ניתוח השוואתי של מבנה RNA של תעתיקים צעירים ובוגרים ב-Saccharomyces cerevisiae

חקרנו עיבוד RNA קוטרנספריפטוני, וזה כולל כיצד RNA מתפתח כשהוא יוצא מה-RNA פולימראז שמסנתז אותו. לפני השיטה הזו, לא יכולנו לעקוב אחרי קיפול ה-RNA במהלך הסינתזה, וזה עיכב אותנו במחקר שלנו. אז השיטה החדשה הזו מתגברת על הפערים האלה.

CoSTseq פותחה כדי לחקור קיפול RNA מתהום בשמרים. הוא יעיל במיוחד לניתוח RNA בשפע גבוה. כדי להתחיל, יש לחסן את זן Saccharomyces cerevisiae BY4741 ב-50 מיליליטר של מדיום YPAD ולדגור ב-30 מעלות צלזיוס עם ניעור במהירות של 200 סיבובים לדקה עד שהתרבית מגיעה לשלב אמצע הלוגריתם.

לאסוף כשלושה מיליליטר של תרבית שמרים בצפיפות אופטית של 1.8 יחידות וצנטריפוגה בטמפרטורה של 2,500 x גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגה מקוררת מראש. זרוק את הסופרנטנט למיכל פסולת. החזירו את הכדור ל-10 מיליליטר של PBS קר וצנטריפוגה שוב ב-2,500 x g למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

הסר את הסופרנטנט והשאיר את כדור השמרים על קרח. החזירו בזהירות את כדור השמרים ל-10 מיליליטר של סרקוסיל קר 0.5% ללא בועות. דגרו את השמרים המוחזרים על קרח במשך 20 דקות כדי לאפשר חדירה, ואז גררו את התאים בטמפרטורה של 400 x גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והחזירו את תאי השמרים החדירים ב-100 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז באמצעות פיפט P-1000.

הכינו תמיסה עובדת של בופר שעתוק 2.5X עם דיתיותרייטול עם חמישה מילימולר שנוספו זה עתה, וחממו מראש את בופר הבדיקה המבנה של 2.5X ל-30 מעלות צלזיוס. בצינור נקי בנפח שני מיליליטר, הוסף את כל רכיבי התגובה הנדרשים וערבב היטב. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר מתאי השמרים המוכנים לצינור התגובה ודגרו אותם במערבל התרמי בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, עם ניעור במהירות של 500 סיבובים לדקה למשך שתי דקות.

לאחר מכן הוסף במהירות 200 מיקרוליטר של בופר המבנה 2.5X שחומם מראש, ו-25 מיקרוליטר של תגובת דימתיל סולפט בו-זמנית. סחרור את הצינור בעדינות בשני פולסים והחזר אותו לאינקובטור עם 30 מעלות צלזיוס ו-500 סיבובים לדקה. המשיכו לדגור על המיקסר התרמי במשך ארבע דקות, עם מרווח של 30 שניות בין הדגימות.

הכינו את בופר העצירה והשטיפה מראש והניחו אותם על קרח עד השימוש. עצור את מתילציית דימתיל סולפט על ידי הוספת מיליליטר אחד של בופר עצור לצינור התגובה. כעת צנטריפוגה את הדגימות המסומנות עם דימתיל סולפט בעוצמה 3,500 x g למשך חמש דקות בצנטריפוגה לפני קירור.

לאחר הסיבוב, השליכו את הסופרנטנט למיכל פסולת מתאים. הוסיפו מיליליטר אחד של בופר שטיפה מקורר לפלט והחזירו את הכדור. חזור על הצנטריפוגה ב-3,500 x גרם במשך חמש דקות.

המשך מיד להפקת RNA ואל תקפיא את כדור השמרים. החזירו את כדור השמרים המסומן בדימתיל סולפט ב-600 מיקרוליטר של בופר ליזיס RNA, ואז העבירו את ההשעיה לצינור המכיל 40 מיקרוליטר של 20% נתרן דודציל סולפט. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, עם ניעור במהירות של 950 סיבובים בדקה.

לאחר מכן, בצע חילוץ פנול-כלורופורם של RNA בהתאם להליך הסטנדרטי. מערבולות את חרוזי הסטרפטווידין המגנטיים והעבירו 44 מיקרוליטר מהחרוזים לצינור חדש עבור כל דגימה של 80 מיקרוגרם RNA כולל. הנח את החרוזים המגנטיים על מתקן מגנטי עד שהחרוזים מתיישבים.

לאחר הסרת בופר האחסון, החזירו את החרוזים למיליליטר אחד של בופר לפני שטיפה A. כעת דגרו את המתלה במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, ואז מגנטיזים והסירו את הסופרנטנט. לאחר הכביסה, תלו מחדש את החרוזים ב-88 מיקרוליטר של בופר קישור 2X. העבר 80 מיקרוליטר מהמתלה לצינור סטרילי בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 80 מיקרוגרם של דגימת RNA ביוטינילציה ב-80 מיקרוליטר.

סובב את תערובת הדגימה על סיבוב במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מניחים את הצינור על המדף המגנטי כדי לאסוף את הזרימה המכילה RNA בוגר ולשמור אותו למשקעים לביצוע בחירת RNA בוגרים באמצעות זרימת עבודה של DMS-MaPseq. לאחר מכן, שטפו פעמיים את קומפלקס ה-RNA שנולד עם 500 מיקרוליטר של בופר מלח גבוה.

לאחר מכן שטוף פעם אחת עם 500 מיקרוליטר של בופר קישור 1X, ואחריו שטיפה אחרונה עם 500 מיקרוליטר של בופר מלח נמוך. עכשיו הוסיפו 300 מיקרוליטר של RNA לקומפלקס החרוז=המתהווה, החזירו אותו היטב ודגרו על המיקסר התרמי במשך חמש דקות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו 60 מיקרוליטר של כלורופורם, מערבולת, ודוגרו במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

צנטריפוגה את הדגימה בעוצמה של 14,000 x גרם למשך חמש דקות בצנטריפוגה שלפני הקירור. לבסוף, להעביר את הפאזה המימית העליונה של כ-180 מיקרוליטר לצינור איסוף חדש. השליכו את הפאזה האורגנית שנותרה, והשאירו מאחור את החרוזים והתמיסה המימית שנותרה.

לאחר טיהור ה-RNA המתהווה, בצע תעתיק הפוך בהחלפת תבניות, קשור את מתאם ה-5' ובחר ספריות לריצוף. ההמחשה של מוצרי PCR הניסיוניים על ג'ל 1% אגרוז הראתה היווצרות דימר פריימר מינימלית ומריחת בסיס אופיינית של כ-300 זוגות בסיסים למעקב אחר רצף מבני קו-שעתוק או ספריות CoSTseq ו-DMS-MaPseq. האלקטרופרוגרמה של דגימת CoSTseq אחת אישרה את התפלגות גודל הספרייה עם שיא של סביב 285 זוגות בסיסים.

יישור קריאה של mRNA ב-ASC1 חשף כי ספריית CoSTseq כללה כיסוי על פני האינטרון, מה שמאשר שה-RNA הוא בתחילת דרכו. לעומת זאת, ספריית DMS-MaPseq חסרה כיסוי אינטרונים, מה שמעיד שה-RNA בוגר. מטריצת קיפול השעתוק של 18S pre-rRNA גילתה כי תגובתיות ה-DMS הראתה שינויים פתאומיים כאשר פולימראז ה-RNA התקדם ממיקום 790 ל-811 לאורך מיקום ה-rDNA.

ניתוח תגובתיות DMS של mRNA ADH1 הראה פרופילים דומים בין צורות מתהוות ובוגרות, מה שמעיד על אזורים של יציבות מבנית. לעומת זאת, mRNA ב-SSA2 הציג אזורים של תגובתיות DMS שונה בין צורות מתחילות לבוגרות, מה שמרמז על שינויים מבניים במהלך ההבשלה. באמצעות CoSTseq, חוקרים יכולים לקבוע מבנים משניים של RNA מתפתחים ב-vivo ומיקום ה-RNA פולימראז לאורך תעתיקי ה-RNA.

ל-CoSTseq יש שלבים רגישים לזמן, משתמש בכימיקלים רעילים. עדיף לעבד לא יותר משתי דגימות בו זמנית. מתוך סך ה-RNA שנוצר מ-CoSTseq, ניתן להשתמש ב-RNA לא ביוטינילציה לחקירת מבנה בוגר במקביל באמצעות DMS-MaPseq המסורתי.