הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה באתרו הכלאה ב Cerevisiae Saccharomyces

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות נוכחות של מולקולות mRNA עם ספציפיות של מולקולה בודדת בתאי שמרים בודדים. ראשית, תקן את תאי השמרים והפורמלדהיד באמצעות מאגר המכיל ליאז. חדיר לתאים עד שרוב התאים אינם בהירים בשלבים.

לאחר מכן, דגרו את תאי הסלסול עם מולקולות DNA חד-גדיליות מתויגות פלואורסצנטיות ואז הרכיבו את התאים על פתק כיסוי מנוקה בפלזמה. בסופו של דבר, התוצאות המתקבלות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית יכולות לפרט את הנוכחות והלוקליזציה של מולקולות mRNA בתאים בודדים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ביטוי גנים, מיקרו-מערכים וכתמים צפוניים, הוא שניתן לדמיין mRNA בודדים בתאים בודדים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התמלול. זה כולל כימות מספר ה-RNA של הזרוע לתא באוכלוסייה שיכול ליידע מודלים של ויסות ברמת המקדם. זה יכול לשמש גם כדי לקבוע את הלוקליזציה ומחצית החיים של תעתיקים במהלך מחזור התא.

במיקום תא ואקום פלזמה מכסה מחליק על השקופיות. לאחר מכן הכניסו את תא הוואקום למיקרוגל וודאו שהוא אטום. הפעל את המשאבה לאחר הפעלת המשאבה.

הפעל את הוואקום כעת, הפעל את המיקרוגל ועצור חמש שניות לאחר שהפלזמה נראית לעין. לאחר מכן כבה את הוואקום, ואחריו את המשאבה. משוך החוצה את תא הוואקום.

לאחר מכן העבירו את החלקות הכיסוי עם הצד הנקי כלפי מעלה ל -12. צלחות באר מגדלות את השמרים ל-A 600 של סביב 0.1 עד 0.2. במדיה מינימלית, 10 מיל של תאים מניבים מספיק לכ-10 הכלאות.

הוסף נפח עשירי אחד של 37% פורמלדהיד ישירות למצע הגידול ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. צנטריפוגה של התאים ב -3000 גרם למשך חמש דקות. השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מאגר B והעבירו לצינור מיקרו צנטריפוגה.

יש לשטוף פעמיים עם מיליליטר אחד של מאגר קר קרח B בצינור מיקרו צנטריפוגה. צנטריפוגה במהירות 13,000 סל"ד למשך דקה. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של ציפוי ספרו, חוצצים ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

עקוב אחר התאים במיקרוסקופ כל כמה דקות עד שרוב התאים שחורים. לאחר מכן יש לשטוף פעמיים עם מאגר קר כקרח. ב. ספינינג במהירות נמוכה של 3,500 סל"ד.

הוסף מיליליטר אחד של 70% אתנול resus. השעו את הגלולה בעדינות והניחו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס או אחסנו ללא הגבלת זמן במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי להכין את תמיסת ההכלאה, הוסף אחד עד שלושה מיקרוליטר בדיקה ל-100 מיקרוליטר של מאגר הכלאה.

ואז מערבולת וצנטריפוגה. צילמנו שלושה גנים שונים בו-זמנית באמצעות שלוש ערכות בדיקה שונות. כעת צנטריפוגה, השמרים הקבועים דגימה ושואבים ממאגר הכביסה.

מוסיפים את תמיסת ההכלאה ודוגרים בחושך עם ניעור עדין למשך הלילה ב -37 מעלות צלזיוס למחרת. טפלו בשפתיים נקיות עם 150 מיקרוליטר של 0.01% פוליליזין למשך חמש דקות. ואז לשאוף ולייבש באוויר.

המגלשות נשטפות שלוש פעמים במים מזוקקים ומתייבשות באוויר לאחר שטיפה אחת עם XSSC Resus אחד, משהות את התאים ב-150 מיקרוליטר של 0.1 מיקרוגרם למיליליטר. מכתים מטושטש טרי מכתים את תרחיף התאים על הכיסוי המטופל בפוליליזין מחליק ודוגר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הפשירו את מדיום ההרכבה הממושך של הזהב לטמפרטורת החדר.

הניחו שלושה מיקרוליטר על שקופית. לאחר מכן הוסף כ- 0.5 מיליליטר אתנול לתלוש כיסוי. בצלחת 12 הבארות, הסר את החלקת הכיסוי וייבש באוויר תוך כדי אחיזה בפינצטה.

הנח את צד תא ההחלקה של הכיסוי כלפי מטה על מדיום הרכבה ותן לו להתקשות מספר שעות או לילה בחושך. אוטמים את הקצוות עם לק וממשיכים בהדמיה. צלם זאק של תמונות סביב נקודת הייחוס שבה המרחק הכולל הוא חמישה מיקרומטר בגודל של 0.2 מיקרומטר.

חזור על ההדמיה עבור כל ערוץ צבע המתאים לכל ערכת בדיקה. לאחר מכן המשך כמפורט בטקסט הנלווה. כדי לזהות את התאים על ידי פילוח פרשת המים, זהה את הכתמים באמצעות שיפוע רדיאלי ומדוד את הכתמים באמצעות התאמה גאוסית.

בדרך כלל, היסטוגרמות מחושבות מתמונות דגים ומשמשות לקביעת מספר ה-mRNA הקיימים בתאים בודדים. יתרון חשוב של כימות RNA מבוסס מיקרוסקופיה הוא שניתן לקבל מידע על לוקליזציה של תעתיקים. לדוגמה, דג זה משתמש בבדיקות בודדות כדי לזהות mRNAs בתאים בודדים עם אלל CCB CBF אחד הניתן להשראה.

מכיוון שמולקולות mRNA רבות נמצאות באתר השעתוק, קל לזהות את נוכחותם ומיקומם של אתרי שעתוק בתוך הגרעין. השימוש בצבעים שונים לסימון mRNA של גנים שונים מקל על כימות של מיני mRNA מרובים באותם תאים. בניסוי זה, תאי שמרים הודגרו בנוכחות גורם אלפא וסורביטול באמצעות דגים עם בדיקות סטלרה, הנתונים מראים שתא אחד מגיב רק לפרומון המסומן על ידי אתר התחלה אחד של FUS אדום.

במקביל, תא אחר מגיב בעיקר לסורביטול, כאשר אתר ההתחלה הראשון של S TL מסומן בירוק. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג ולדמיין מולקולות mRNA בודדות בשמרים לאחר שליטה. ניתן לבצע טכניקה זו כראוי תוך יומיים.

זכור שיהיה ריכוז צפוף מספיק של תאים. דגימות מדוללות דורשות יותר שדות כדי להיות תמונה ואחסון.