח כמותי בהרכבה שלמה ברמת התא הבודד.

שיטה זו שימשה בתחילה כדי לספק תובנה לגבי ארגון ה-CT בתצוגה, אך ניתן היה ליישם אותה גם כדי לנתח תאי תאים אחרים ברקמות אחרות של הצלילה ובאורגניזמים מודלים אחרים לתוך צינורות מיקרו-פוגה מלאים במאגר BBO טרי מקורר על קרח ב-20 עד 30 קרפלים לכל שפופרת מגדירים את הצינורות להתנדנד בעדינות בטמפרטורת החדר למשך חצי שעה. לאחר מכן, סובב את הצינורות למשך דקה אחת ב -400 Gs.ואז שאב בזהירות את הסופרנטנטים, השליך אותם והוסף מיליליטר PBT לקרפלי. הניחו את הצינורות על קרח כדי שכל צינור של קרפל יורכב.

התכוננתי על קרח. חמש שפופרות המכילות 200 מיקרוליטר. תערובת אקרילאמיד טרייה של 5%.

חמש שקופיות סופר פרוסט נקיות עם תווית בעיפרון, מחשבה Eloqua של 20% PS ומחשבה Eloqua של 20% NAPS מצינור אחד של קרפל. קח ארבעה או חמישה עם קצה קצה חתוך והניח כל אחד על שקופית אחת. הסר את עודפי הנוזלים על ידי פיפטינג בזהירות באמצעות מחטים עדינות.

בצע חתכים אורכיים בקרפלי והסר את דפנות קרפלי כדי לשחרר את שורות ה-vues. צעד זה ידרוש תרגול. מנע את התייבשות ה-vues על ידי הוספת עד 10 מיקרוליטר PBS, ולאחר מכן לצינור מיקרו-פוגה המכיל את תערובת האקרילאמיד.

הוסף במהירות 12 מיקרוליטר NAPS ו -12 מיקרוליטר של PS. מערבבים היטב את התמיסה עם פיפטינג ומוסיפים במהירות 30 מיקרוליטר של אקרילאמיד מופעל זה. מערבבים על שקופית עם vues מנותחים. הניחו בעדינות תלוש כיסוי קטן על התכשיר והניחו לתמיסה להתפלמר בטמפרטורת החדר למשך כשעה.

הכן כל שקופית בצורה זו מאוחר יותר. השתמש בסכין גילוח כדי לשבור את החלקות הכיסוי. ניתן לאחסן את הדגימות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בצנצנת קופלן עם PBS או להמשיך ישירות בעיבוד.

בדרך כלל העיבוד צריך להתבצע בצנצנות קופלן עם 80 מיליליטר תמיסה. ומתחת למכסה המנוע. התחל בהבהרת הרקמות באמצעות דגירה בסדרת תמיסה של מתנול אתנול, תמיסת אתנול קסילן אחד לאחד, ושוב באתנול ולאחר מכן במתנול.

כל אמבטיה אורכת חמש או 30 דקות. עיין בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, השתמש בתמיסת PBT מתנול אחד לאחד עם 2.5% פורמלדהיד למשך 15 דקות.

לאחר מכן שטפו את הטישו ב-PBT פעמיים למשך 10 דקות בכל אמבטיה. לאחר מכן, ניתן לאחסן את המגלשות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס במידת הצורך. לאחר מכן, קח עד שש שקופיות מהצנצנת ונקז את עודפי הנוזלים.

הניחו אותם על נייר טישו והוסיפו במהירות 100 מיקרוליטר של אנזים עיכול דופן תא צונן. מערבבים על הרפידות. לאחר מכן מכסים את השקופיות בתלושי כיסוי גדולים.

דגרו את המגלשות למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לח. חשוב לייעל את טמפרטורת העיכול של CO עבור כל תמיסה אנזימטית חדשה מכיוון ששלב זה הוא קריטי לצביעה הומוגנית מאוחר יותר. שטפו את השקופיות פעמיים עם PBT למשך חמש דקות בכל כביסה.

לאחר מכן מסננים את השקופיות עכשיו לכל שקופית. הוסף 100 מיקרוליטר של RNAs A ב-PBS שהושלם עם 1% טווין ודגירה על השקופיות למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס בתא לח לאחר הדגירה, שטוף את השקופיות פעמיים עם PBT כמו קודם, ולאחר מכן תקן את הרקמה שוב על ידי דגירה של השקופיות באמבט PBTF טרי למשך 20 דקות. שטפו את ה-PBTF בכביסה אחת ב-PBT למשך 10 דקות.

לאחר מכן המשך לחדירת רקמות על ידי דגירה של המגלשות ב-PBS עם 2% טווין במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. השתמש בשתי שטיפות ב-PBT כל אחת של חמש דקות כדי להסיר את התמיסה החדירה. לאחר מכן המשך עם צביעה חיסונית.

התחל עם דגירה של השקופיות בנוגדן העיקרי המעניין. יש למרוח 100 מיקרוליטר של הנוגדן המדולל ב-PBS ועם 0.2% בין כל שקופית. העבירו את השקופיות לתא לח ודגרו אותן בארבע מעלות צלזיוס למשך 12 עד 24 שעות.

שטפו את השקופיות באמבט PBT במשך שעתיים עד ארבע שעות עם נדנוד עדין בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל אחד ל-200 ב-PBS עם 0.2% בין 20 ודגרו על המגלשות למשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. אמבטיה של שעה ב-PBT עם נדנוד עדין מספיקה כדי לשטוף את השקופיות של נוגדן משני לא קשור.

לאחר מכן מכתים את ה- DNA בתמיסה של 10 מיקרוגרם למיליליטר של יודיד פרופידיום ב- PBS. הניחו להכתמה להימשך 15 דקות ולאחר מכן שטפו את השקופיות עם PBT באמצעות נדנוד עדין למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. כעת הרכיבו את השקופיות עם מדיום נגד דהייה בתוספת 10 מיקרוגרם למיליליטר של פרופידיום יודיד.

לאחר שנתנו לתמונה מוגדרת למשך שעה, ההחלקות על מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות עדשת טבילה של 63x גליצרול. לכן במהלך רכישת תמונה, זה קריטי לשמור על הגדרות הסריקה זהות בין הדגימות כדי לאפשר כימות השוואתי ולהשתמש במצב זיהוי ליניארי. מאוחר יותר לשחזר את התמונות הסדרתיות למבנים תלת מימדיים, לפלח כל גרעין מעניין ולהשתמש בתוכנת עיבוד תמונה תלת מימדית כדי לכמת את האותות.

באמצעות פרוטוקול הכנה חזק בקנה מידה גדול, כל Mount Vues ישמור על המבנה התלת מימדי שלו. מבנים תת-תאיים נראים בפירוט רב כפי שניתן לראות עם כרומטין. בעת צביעת DNA, כרומטין הטרו מופיע כמוקד בהיר ומוגדר היטב ללא צורך ביישום דה-קונבולוציה.

פרוטוקול זה מאפשר צביעה חיסונית מקבילה עם מספר נוגדנים בסבב אחד. לדוגמה, הסמן המתירני הקשור לכרומטין U, H שלוש ליזין מתילציה ארבע, והסמן הקשור לכרומטין H שלושה מונומתיל ליזין 27 זוהו שניהם בניסוי אחד על שקופיות שכפול נפרדות לניתוח דינמיקת כרומטין. טכניקה תואמת נוספת היא פלואורסצנטית C שתי הכלאות או דגי דגים ל -45 s.ריבוזומלי.

חזרות DNA שימשו להגדרת אזורי ארגון גרעיני. הגשושית סומנה ישירות עם Alexa 4 88, וה-DNA היה מונה מוכתם לצורך ניתוח איפיקציה, חשוב מאוד לבדוק דילולים שונים וזמני דגירה שונים כדי לזהות את התנאים שנותנים איתות חזק והוגני עם הנמוך ביותר האפשרי. וחרטה על הגוף.

מכיוון ששיטה זו משיגה שימור מצוין של הרקמה וחדירה אופטימלית לניתוח תא בודד של ארגון הכרומטין, היא סוללת את הדרך למדענים בתחום הביולוגיה של תאי הצמח או אפיגנטיקה של צמחים לחקור ארגון גרעיני או תת-תאי ברמת תא בודד ובהקשר האנושי השלם.