Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae
7 באפריל 2011
בפרוטוקול זה, הגן ביטוי שמרים ( Saccharomyces cerevisiae) משתנה לאחר חשיפה סטרס חמצוני הנגרם על ידי תוספת של מי חמצן (H 2 O 2), סוכן חמצון.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להכיר לסטודנטים למדעים לתואר ראשון טכנולוגיית מיקרו-מערך על ידי בחינת הבדלי הביטוי בשמרים העוברים מתח חמצוני. זה מושג על ידי בידוד RNA כולל מתרביות שמרים שטופלו במי חמצן ובבקרות הלא מטופלות. השלב השני של ההליך הוא ליצור ולטהר CDNA מדגימות RNA אלה.
לאחר מכן משתמשים ב-CDNA להכנת CRNA עם תווית ביוטין באמצעות שעתוק במבחנה. השלב האחרון של ההליך הוא פיצול של ה-CRNAs המסומנים בביוטין לצורך הכלאה לשבבי גן השמרים של מדדי AFI. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את הבדלי הביטוי בשתי דגימות השמרים ובאמצעות ביואינפורמטיקה מדגימות את כוחו של ניתוח מיקרו-מערך לסטודנטים לתואר ראשון.
לצוות ההסברה של רשת הגנטיקה של ורמונט היה לראשונה הרעיון לשיטה זו כאשר הם הופקדו על אספקת טכנולוגיית מיקרו-קרניים לסטודנטים למדעים ברחבי מדינת ורמונט על מנת לשפר את החינוך המדעי שלהם. עד כה שיטה זו הועברה למספר אתרים בשמונה מכללות לבגרות ברחבי המדינה. אז היתרון העיקרי של שימוש במיקרו-ריי של מודולי הוראה, זה נותן לנו את היכולת ללמד טכניקות ביולוגיה מולקולרית כלליות המשמשות מדי יום ברחבי המעבדה לקבוצה של אנשים.
ואנחנו גם יכולים להשתמש בזה כדי ללמד תלמידים ומורים כאחד ואת הקבוצות שלנו. למעשה יש לנו סטודנטים ופרופסורים שעובדים יחד על אותו פרויקט. הם לומדים טכניקות מסוימות שדורשות עדינות רבה, כמו טיפול ב-RNA, שזו משימה לא קלה.
הם לומדים כיצד לזרז DNA באמצעות ריאגנטים להדמיה. הם למעשה זוכים להשתמש בטכניקות שהם הולכים להיתקל בהן בלימודים מתקדמים או במעבדות ביולוגיה מולקולרית יומיומיות. למרות ששיטה זו מתאימה לקבלת תובנה לגבי עקה חמצונית ושמרים, היא בהחלט ישימה לאורגניזמים מודלים אחרים ומערכות ביולוגיות אחרות שאולי תרצו להסתכל עליהן.
ביטוי גנים משתנה בין אם הם קשורים לשינויים התפתחותיים, רעלים סביבתיים, מצבי מחלה ספציפיים ועוד רבים אחרים. כדי לבחון את הבדלי הביטוי בשמרים העוברים מתח חמצוני, RNA הכולל מופק תחילה משתי תרביות שמרים על ידי ליזה אנזימטית. תרבית אחת נחשפה לעקה חמצונית על ידי טיפול של שעה עם מי חמצן של 0.5 מילי-מולרי במי מלח חוצץ של האנק, בעוד שהתרבית השנייה טופלה רק ב-HBSS כביקורת.
התחל בסימון שני צינורות מיקרו צנטריפוגות בנפח 1.7 מיליליטר עם פרטי הזיהוי המתאימים. העבירו 1.5 מיליליטר מתרבית השמרים המתאימה לכל צינור. צנטריפוגה את הצינורות ב -5, 000 גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר צנטריפוגה, השתמש במיקרו פיפטה כדי להסיר בזהירות ולהשליך את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה. בדוק שהגלולה גדולה מספיק לפני שתמשיך בהליך. אם הגלולה קטנה מדי, הוסף 1.5 מיליליטר תרבית לאותו צינור המכיל את הגלולה ולאחר מכן צנטריפוגה לקבלת גלולה גדולה יותר.
השליכו את הסופרנטנט בעזרת מיקרו פיפטה, והוציאו כמה שיותר מהנוזל מכדור השמרים. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר SG ו -30 מיקרוליטר של תמיסת ליאז למערבולת גלולת השמרים לערבוב. דגרו את שני הצינורות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במהלך הדגירה.
סובב בעדינות כל צינור כל 10 דקות ליצירת פלטות. אחד השלבים הקריטיים ביותר כאשר אתה עושה ציפוי Sphero של שמרים הוא לוודא שאכן יצרת מאה אחוז Sphero פלסט לאחר הטיפול. המשמעות היא שלא כל האנזימים הליטיים נוצרו שווים.
אז אתה צריך לבדוק כדי לוודא שאנזים ליטי טוב נותן לך ציפוי ספרו טוב, כלומר אתה צריך לקחת את הדגימות האלה, לשים אותן על שקופית מיקרוסקופ ולבדוק מתחת למיקרוסקופ על ידי הוספת 0.1% SDS כדי לוודא שיש לך היווצרות פרוטופלסטים. כדי לצפות בציפוי ספרו מלא, פיפטה 10 מיקרוליטר מדגימת השמרים על שקופית מיקרוסקופ תוך בחינת הדגימה תחת המיקרוסקופ במיקרוליטר אחד של 0.1% SDS כדי לגרום לתאי השמרים להתנפח וליצור כדורים או ספרואידים מושלמים. חשוב לשים לב שהתאים הניצנים יוצרים גם ספרואידים S.
אם נצפה ציפוי ספרו חלקי, מומלץ טיפול ממושך בליאז. לאחר אישור ציפוי sphero מלא ב-350 מיקרוליטר של מאגר BRLT לכל צינור, הוסף 250 מיקרוליטר של 100% אתנול. ודא שהצינור סגור היטב על ידי החזקת המכסה סגור ומערבולת נמרצת למשך דקה אחת.
הליך זה יכין את פלטות ה-Sphero. לאחר מכן, השתמש בעמודות סיבוב R ו-Z קל כדי לאסוף ולנקות את ה-RNA משתי התרבויות. לבסוף, העריכו את איכות ה-RNA המופק באמצעות ג'ל ארוס טרומי של 1.2% לאלקטרופורזה להכנת CRNA עם תווית ביוטין.
סך ה-RNA המופק מתאי השמרים משמש תחילה לסינתזה של CD NA על ידי שעתוק הפוך. לאחר דור CD NA הכינו צינורות ג'ל לנעילת פאזה לשימוש בצינורות ג'ל לנעילת פאזה של צנטריפוגה CD NA במהירות מלאה למשך דקה אחת כדי להבטיח שהג'ל נמצא בתחתית הצינור. אין לערבב צינורות נעילת פאזה כדי לזרז פיפטה CD NA 162 מיקרוליטר מהשכבה התחתונה של תערובת פניל כלורופורם חוצץ pH 8.0 tris, אלכוהול איזואמיל או PCI ולהוסיף לתכולת 162 מיקרוליטר של הגדיל השני, צינור תגובה סינתזה CD NA נדרשים נפחים שווים של תערובות מימיות ואורגניות לשלב זה.
מערבולת למשך חמש שניות כדי לערבב את התוכן. לאחר מכן, השתמש במיקרו פיפטה והעביר את כל תערובת ה-CD N-A-P-C-I לצינור הג'ל של נעילת השלב. אין לערבב את צנטריפוגת צינור הג'ל לנעילת פאזה במלוא המהירות למשך שתי דקות.
לאחר מכן השתמש במיקרו פיפטה כדי להעביר את השכבה העליונה מצינור הג'ל של נעילת הפאזה לצינור חדש של 1.7 מיליליטר. נסו לאסוף כמה שיותר מהשכבה. הוסף את הדברים הבאים לצינור המיקרו צנטריפוגה בנפח 1.7 מיליליטר, 405 מיקרוליטר של 100% אתנול, 80 מיקרוליטר אמוניום אצטט ומיקרוליטר אחד של מערבולת צבע גלולה.
הנח בקצרה את הצינור בצנטריפוגה כשציר הצינור פונה החוצה וצנטריפוגה במלוא המהירות למשך 20 דקות. בטמפרטורת החדר לאחר השלמת הצנטריפוגה, הסר בעדינות את הצינור מהצנטריפוגה והקפיד לא להפריע לכדור CD NA. הגלולה צריכה להיות ורודה בגלל צבע הגלולה ובערך בגודל של גרגר מלח.
ובצד הצינור מתחת לציר, הנח את כדור ה-CD NA על קרח והמשך מיד לניקוי הגלולה. כדי להתחיל בהליך ניקוי גלולת CD NA, השתמש במיקרו פיפטה P 1000 כדי להסיר בזהירות את כל הסופרנטנט מהצינור. היזהר לא להפריע לגלולה.
זו הדגימה שלך ב-500 מיקרוליטר קר, 80% אתנול לצינור. מכסים בעדינות את הצינור והופכים אותו לאט מספר פעמים. התבונן בכדור שלך מקרוב כדי לוודא שהוא לא מתנתק מהצד של הצינור.
אם הכדור מתנתק, אתה יכול להחזיר אותו לתחתית הצינור על ידי החזרת הצינור למתלה ולתת לגלולה להתיישב לתחתית או צנטריפוגה של הצינור במלוא המהירות למשך 15 שניות. לאחר מכן, השתמש במיקרו פיפטה P 1000 כדי להסיר בזהירות את האתנול מבלי להפריע לגלולה. הטה את הצינור כדי לאפשר הסרה של כמה שיותר נוזלים.
הוסיפו Eloqua חדש של אתנול קר, 80%, כסו את הצינור והפכו אותו לאט מספר פעמים. לאחר הסרת כל האתנול האפשרי באמצעות מיקרו פיפטה P 1000. צנטריפוגה את הצינור במלוא המהירות למשך חמש שניות.
לאחר מכן השתמש במיקרו פיפטה P 10 כדי להסיר את המיקרוליטרים האחרונים של אתנול מבלי להפריע לגלולה. הנח את הצינור הפתוח בקופסת ייבוש למשך 10 עד 20 דקות כדי לאדות את האתנול שנותר. הכדור הולך לאיבוד בקלות ברגע שהוא יבש, לכן הקפד לטפל בצינור בעדינות ולסגור את המכסה.
בסיום הייבוש, דמיין את הגלולה המיובשת כדי לאשר שהיא קיימת בצינור. לבסוף, השעו מחדש את הגלולה המיובשת ב-22 מיקרוליטר מים נטולי RNA והניחו את הצינור על קרח. לאחר מכן משתמשים ב-CDNA זה להכנת ביוטין המסומן CRNA על ידי שעתוק במבחנה באמצעות ערכת Enzo BioArray.
לאחר ניקוי וכימות הביוטין המסומן CRNA, הוא מפוצל להכנת מטרה. לאחר יצירת ה-CDNA, אנו משתמשים במתודולוגיית שעתוק סטנדרטית במבחנה על מנת ליצור CRNA ביוטיניל. ה-CRNA צריך לעבור פיצול לפני שניתן יהיה ליישם אותו על שבב המיקרו-קרניים.
כדי להתחיל בהליך זה, העבירו כמות שווה ערך לחמישה מיקרוגרם של CRNA לצינור PCR מסומן של 0.5 מיליליטר. הוסף מספיק מים ללא RNA כדי להביא את הנפח הכולל ל-16 מיקרוליטר, ולאחר מכן הוסף ארבעה מיקרוליטר של מאגר פיצול פי חמישה לצינור. הנפח הכולל בצינור צריך להיות 20 מיקרוליטר.
מערבל את הצינור והצנטריפוגה למשך 10 שניות. לאחר מכן דגרו את הצינור בטמפרטורה של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. ב-thermocycler, הניחו את הצינור על קרח לאחר הדגירה.
ה-CRNA המקוטע והלא מקוטע מכל דגימה מוערך לאחר מכן על ידי אלקטרופורזה באמצעות ג'ל AROS 1.2% יצוק מראש. לאחר השלמת הריצה, הג'ל מומחש על טרנסלומינטור ומתקבלת תמונה. תוצר הסינתזה הסופי מוכלא לשבבי הגנים של השמרים הטריים ותוצאות מייצגות מניתוח המיקרו-מערך מוצגות כאן.
איור ראשון זה הוא דוגמה לתמונה סרוקה של שבב גן שמרים שנוצרה על ידי תוכנת ההפעלה של שבב הגנים atrics. זוהי תרשים פיזור דו-ממדי של כל התעתיקים הגנטיים, כ-6,700 גנים המשווים נתוני שמרים בקרה ומטופלים. כל נקודה מייצגת גן יחיד.
גנים הצבועים בסגול מצביעים על גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי, בעוד שגנים הצבועים באדום אינם מצביעים על גנים שמתבטאים באופן דיפרנציאלי. בדוגמה זו, רוב הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי הם אלה המעורבים בבקרת מחזור התא כפי שמצוין בתיאורים שלהם. תרשים זרימה זה ממסד הנתונים להדמיית הערות וגילוי משולב ממחיש גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי במסלול ביולוגי מושפע.
הגנים המסומנים בכוכב אדום מצביעים על הגנים המווסתים במסלול המיוטי. לבסוף, תוצאות מייצגות של עלילת הר געש שנוצרה באמצעות תוכנת סינון גנים של מינים גיאוגרפיים מוצגות כאן. דגימות ביקורת ומטופלות הושוו עם חתך ערך P של 0.05 וחיתוך שינוי ביטוי פי 1.5.
בחרנו להשתמש בשמרים מכיוון שקל לגדל שמרים במהירות, אבל הבנו גם שהחלק הקריטי ביותר בעבודה עם שמרים הוא למעשה יצירת ציפוי ספרו הגון. אחד הדברים במיקרו-מערך שאנחנו לא רוצים לעשות הוא למעשה לעשות עיכול לא שלם ולמעשה רק תאי פלסט ספרו שנמצאים בשלב G אחד או G 2M ואז אתה עושה ניסוי מיקרו-מערך על שמרים שנמצאים בשלב שכפול מסוים.
נקודה מורכבת נוספת שאנו מנסים להביא הביתה בתרגיל זה היא שאנשים מדברים על כדורי CD NA מדי יום, אבל זה לא בהכרח קל. ומה שעשינו במודול שלנו הוא שלמעשה השתמשנו בצינורות מיוחדים וריאגנטים להדמיה. אז אנחנו יכולים למעשה לסובב את הדנ"א ואתה יכול לדמיין ערעור, מה שמקל על התלמידים והמורים כאחד.
כך שניתן להשתמש בו בכל שלבי עבודת ה- DNA וה- RNA לאחר התפתחותו. מודול זה באמת סלל את הדרך לסגל במכוני הבגרות לחקור, אולי להסתכל על אורגניזמים מודלים אחרים או משטרי טיפול אחרים שעשויים להתאים לתוכניות הלימודים הקיימות או אולי לתחומי המחקר שלהם. וכדי לתת לכם דוגמה לכמה מהשינויים שנעשו, היה אתר אחד שבדק את ההשפעות של טיפול בקוטלי עשבים על שמרים או אתר אחר שבחן את הטיפול ב-LAMP IDE בשמרים, בעוד שאתר אחר בחן את השינויים ההתפתחותיים בקו התאים של יונקים שהם התעניינו בהם במיוחד.
ולבסוף, אתר אחר בדק את ההשפעה של מקורות אור דיפרנציאליים על ארבידופסיס או צמחים. לאחר שתצפו בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להגדיר ניסוי מיקרו-קרניים עם סטודנטים למדעים לתואר ראשון, כולל בידוד של RNA כולל משמרים, יצירת CDNA ופיצול ביוטין שכותרתו CRNA. התנסויות מעשיות עם טכנולוגיות ברמה כה גבוהה עוזרות לחזק ולחזק את החינוך המדעי לתואר ראשון.
סקירה
פרוטוקול זה מדגים כיצד ביטוי גנים בשמרים (Saccharomyces cerevisiae) משתנה בעקבות לחץ חמצוני הנגרם על ידי מי חמצן (H2O2). הוא מכוון לחנך סטודנטים לתואר ראשון על טכנולוגיית מיקרו-מערכים באמצעות יישום מעשי.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ניתוח ביטוי גנים
- טכנולוגיית מיקרו-מערכים
- לחץ חמצוני בשמרים
רקע
- הבנת שינויים בביטוי גנים חיונית לחקר תגובות תאיות ללחץ.
- טכנולוגיית מיקרו-מערכים מאפשרת ניתוח של מספר גנים בו-זמנית.
- שיטה זו משפרת את החינוך המדעי לסטודנטים לתואר ראשון.
- לחץ חמצוני הוא גורם סביבתי נפוץ המשפיע על תפקוד תאי.
מטרת המחקר
- להציג בפני סטודנטים את טכנולוגיית המיקרו-מערכים.
- לבחון את הבדלי ביטוי הגנים בשמרים תחת לחץ חמצוני.
- לספק ניסיון מעשי עם טכניקות ביולוגיה מולקולרית.
שיטות בשימוש
- בידוד של RNA טוטאלי מתרביות שמרים שטופלו במי חמצן ושליטות.
- ייצור וטיהור של cDNA מדגימות RNA.
- הכנת cRNA מסומן בביוטין לצורך הכלאה.
- שימוש בביואינפורמטיקה לניתוח נתוני ביטוי גנים.
תוצאות עיקריות
- חילוץ וניתוח מוצלחים של RNA מתרביות שמרים.
- הדגמה של שינויים בביטוי גנים עקב לחץ חמצוני.
- מעורבות סטודנטים בטכניקות ביולוגיה מולקולרית מעשיות.
- יישום ממצאים על מערכות ביולוגיות אחרות ומחקר.
מסקנות
- הפרוטוקול מלמד ביעילות טכניקות מולקולריות חיוניות.
- סטודנטים משיגים תובנות חשובות בניתוח ביטוי גנים.
- שיטה זו יכולה להתאים למחקרים ביולוגיים שונים מעבר לשמרים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Microarray analysis of Saccharomyces cerevisiae under oxidative stress provides a scalable platform for interrogating gene expression changes in response to environmental perturbations. This workflow enables high-throughput, quantitative assessment of transcriptional responses, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The approach is adaptable to diverse model systems, facilitating portfolio-wide translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of gene expression changes following defined oxidative stress.
- Supports functional target validation by quantifying transcriptional responses to controlled perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking by mapping pathway-level gene regulation events.
- Provides data for predictive confidence in early-stage biological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Delivers validated RNA extraction and labeling workflows for reproducible gene expression profiling.
- Standardizes sample preparation and hybridization for downstream microarray analysis.
- Generates quantitative, scalable readouts suitable for comparative screening studies.
- Enables robust assay development for evaluating compound or environmental effects on gene expression.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression outputs with disease-relevant or stress-response pathways in model organisms.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling pathway mapping.
- Provides a framework for adapting workflows to additional biological systems or treatment regimens.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative molecular data.
Pipeline & Workflow Integration
This microarray protocol integrates into the discovery continuum from hypothesis-driven perturbation studies through lead identification and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying gene expression changes after oxidative challenge.
- Screening: Provides reproducible, quantitative microarray outputs for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Enables statistical analysis of differential gene expression using fold-change and p-value thresholds.
- Translational Research: Offers adaptability to other model organisms and stressors for broader translational insights.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for gene expression profiling across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes RNA handling, labeling, and hybridization for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA extraction, labeling, and microarray hybridization techniques.
- Needs access to microarray instrumentation and bioinformatics analysis infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptable to various model systems and treatment regimens with protocol modifications.
- Dependent on RNA quality and completeness of cell lysis for reliable downstream analysis.
