Name: Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: למד טכנולוגיית מיקרואריי לניתוח ביטוי גנים ב-Saccharomyces cerevisiae תחת מתח חמצוני. פרוטוקול זה מלמד סטודנטים טכניקות מולקולריות מתקדמות כולל בידוד RNA, סינתזת cDNA והכנת cRNA מתויג ביוטין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<p class="jove_content"&gt; אוניברסיטת ורמונט, ורמונט גנטיקה רשת. פרסום זה התאפשר על ידי גנטיקה ורמונט רשת, באמצעות מספר גרנט P20 RR16462 מהתוכנית ברין מספר גרנט P20 RR16462 מהתוכנית INBRE theNational המרכז לחקר משאבי (NCRR), רכיב של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) . תוכנו הם באחריות הבלעדית של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות הרשמיות של NCRR או NIH.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; ברצוננו להודות לכל המשתתפים שלנו מוסדות הושטת לשיתוף פעולה שלהם תשומה זיקוק זה Castleton מודול State College, Green Mountain College, State College ג&#39;ונסון, לינדון State College, מרלבורו קולג&#39;, המכללה במידלברי, נוריץ&#39; אוניברסיטת קולג&#39; סנט מייקל.</p&gt;

<ol><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., Kao, C. M., Carmel-Harel, O., Eisen, M. B., Storz, G., Botstein, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Mol Biol Cell. 11, 4241-4257 (2000).</li>
<li>D'Autréaux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+as+signalling+molecules%3A+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).</li>
<li>Shenton, D., Smirnova, J. B., Selley, J. N., Carroll, K., Hubbard, S. J., Pavitt, G. D., Ashe, M. P., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+translational+responses+to+oxidative+stress+impact+upon+multiple+levels+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global translational responses to oxidative stress impact upon multiple levels of protein synthesis.</a> J Biol Chem. 281, 29011-29021 (2006).</li>
<li>Godon, C., Lagniel, G., Lee, J., Buhler, J. M., Kieffer, S., Perrot, M., Boucherie, H., Toledano, M. B., Labarre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+H2O2+stimulon+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 273, 22480-229 (1998).</li>
<li>Vermont Genetics Network. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microarray+Outreach%22">Microarray Outreach</a>. , (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Affymetrix+GeneChip+Expression+Analysis%3A+Technical+Manual%22">Affymetrix GeneChip Expression Analysis: Technical Manual</a>. , Affymetrix. Santa Clara, CA. (2004).</li>
<li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+Bioinformatics+Resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources.</a> Nature Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Dennis, G. Jr, Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAVID%3A+Database+for+Annotation%2C+Visualization%2C+and+Integrated+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery.</a> Genome Biol. 4, P3-P3 (2003).</li>
</ol>

ההפקה של המאמר וידאו זה היה בחסות EMD-Millipore.

<p class="jove_step"&gt; יישומים משמעות.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; גנטיקה ורמונט תוכנית רשת Outreach, באוניברסיטת ורמונט, עורכת ראשון הושטת לשמונה מכללות בגרות שותף ברחבי המדינה. המטרה של VGN Outreach Core היא לחשוף סטודנטים במדינת ורמונט הטכנולוגיה המדינה-of-the-art &amp; משאבים מדעיים באמצעות הידיים על חוויות. המודול microarray תיאר פותחה בשנת 2003 שודרג לאחר מכן. זה כבר הציע כמנה מיני או להשתלב בתכנית הלימודים במעבדה קיימת בכל המוסדות המשתתפים.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; פרויקט זה, בין האוניברסיטה ליבות מחקר לתואר ראשון במכללות, מקדמת שיתופי פעולה בתחום החינוך והמחקר. Microarray הושטת ברחבי המדינה שיפרה הלימודים ויצרה מחקר הזדמנויות הרשתות עבור מתקני הגרעין, סגל וסטודנטים.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; כפי לתואר ראשון בפקולטה לאמץ את התוכנית הם עודדו עיצוב ייחודי ניסויים בתנאי שלא מתאימים GeneChips Affymetrix ו ביאור זמין. כל המידע עבור מודול זה כולל במדריך מעבדה, הפניות מצגות PowerPoint זמינים באופן מקוון (ורמונט גנטיקה רשת, 2008).</p&gt;<p class="jove_step"&gt; צעדים קריטיים:</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Spheroplasting:</em&gt; חשוב לשמור spheroplasting מוצלח מתחת למיקרוסקופ. השימוש SDS הוא מאוד מועיל כפי שהוא גורם לנפיחות שמרים וכתוצאה מכך spheroids. חשוב לשים לב, כי התאים ניצני טופס spheroids גם כן. אם spheroplasting חלקי הוא ציין, טיפול ממושך עם lyticase מומלץ.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; גלולה ניקוי:</em&gt; במהלך התגובה המשקעים צעד הבאים כביסה אתנול, קל מאוד לאבד את גלולה cDNA. בזהירות רבה ותשומת לב קפדנית על גלולה הכרחי.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; יישום מים למרכז הממברנה:</em&gt; במהלך הצעד elution RNA מן הקרום, חשוב &quot;להשפריץ&quot; 30 μl מים ישירות למרכז של קרום סיליקה. אם זה לא נעשה, בעמודה ניתן centrifuged ואת elutant וכתוצאה מכך ניתן להחיל מחדש את קרום סיליקה שוב. זה יכול להיות חזר פעמים רבות ככל הדרוש.</p&gt;<p class="jove_step"&gt; שינויים ותחליפים המוצר:</p&gt;<ol&gt;<li&gt; אלטרנטיבי RNA לנקות העמודות ניתן להחליף. דוגמאות לכך הן ה-USB-הכנה בקלות הטהורה Invitrogen קישור RNA הערכה, ואת הרנ&quot;א אומגה לנקות הערכה עד כמה שם.</li&gt;<li&gt; Pombe Schizosaccharomyces הוא שמרים אופציונלי. GeneChip Affymetrix מכיל גם הגנום על אותו שבב</li&gt;<li&gt; טיפולים שונים פעמים ניתן להשתמש. זה עשוי לכלול טיפולים תרופתיים, טיפולים טמפרטורה, נוגדי חמצון וכו &#39;פעמים הטיפול עשוי גם להיות מותאם.</li&gt;<li&gt; טיפול DNase לא ייתכן שיהיה צורך כי בשיטות המתוארות להעסיק את השימוש פריימר אוליגו (DT).</li&gt;<li&gt; זה לא נדרש לבצע elution כפול של RNA את הטור עם aliquot 30 μl אותו. פעם הוא כמעט תמיד מספיק. זה הציע להבטיח התאוששות מלאה מתקבל. בנוסף, המים המשמשים elute רנ&quot;א מהעמודה ניתן מראש מחומם ל 65 ° C כדי לשפר עוד יותר את היכולת לשחזר RNA מהעמודה סיליקה.</li&gt;<li&gt; שיטות רבות זמינות לכמת RNA. Eppendorf ו Nanodrop רק נבחרו קלות השימוש שלהם ונבדק דיוק.</li&gt;<li&gt; ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose רבים להתבצע באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי. E-Gel אינו נדרש אך רצוי כי זה RNase חינם ואינו דורש מיצוק ג&#39;ל זמן ההמתנה.</li&gt;<li&gt; מידע עבור סידור המוצרים סופקה. עם זאת, ריאגנטים בכלל רבים ניתן להזמין מיצרנים מרובים.</li&gt;<li&gt; אחת ריאגנטים מחזור cDNA ניתן לרכוש בנפרד, אם כי הוא יותר חסכוני.</li&gt;<li&gt; ישנם שני שיטות הכנה היעד אבל אנחנו מרגישים זו מציעה הזדמנויות ללמד יותר עבור התלמיד.</li&gt;</ol&gt;

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; כללי ציוד מעבדה</strong</td<td<strong&gt; החברה</strong</td<td<strong&gt; מספר מוצר</strong</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Spetrophotometer</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thermocyler</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrifuge</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; וורטקס</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מערבבים צלחות (2)</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-10s pipettors</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-20 של pipettors:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pipettors P-200 של:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-1000 של pipettors:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מצלמה transilluminator</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; ציוד - מומלץ</strong</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E-Gel Apparatus</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; G6000-08</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E-ג&#39;ל</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; G6018-02</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axygen 1.7 מ&quot;ל. ברור</td<td&gt; Krackler</td<td&gt; 383-MCT175C</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axygen 0.5 צינורות מ&quot;ל ברור</td<td&gt; Krackler</td<td&gt; 383-MCT060C</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axygen 2ml ללכוד צינורות</td<td&gt; Krackler</td<td&gt; 383-MCT200NC</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; תיבות של P-10 טיפים לאמנות:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT10XL</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; תיבות של P-100 טיפים לאמנות:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT200</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; תיבות של P-20 טיפים לאמנות:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT20</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; תיבות של P-1000 טיפים לאמנות:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT1000</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; שמרים Chips</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; כללי ציוד מעבדה</strong</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 25 מ&quot;ל pipets-חד פעמי סטרילי</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pipets-5 מ&quot;ל חד פעמי סטרילי</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microfuge מתלים צינור</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KimWipes:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מעבדה מעילים</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מערבבים ברים</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; תרבות צלוחיות</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; לולאות Innoculating</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sharpies</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; כפפות</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; החיטוי קלטת</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Stirrer ברים</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; ריאגנטים</strong</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 30% מימן פראוקסיד</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-386790?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 386790</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HBSS ללא Ca, Mg, או צבע</td<td&gt; סיגמא אולדריץ</td<td&gt; H6648-100 מ&quot;ל</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Qiagen Rneasy מיני קיט:</td<td&gt; Qiagen</td<td&gt; 74104</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Qiagen DNase קיט:</td<td&gt; Qiagen</td<td&gt; 79254</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Rnase Remover</td<td&gt; Denville מדעי</td<td&gt; D1180</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Harleco אלכוהול 100%</td<td<a href="http://www.emdchemicals.com/harleco-alcohol/EMD_CHEM-65347/p_uuid?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 65347</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; אנצו IVT Kit</td<td&gt; אנזו</td<td&gt; ENZ-42655-10</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lyticase: בקבוק אחד</td<td&gt; VWR</td<td&gt; IC19012310</td</tr&gt;<tr&gt;<tdמים&gt; תרבות כיתה Cell</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-4.86505?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 4.86505</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; שמרים התרבות:</td<td&gt; ATCC</td<td&gt; 18824</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; YPD אבקת מרק</td<td<a href="http://www.emdchemicals.com/products/EMD_CHEM-4.85040?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 4.8504</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; D (+) גלוקוז, נטול מים</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-346351?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 346351</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; סורביטול</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-56755?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 56755</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EDTA</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-4005?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 4005</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SDS פתרון, 20%</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-7990-OP?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 7990-OP</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; גלולה Paint</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-69049?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 69049</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PCI RNase DNase חינם (7 aliquots):</td<td&gt; פישר</td<td&gt; AC32711-500</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 7.5 NH4OAc</td<td&gt; פישר</td<td&gt; ICN1987 5980</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פיצול חוצץ (200 מ&quot;מ טריס-Acetate, pH 8.1, 500 מ&quot;מ KOAc, 150 מ&quot;מ MgOA)</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Trizma Base</td<td&gt; Fiaher</td<td&gt; 50-899-90034</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KOAc</td<td&gt; פישר</td<td&gt; NC9757725</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgOA</td<td&gt; פישר</td<td&gt; NC9681042</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Loading Dye</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; 10482055</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PCR סמנים</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-69278-3?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 69278-3</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; שלב הנעילה ג&#39;ל</td<td&gt; פישר</td<td&gt; FP2302820</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; אחת מחזור cDNA Kit</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; A10752-030</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; כולל;</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; א coli DNA Pol</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; של dNTP</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; T4 DNA Pol.</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; T-7 oligod (T)</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EDTA 0.5ml pH 8.0</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; סטרנד ראשון הצפת</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; א קולי RNaseH</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; סטרנד השנייה הצפת</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; א האנזים דנ&quot;א קולי</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; עילי II</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DTT</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;

microarray ניתוח עבור saccharomyces cerevisiae</em

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

בפרוטוקול זה, ביטוי גנים שמרים (Saccharomyces cerevisiae) משתנה לאחר חשיפה סטרס חמצוני הנגרם על ידי תוספת של מי חמצן (H 2 O 2), סוכן חמצון. בניסוי, שמרים הוא גדל במשך 48 שעות במרק YPD 1/2X המכילה גלוקוז 3X. התרבות מחולק שליטה וקבוצת טיפול. התרבות הניסוי שטופלו 0.5 מ&quot;מ H 2 O 2 ב הנקס שנאגרו מלוחים (HBSS) במשך שעה 1. התרבות שליטה שטופלו HBSS בלבד. סך RNA מופק תרבויות והן מומר מוצר ביוטין שכותרתו Crna באמצעות תהליך רב שלבי. המוצר הסופי הוא סינתזה נלקח חזרה מתקן Core UVM microarray ו - הכלאה של GeneChips שמרים Affymetrix. הביטוי הנתונים וכתוצאה מכך גן מועלים לתוך תוכנת ניתוח הנתונים ביואינפורמטיקה.

בפרוטוקול זה, הגן ביטוי שמרים (<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;) משתנה לאחר חשיפה סטרס חמצוני הנגרם על ידי תוספת של מי חמצן (H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt;), סוכן חמצון.

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

בפרוטוקול זה, ביטוי גנים בשמרים (*Saccharomyces cerevisiae*) משתנה לאחר חשיפה לעקה חמצונית המושרה על ידי הוספת מימן...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכיר לסטודנטים למדעים לתואר ראשון את טכנולוגיית המיקרו-מערכים (microarray) באמצעות בחינת הבדלי הביטוי בשמרים תחת עקה חמצונית. הדבר משיג תחילה על ידי בידוד RNA כולל מתרביות שמרים שעובדו עם מי חמצן ומהביקרים שלא עובדו. השלב השני של הפרוצדורה הוא הפקה וניקוי של cDNA מדגימות RNA אלו.לאחר מכן משתמשים ב-CDNA כדי להכין CRNA המסומן בביוטין באמצעות תמלול in vitro. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא פרגמנטציה של ה-CRNAs המסומנים בביוטין לצורך היברידיזציה לשבבי גנים של שמרים מבית AFI metrics. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את הבדלי הביטוי בשתי דגימות השמרים, ומאמצעות ביו-אינפורמטיקה להדגים לסטודנטים לתואר ראשון את העוצמה של אנליזת מערכים של מיקרו-שבבים (microarray).צוות ההסברה של רשת הגנטיקה של ורמונט (Vermont Genetics Network Outreach) הגה לראשונה את הרעיון לשיטה זו כאשר הוטלה עליו המשימה להנגיש טכנולוגיית מיקרומערכים (microray) לסטודנטים למדעים ברחבי מדינת ורמונט, במטרה לשפר את השכלתם המדעית. עד כה, שיטה זו הועברה למספר אתרים בשמונה מכללות לתואר ראשון ברחבי המדינה. לפיכך, היתרון המרכזי בשימוש במערכי לימוד של מיקרומערכים הוא היכולת להנחית קבוצה של אנשים בטכניקות כלליות של ביולוגיה מולקולרית הנמצאות בשימוש יומיומי במעבדה.בנוסף, אנו משתמשים בכך כדי להורות לסטודנטים ולמורים כאחד, וכן לקבוצות שלנו. בפועל, יש לנו סטודנטים ופרופסורים העובדים יחד על אותו פרויקט. הם לומדים טכניקות מסוימות הדורשות מיומנות גבוהה, כגון טיפול ב-RNA, שאינו משימה פשוטה.הם לומדים כיצד להשקיע DNA באמצעות ריאגנטים לוויזואליזציה. הם מקבלים הזדמנות להשתמש בטכניקות אותן הם יפגשו בלימודי תואר שני או במעבדות מולקולריות יומיומיות. אף ששיטה זו מתאימה להשגת תובנות על עקה חמצונית ושמרים, היא בהחלט ישימה עבור אורגניזמי מודל אחרים ומערכות ביולוגיות אחרות שתרצו לבחון.שינויים בביטוי גנים מתרחשים בין אם הם קשורים לשינויים התפתחותיים, רעלנים סביבתיים, מצבים מחלתיים ספציפיים, וגורמים רבים נוספים. כדי לבחון את הבדלי הביטוי בשמרים הנחשפים לעקה חמצונית, תחילה מופק RNA כולל משני תרביות שמרים באמצעות ליזיס אנזימטי. תרבית אחת נחשפה לעקה חמצונית על ידי טיפול של שעה אחת ב-0.5 millimolar מימן פרוקסיד ב-hank's buffered saline, בעוד שהתרבית השנייה טופלה ב-HBSS בלבד כביקורת.התחילו בסימון של שתי מבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.7 milliliter במידע הזיהוי המתאים. העבירו 1.5 milliliters של תרבית השמרים המתאימה לכל מבחנה. סבבו את המבחנות בצנטריפוגה ב-5,000 Gs למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הצנטריפוגציה, השתמש במיקרו-פיפט כדי להסיר בזהירות ולשפוך את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע (pellet). ודא שהמשקע גדול מספיק לפני המשך הפרוצדורה. אם המשקע קטן מדי, הוסף 1.5 milliliters של תרבית לאותה מבחנה המכילה את המשקע, ולאחר מכן בצע צנטריפוגציה כדי לקבל משקע גדול יותר.שאי את הנוזל העליון באמצעות מיקרופיפטה, והסר כמה שיותר מהנוזל מעל משקע השמרים. לאחר מכן, הוסף למשקע השמרים 100 µL של SG buffer ו-30 µL של תמיסת liase וערבב באמצעות וורטקס. דגרי את שני המבחנות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במהלך הדגירה.סובבו בעדינות כל מבחנה בכל 10 דקות כדי ליצור ספרו-פלסטים. אחד השלבים הקריטיים ביותר בעת ביצוע פילוט של שמרים בשיטת הספרו-פלסטים הוא לוודא שבאמת נוצרו ספרו-פלסטים בשיעור של מאה אחוזים לאחר הטיפול. המשמעות היא שלא כל האנזימים הליטיים הם שווים.לפיכך, עליכם לוודא שהאנזים הליטי האיכותי מספק תוצאות טובות של plating לספרואידים, כלומר עליכם לקחת את הדגימות הללו, להניחן על זכוכית מיקרוסקופ ולבדוק אותן תחת המיקרוסקופ על ידי הוספה של 0.1%SDS כדי להבטיח שנוצרו פרוטופלסטים. כדי לתצפת על plating מלא של ספרואידים, טפטפו 10 µL מדגימת השמרים על זכוכית מיקרוסקופ ובחנו את הדגימה תחת המיקרוסקופ עם 1 µL של 0.1%SDS כדי לגרום לתאי השמרים להתנפח ולהפוך לכדורים מושלמים או לספרואידים. חשוב לוודא גם שתאי ניבוב יוצרים ספרואידים.אם נצפתה שקיעה חלקית של כדוריים (sphero plating), מומלץ לבצע טיפול ממושך יותר עם liase. לאחר שאישור שקיעה מלאה של כדוריים הושג עם 350 microliters של בופר BRLT לכל מבחנה, יש להוסיף 250 microliters של 100% ethanol. ודאו שהמבחנה סגורה היטב על ידי החזקת המכסה סגור, ובצעו ערבוב חזק ב-vortex למשך דקה אחת.פרוצדורה זו תשמש לליסיס של פלטות ה-Sphero. לאחר מכן, השתמש בעמודי ספין מסוג R and easy Z כדי לאסוף ולנקות את ה-RNA משתי התרביות. לבסוף, העरक את איכות ה-RNA שהופק באמצעות ג'ל agarose precast בריכוז 1.2% לאלקטרופורזה, כדי להכין CRNA מסומן בביוטין.ה-RNA הכולל שהופק מתאי השמרים משמש תחילה לסנתזת cDNA באמצעות תעתוק הפוך. לאחר הפקת ה-cDNA, הכינו מבחנות gel phase lock לשימוש בשיקוע cDNA; סובבו את מבחנות ה-gel phase lock בצנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך דקה אחת כדי להבטיח שהג'ל נמצא בתחתית המבחנה. אין לנער במערבל (vortex) את מבחנות ה-phase lock. כדי להשקיע את ה-cDNA, העבירו באמצעות פיפטה 162 µL מהשכבה התחתונה של תערובת tris buffered phenyl chloroform, isoamyl alcohol או PCI ב-pH 8.0, והוסיפו אותם ל-162 µL מהתוכן של מבחנת תגובת סנתזת הגדיל השני של ה-cDNA; בשלב זה נדרשים נפחים שווים של התערובות המימיות והאורגניות.בצעו ערבוב במכשיר וורטקס למשך חמש שניות כדי לערבב את התוכן. לאחר מכן, השתמשו במיקרופיפטה כדי להעביר את כל תערובת ה-CD N-A-P-C-I לשפופרת ה-phase lock gel. אין להשתמש בוורטקס בשפופרת ה-phase lock gel; סובבו בצנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך שתי דקות.לאחר מכן, השתמש במיקרו-פיפט כדי להעביר את השכבה העליונה מתוך מבחנת ה-phase lock gel למבחנה חדשה המסומנת בנפח 1.7 milliliter. נסה לאסוף כמה שיותר מהשכבה. הוסף למבחנת המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.7 milliliter את הרכיבים הבאים: 405 µL של 100% ethanol, 80 µL של ammonium acetate ומיקרו-ליטר אחד של pellet paint, ולאחר מכן בצע ערבוב ב-vortex.הניחו את המבחנה ב centri-fuge כאשר הציר של המבחנה פונה החוצה, וסובבו במהירות מקסימלית למשך 20 דקות. בסיום הסבוב בטמפרטורת החדר, הוציאו בזהירות את המבחנה מה-centrifuge תוך הקפדה שלא להפריע למשקע ה-CD NA. המשקע אמור להיות בצבע ורוד בשל צבע הסימון של המשקע, ובגודל של גרגיר מלח בקירוב.ובצדו של המבחנה, מתחת לציר, הניחו את כדורית ה-CD NA על קרח ועברו מיד לניקוי הכדורית. כדי להתחיל בהליך לניקוי כדורית ה-CD NA, השתמשו במיקרופיפטה P 1000 כדי להסיר בזהירות את כל הנוזל העליון (supernatant) מהמבחנה. היזהרו לא להפריע לכדורית.הוסיפו למדגם שלכם 500 µL של 80% ethanol קר לתוך הפרונטה. סגרו את הפרונטה בעדינות והפכו אותה לאט מספר פעמים. עקבו מקרוב אחר המשקע כדי לוודא שהוא אינו נפרד מדופן הפרונטה.אם המשקע הופרד, ניתן להחזירו לתחתית הפ ;השפרופה על ידי החזרת השפרופה למעמד והמתנה עד שהמשקע ישקע לתחתית, או על ידי צנטריפוגה של השפרוורה במהירות מלאה למשך 15 שניות. לאחר מכן, השתמש במיקרופיפט P 1000 כדי להסיר בזהירות את האתנול מבלי להפריע למשקע. הטה את השפרופה כדי לאפשר הסרה של כמה שיותר נוזל.הוסיפו נפח חדש של 80% ethanol קר, סגרו את המבחנה במכסה והפכו אותה באיטיות מספר פעמים. לאחר מכן, הסירו ככל האפשר את כל ה-ethanol באמצעות מיקרופיפט P 1000. סבבו את המבחנה בצנטריפוגה במהירות מרבית למשך חמש שניות.לאחר מכן, השתמש במיקרופיפטה P 10 כדי להסיר את המיקרוליטרים האחרונים של אתנול מבלי להפריע למשקע. הנח את המבחנה הפתוחה בתיבת ייבוש למשך 10 עד 20 דקות כדי לאדות את האתנול שנותר. קל לאבד את המשקע לאחר שהתייבש, לכן יש להקפיד לטפל במבחנה בעדינות ולסגור את הפקק.בסיום הייבוש, בדקו ויזואלית את המשקע המיובש כדי לוודא כי הוא נמצא במבחנה. לבסוף, השביחו שוב את המשקע המיובש ב-22 µL של RNA free water והניחו את המבחנה על קרח. ה-CDNA זה משמש לאחר מכן להכנת CRNA מסומן בביוטין באמצעות שעתוק in vitro בעזרת ערכת Enzo BioArray.לאחר שה-cRNA המסומן בביוטין נוקה ונמדד, הוא עובר פרגמנטציה לצורך הכנת המטרה. ברגע שה-cDNA נוצר, אנו משתמשים בשיטת שעתוק in vitro סטנדרטית כדי להפיק cRNA ביוטינילי. ה-cRNA חייב לעבור פרגמנטציה לפני שניתן להחיל אותו על שבב המיקרו-מערך.כדי להתחיל בהליך זה, העבירו כמות שווה ל-5 µg של CRNA לשפופרת PCR של 0.5 mL מסומנת. הוסיפו מספיק מים נקיים מ-RNases כדי להביא את הנפח הכולל ל-16 µL, ולאחר מכן הוסיפו לשפופרת 4 µL של fragmentation buffer בריכוז 5x. הנפח הכולל בשפופרת צריך להיות 20 µL.ערבבו את המבחנה בוורטקס וסובבו אותה בצנטריפוגה למשך 10 שניות. לאחר מכן, דגרו את המבחנה בטמפרטורה של 94 °C למשך 30 דקות. במכשיר תרמוסייקלר, הניחו את המבחנה על קרח עם סיום הדגירה.לאחר מכן, ה-CRNA המקטע והבלתי-מקטע מכל דגימה נבחנים באמצעות אלקטרופורזה בגל AROS מוכן בריכוז של 1.2%. עם סיום ההרצה, הג'ל מוצג על גבי טרנסלומינטור ותמונה נלכדת. תוצר הסינתזה הסופי עובר היברידיזציה לשבבי גנים של שמרים מסוג atric, ותוצאות מייצגות מניתוח המיקרו-מערך מוצגות כאן.איור ראשון זה הוא דוגמה לתמונה סרוקה של שבב גנים של שמרים מבית atrics, שהופקה על ידי תוכנת ההפעלה של שבב הגנים של atrics. זהו תרשים פיזור דו-ממדי של כל התעתוקים הגנטיים, כ-6,700 גנים, המשווה בין נתוני שמרים של קבוצת ביקורת לקבוצת טיפול. כל נקודה מייצגת גן בודד.גנים הצבועים בסגול מצביעים על גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי, בעוד שגנים הצבועים באדום אינם כאלה. בדוגמה זו, מרבית הגנים בעלי הביטוי הדיפרנציאלי הם אלה המעורבים בבקרת מחזור התא, כפי שעולה מתיאוריהם. תרשים זרימה זה, מתוך מאגר המידע להדמיית אנוטציה וגילוי אינטגרטיבי, ממחיש גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי במסלול ביולוגי פגוע.הגנים המסומנים בכוכבית אדומה מצביעים על הגנים בעלי ביטוי מופחת (downregulated) במסלול המיוטי. לבסוף, מוצגות כאן תוצאות מייצגות של תרשים געש (volcano plot) שהופק באמצעות תוכנת geo species gene sifter. דגימות הבקרה והדגימות המטופלות הושוו עם ערך סף של P-value של 0.05 וערך סף של שינוי בביטוי של 1.5 fold.בחרנו להשתמש בשמרים כיוון שקל לגדלם במהירות, אך הבנו כי החלק הקריטי ביותר בעבודה עם שמרים הוא למעשה יצירת פלטי ספרופלאסטים (sphero plating) תקינים. אחד הדברים שאנו מעוניינים למנוע בניסויי מיקרו-מערך (microarray) הוא עיכול חלקי, שיוביל לכך שרק תאי ספרופלאסט הנמצאים בשלב G1 או בשלב G2/M יעברו פלטינג. במצב כזה, ניסוי המיקרו-מערך יבוצע על שמרים הנמצאים בשלב שכפול מסוים.נקודה מסובכת נוספת שאנו מנסים להבהיר בתרגיל זה היא שהשקיעה של DNA היא נושא שבו מדברים מדי יום, אך היא לאו דווקא פשוטה לביצוע. במודול שלנו השתמשנו למעשה במבחנות ייעודיות ובחומרי ויזואליזציה. כך אנו יכולים לסובב את ה-DNA למטה ולהנחית את השקיעה באופן נראה, מה שמקל על התלמידים והמורים כאחד.כך שניתן להשתמש בו בכל השלבים של עבודת DNA ו-RNA לאחר פיתוחו. מודול זה סלל את הדרך עבור סגל במוסדות לתואר ראשון לחקור, אולי תוך בחינת אורגניזמי מודל אחרים או משטרי טיפול אחרים שעשויים להתאים לתכניות הלימוד הקיימות או אולי למסגרת תחומי המחקר האישיים שלהם. כדי לתת לכם דוגמה לחלק מהשינויים שבוצעו, היה אתר אחד שבחן את השפעות הטיפול בהרביציד על שמרים, אתר אחר שבחן טיפול ב-LAMP IDE בשמרים, בעוד שאתר שלישי בחן שינויים התפתחותיים בקו תאים של יונקים שמעניין אותם במיוחד.ולסיום, אתר אחר בחן את ההשפעה של מקורות אור דיפרנציאליים על צמחי arabidopsis. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן הקמתו של ניסוי microray עם סטודנטים למדעי המדעים לתואר ראשון, כולל בידוד RNA כולל משמרים, הפקת cDNA ופרגמנטציה של cRNA מסומן בביוטין. חוויות מעשיות עם טכנולוגיות ברמה גבוהה זו מסייעות בחיזוק וביסוס ההשכלה המדעית בתואר הראשון.

microarray-analysis-for-saccharomyces-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

GFP-Fusion חלבונים נמצאים בשימוש נרחב כדי להמחיש האברונים ידי מיקרוסקופיה confocal. אולם, ההקרנה של מוטציות המשפיעות על המורפולוגיה של האברונים בדרך כלל דורש mutagenesis הפרט היא זמן רב. הנה, אנחנו מדגימים שיטה לשלב בו זמנית אברון-GFP סמנים כמעט 5,000 שאינם חיוניים גנים בשמרים.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

ניתוח microarray נערך כדי לקבוע פרופילים של ביטוי...

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

פרוטוקול זה מתאר הליך ניסיוני לביצוע...

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בעזרת RNA-seq לנטר את רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך התגובה שתקבעו של cerevisiae ס תאים. בשיטה זו ניתן להתאים לנתח ביטוי גנים במהלך כל תגובה תאית.

מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה

הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על כימות ברמת הגנום של mRNA החדש מסונתז מטוהרים מתאי שמרים עם 4-thiouracil תוויות. שיטה זו מאפשרת למדוד את סינתזת mRNA חשיפות מהשחתה mRNA ומספק, לפיכך, מדידה מדויקת של RNA פולימראז II שעתוק.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

השפעה הדדית באמצעות רצף (RH-seq) היא שיטה חדשה ורבת עוצמה למפות את הבסיס הגנטי של הבדל תכונה בין מינים. בריכות המייזוליטיס נוצרות על ידי הטרנספורזיס והכושר שלהם מתבצע באמצעות הצמיחה התחרותית באמצעות רצף ברמה גבוהה. ניתוח הנתונים הנובעים מנקודות גנים שבבסיס התכונה.

מיפוי גנטי של הבדלי התרמוסבילות בין מינים של שמרים באמצעות הגנום ההופכי לניתוח המייזוליסיטי

צוואר בקבוק במחזור ' עיצוב-לבנות בדיקה ' של הנדסת חיידקים היא המהירות שבה אנחנו יכולים לבצע מסכי פונקציונלי של זנים. אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה לסינון המתח המוחל על מאות אלפי תאים שמרים לכל ניסוי העושה שיטה ברצף RNA מבוסס droplet.

תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet

פרוטוקול זה מציג שיטת בידוד כרומטין ספציפית ללוקוס המבוססת על רקומבינציה ספציפית לאתר כדי לטהר מוקד גן בעל עניין של עותק יחיד בהקשר הכרומטין הטבעי שלו משמרים ניצנים, Saccharomyces cerevisiae.

עותק יחיד של גן לוקוס כרומטין טיהור ב Saccharomyces cerevisiae

המבנה המשני של ה-RNA נצפה בעיקר ב-RNA בוגר בשיטות בדיקת מבנה. רצף מעקב מבנה קו-טרנספריפליונלי (CoSTseq) מאחד את ריצת הגרעין, ששימשה לחקר מיקום הפולימראז על RNA מתהווה, עם חקירת מבנה. כך CoSTseq מאפשר תצפית על מבנה ה-RNA המשני ב-RNA תחת שעתוק פעיל.

ניתוח השוואתי של מבנה RNA של תעתיקים צעירים ובוגרים ב-Saccharomyces cerevisiae

למד טכנולוגיית מיקרואריי לניתוח ביטוי גנים ב-Saccharomyces cerevisiae תחת מתח חמצוני. פרוטוקול זה מלמד סטודנטים טכניקות מולקולריות מתקדמות כולל בידוד RNA, סינתזת cDNA והכנת cRNA מתויג ביוטין.

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae

גלה סרטונים נוספים