Immunoblot ניתוח
20 ביוני 2008
Immunoblotting (המערבי סופג) הוא assay מהיר ורגיש לגילוי ואפיון של חלבונים אשר עובד על ידי ניצול סגוליות הטמון בזיהוי אנטיגן נוגדן. וידאו זה מספק פרוטוקולים להפרדת חלבון, חלבונים סופג על ממברנות, immunoprobing, להדמיה באמצעות מצעים chromogenic או chemiluminescent.
כתמים חיסוניים, המכונה לעתים קרובות Western blotting, משמשים לזיהוי בתוך דגימת חלבון, אנטיגנים ספציפיים המזוהים על ידי נוגדנים רב-שבטיים או חד-שבטיים. הליך זה בדרך כלל עוקב אחר אלקטרופורזה של ג'ל אחד או דו-ממדי וכולל העברה של חלבונים מופרדים לקרומי ניטרוצלולוזה. דגירה של ממברנות אלה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים, מצומדים במישרין או בעקיפין לאנזימים והדמיה של אנטיגנים חלבונים על ממברנות אלה באמצעות תגובות סובסטרט צבעוניות או פלואורסצנטיות.
בסרטון זה, אנו מספקים הדגמה שלב אחר שלב של הליך ספיגה חיסונית. היי, אני שון גלאגר מ-UVPI משתף פעולה עם מרכז פרוטאומי כאן במכון לתארים מתקדמים של KE. היום אני הולך להראות לכם ניתוח של כתמים חיסוניים.
זה כולל מספר שלבים כולל הפרדת חלבונים, הכתמת החלבונים על ממברנות, בדיקה חיסונית והדמיה עם מצעי זוהר כרומוגניים וקים. אז בואו נתחיל. לפני שמתחילים בהליך הספיגה החיסונית, יש להפריד תחילה את דגימות החלבון באמצעות אלקטרופורזה באמצעות ג'לים חד מימדיים קטנים או סטנדרטיים.
הכן את הדגימות האנטיגניות והעמיס אותן לנתיבים על הג'ל, כלול חלבון צבוע מראש או ביוטיניל, תקני משקל מולקולרי באחד או יותר מנתיבי הג'ל. סמני חלבון אלה יעברו לממברנה ויצביעו בנוחות על כיוון הממברנה וגדלים של חלבונים לאחר צביעה חיסונית. לאחר השלמת האלקטרופורזה, אנו מוכנים להרכיב את הכתם החיסוני.
כדי להרכיב את הכתם החיסוני ראשית, יש לפרק את כריך הג'ל ולהסיר את ג'ל הערימה לאזן את הג'ל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במאגר ההעברה, שיווי משקל זה נדרש כדי למנוע שינוי בגודל הג'ל במהלך ההעברה בזמן שהג'ל מתאזן. התחל להרכיב את כריך ההעברה במגש גדול מספיק כדי להחזיק את מילוי קלטת ההעברה מפלסטיק עם מאגר העברה כך שהקסטה מכוסה. כעת הניחו כרית בהירה או ספוג סקוטש על החצי התחתון של קלטת העברת הפלסטיק.
לאחר מכן קח דף נייר פילטר שנחתך לאותו גודל כמו הג'ל. הרטיבו אותו מראש עם מאגר העברה והניחו אותו על גבי הכרית הבהירה של הסקוטש. לאחר סיום שיווי המשקל של הג'ל למשך 30 דקות, הנח את הג'ל על גבי נייר הסינון.
הסר בועות אוויר בין הג'ל לנייר הסינון על ידי גלגול עדין של מבחנה או מוט זכוכית על פני הג'ל. או שאתה יכול להשתמש ברולר BioRad, שמגיע עם ערכת BioRad. זכור להשתמש בכפפות בעת מניפולציה של ניירות פילטר, ג'לים וממברנות.
שמן מהידיים שלך יחסום את ההעברה. לאחר מכן, הכינו את קרום ההעברה. חותכים את הממברנה לגודל זהה לג'ל בתוספת מילימטר עד שני מילימטרים בכל קצה.
לאחר מכן הניחו את הממברנה במים מזוקקים לאט עם קצה אחד בזווית של 45 מעלות, המים יתנדפו לתוך הממברנה ובסופו של דבר ירטיבו את כל המשטח. אם הוא מוחדר שניים במהירות למים, האוויר נלכד ויופיע ככתמים לבנים בקרום. החלבון לא יעבור לאזורים אלה.
לאחר שהממברנה רטובה לחלוטין, אזנו אותה למשך 10 עד 15 דקות והעבירו את המאגר. הליך הרטבה זה עובד עבור ממברנות ניטרוצלולוזה וניילון. רק ממברנות PVDF הן הידרופוביות ולא יירטבו פשוט מהכנסתן למים מזוקקים או העברה. מאגר.
תחילה יש לטבול את ממברנות PVDF ב-100% מתנול למשך שנייה עד שתיים, ולאחר מכן לאזן למשך 10 עד 15 דקות. במאגר העברה. אל תתנו לקרום להתייבש בכל עת.
אם זה קורה שוב רטוב עם מתנול ואז מאגר ההעברה. לאחר שהממברנה מוכנה, הנח את הממברנה הרטובה מראש ישירות על הצד העליון של הג'ל. זכור להסיר את כל בועות האוויר בין הג'ל לממברנה על ידי גלגול עדין של מוט זכוכית של מבחנה או רולר BioRad על פני הממברנה.
לאחר מכן, רטוב נוסף, פיסת נייר סינון ווטמן שלושה מ"מ. ואז הניחו אותו על גבי הממברנה ושוב, הסירו את כל בועות האוויר. לאחר מכן הניחו עוד כרית בהירה או ספוג על גבי נייר הסינון הזה.
השלם את הרכבת כריך הכתם החיסוני על ידי נעילת המחצית העליונה של קלטת ההעברה למקומה. כעת, כשכריך הכתם החיסוני מורכב, אנו מוכנים להעביר את החלבונים מהג'ל לממברנה. כדי להתחיל בהליך ההעברה, מלאו את מיכל האלקטרו בלוטינג במאגר העברה והנחו את קלטת ההעברה המכילה את הכריך לתוך מנגנון האלקטרו ספיגה.
חשוב לכריך כך שהקרום יפנה לאנודה או לצד הטעון חיובית של המיכל. חבר את המוליכים של ספק הכוח לצידי האנודה והקתודה המתאימים של מנגנון האלקטרו ספיגה. כתם הקריטריון הספציפי הזה מגיע עם גוש קרח קירור.
כעת, חלבונים אלקטרופורטיים מעבירים מג'ל לממברנה למשך 30 עד 60 דקות ב-50 וולט עם קירור או לילה ב-14 וולט בחדר קירור. בסיום ההעברה, כבה את ספק הכוח ופרק את המכשיר. לאחר מכן הסר את הממברנה ממנגנון הספיגה ושים לב לכיוון על ידי חיתוך פינה.
בשלב זה ניתן לייבש ממברנות ולאחסן אותן בשקית ניילון הניתנת לסגירה חוזרת בארבע מעלות צלזיוס למשך שנה. לפני עיבוד נוסף, יש להניח ממברנות PVDF מיובשות בכמות קטנה של 100% מתנול כדי להרטיב את הממברנה. ואז במים מזוקקים כדי להסיר את המתנול.
לאחר סימון הכיוון, הכתים את הג'ל כדי לוודא את יעילות ההעברה. כדי לדמיין חלבונים שהועברו, אתה יכול לצבוע את הממברנה באופן הפיך עם אודם ציפרו או באופן בלתי הפיך עם דיו הודי כחול קמאסי, כחול נפתול או זהב קולואידי. הליכי צביעה בלתי הפיכים אלה אינם תואמים לממברנות ניילון.
כעת, כשהחלבונים מועברים לממברנה, המשך בבדיקה חיסונית וזיהוי חזותי של החלבונים. בשלב זה, חלבונים משותקים על הממברנה נבדקים עם נוגדנים ספציפיים כדי לזהות ולכמת את כל האנטיגנים הקיימים. כדי להתחיל, הניחו את הממברנה במגש דגירה מפלסטיק עם חיץ חוסם של 20 מיליליטר.
יש אנשים שמשתמשים בשקיות, אך לעתים קרובות משתמשים במגשים במקום זאת מכיוון שהם שימושיים במיוחד בעת עיבוד מספר רב של רצועות בתמיסות נוגדנים ראשוניות שונות. לאחר מכן, דגרו את הממברנה האטומה למשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה על שייקר מסלולי או פלטפורמת נדנדה. בזמן שהממברנה דוגרת, יש לדלל את הנוגדן הראשוני ואת המאגר החוסם.
הדילול נקבע אמפירית, אך בדרך כלל הוא אחד ל-100 ל-1000. עבור נוגדן רב-שבטי, אחד ל-10 ל-100 עבור סופרנטנטים היברידיים ויותר מ-1 ל-1000 עבור נוזל חומצות עכברים המכיל נוגדנים חד-שבטיים. בסיום הדגירה, שפכו את המאגר החוסם.
החלף את המאגר בנוגדנים ראשוניים מדוללים, ושוב, דגירה למשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה מתמדת. לאחר מכן, שטפו את הממברנה ארבע פעמים על ידי תסיסה עם 100 מיליליטר. TTBS למסנני ניטרוצלולוזה או PVDF או TBS למסנני ניילון.
שטפו במשך 10 עד 15 דקות בכל פעם בזמן שטיפת הממברנה, דללו את הנוגדן המשני במאגר חוסם. דוגמאות לנוגדנים משניים כוללות פרוקסידאז צנון סוסים או פוספטאז אלקליין, מצומד אנטי IG, מצומד אנזים זמין מסחרית. נוגדנים משניים מדוללים בדרך כלל מאחד ל-200 עד אחד עד 25,000 לפני השימוש.
לאחר סיום שלבי הכביסה והשלכת חומרי הכביסה, הוסיפו פרוקסידאז צנון סוסים מדולל או פוספטאז אלקליין, מצומד אנטי IG ודגרו 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה מתמדת. לאחר 30 עד 60 דקות, הוציאו את הממברנה מהפח ושטפו אותה ארבע פעמים, 10 עד 15 דקות בכל פעם. ב-TTBS כפי שתואר קודם לכן.
לאחר השלמת השטיפות, אנו מוכנים להמשיך בשלב ההדמיה. אך ראשית, נדגים הליך חלופי לבדיקה חיסונית. הליך בדיקה חיסוני חלופי זה מבוסס על ערכת BC של כתם וקטורי מבית Vector Labs.
הוא משתמש בקומפלקס ביוטין אבידן כדי לחבר פרוקסידאז צנון סוסים או HRPO או פוספטאז אלקליין A A P לנוגדנים המשניים הביוטיניים. היום נדגים את ערכת HRPO. TTBS מתאים היטב כמאגר חוסם למערכות ביוטין avadon.
אבל עבור מסנני ניילון, ריאגנטים קושרי חלבון מומלצים מכיוון שחלב יבש ללא שומן מכיל שאריות ביוטין, שיפריע לבדיקה החיסונית. יש להשתמש בו בשלב החסימה רק כדי להתחיל לאזן את הממברנה במאגר חוסם במגש פתוח עם תסיסה מתמדת באמצעות שייקר מסלולי או פלטפורמת נדנדה. דגרו את הממברנה למשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר בזמן שהקרום מאזן.
הכן את תמיסת הנוגדנים העיקרית. השתמש ב-TTBS עבור ממברנות ניטרוצלולוז או PVDF עם רגישות גבוהה לעדן. מערכות ביוטין.
דילול של cera המכיל נוגדנים ראשוניים נע בדרך כלל בין אחד ל-1000 לאחד ל-100,000. השימוש בכימיה כימית דורשת טווח דילולים גבוה יותר. במקרה שלנו, הדגמת כרומוגני.
אנו משתמשים בדילול של אחד ל-5,000 של הפריימריז. לאחר סיום שיווי המשקל האלקטרוני, הסר את מאגר החסימה. לאחר מכן הוסף מספיק תמיסת נוגדנים ראשונית כדי לכסות את הממברנה.
דגרו את הממברנה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדינה לאחר 30 דקות. שטפו את הממברנה שלוש פעמים ב-TTBS לניטרוצלולוז במרווחי זמן של חמש דקות במהלך שלב הכביסה, הכינו את תמיסת הנוגדנים המשניים הביוטיניים על ידי דילול טיפה אחת של נוגדן ביוטיניל עם 10 מיליליטר TTBS. לאחר סיום שלבי הכביסה, הוסף את תמיסת הנוגדנים המשנית.
דגרו את הממברנה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנוד איטי בזמן שהממברנה מודגרת עם נוגדן משני. הכן את avadon biotin HRPO לעשות זאת. מערבבים שתי טיפות של מגיב כתמים vti A ושתי טיפות מגיב B לתוך 10 מיליליטר.
TTBS לניטרוצלולוז. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לאחר השלמת הדגירה של הנוגדנים המשניים. שטפו את הממברנה שלוש פעמים במשך 15 דקות עם TTBS או TBS.
לאחר מכן, הוסיפו את תמיסת האנזים אבידן ביוטין לקרום ודגרו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה איטית. לאחר מכן שטפו את הממברנה שלוש פעמים במרווחים של 10 דקות עם TTBS. כעת, לאחר שהליך הבדיקה החיסונית הושלם, החלבונים הקשורים לממברנה מוכנים להדמיה עם מצעים כרומוגניים.
עבור שלב הדמיה אחרון זה, המצעים 4 CN dab slash ICL 2 ו-TMB משמשים בדרך כלל עם הליכי זיהוי חיסוני מבוססי צנון סוסים, פרוקסידאז. אם שטיפת הממברנה הסופית במהלך הליך הבדיקה החיסונית בוצעה ב- TTBS, אז שטפו את הממברנה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ו -50 מיליליטר. TBS ממקם כעת את הממברנה בתמיסת הדמיה כרומוגנית.
רצועות חלבון אמורות להופיע תוך 10 עד 30 דקות. לאחר הדגירה של 30 דקות, השליכו את תערובת תגובת המצע וסיימו את התגובה על ידי הוספת מים מזוקקים. ספיגה חיסונית היא הליך רב-שלבי המשמש אלפי מעבדות כדי לזהות נוכחות של חלבונים ספציפיים לאחר אלקטרופורזה אחת או דו-ממדית.
זה עתה הראיתי לכם כיצד לבצע ניתוח דם חיסוני. אז זהו. בהצלחה בניסויים שלך ותודה על הצפייה.
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את טכניקת האימונובלוטינג (western blotting), בדיקה רגישה לזיהוי ואפיון של חלבונים. הוא סוקר פרוטוקולים להפרדת חלבונים, העברה לממברנות (blotting), סריקה אימונולוגית (immunoprobing) וויזואליזציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- פרוטאומיקה
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- אימונובלוטינג (Immunoblotting) מזהה אנטיגנים ספציפיים בדגימות חלבון.
- בדרך כלל הוא מתבצע לאחר הפרדה של חלבונים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.
- חלבונים מועברים לממברנות לצורך ניתוח נוסף.
- נוגדנים משמשים לזיהוי ולכימות של חלבונים.
מטרת המחקר
- לספק הדגמה שלב-אחר-שלב של הליך האימונובלוטינג (immunoblotting).
- להמחיש את החשיבות של העברת חלבונים ושל טכניקות ויזואליזציה.
- להעמיק את ההבנה של אינטראקציות אנטיגן-נוגדן בניתוח חלבונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- אלקטרופורזה להפרדת חלבונים באמצעות ג'לים במימד אחד (1D) או בשני מימדים (2D).
- העברה של חלבונים לממברנות ניטרוסלולוז או ניילון.
- אינקובציה עם נוגנים ראשוניים ושניוניים.
- ויזואליזציה באמצעות סובסטראטים כרומוגניים או כימילומנסיים.
תוצאות עיקריות
- העברה מוצלחת של חלבונים כפי שמעידים סממני משקל מולקולרי.
- הדמיה של פסי חלבון באמצעות טכניקות צביעה.
- זיהוי אנטיגנים ספציפיים באמצעות נוגדנים.
- כימות רמות החלבון על בסיס קישור נוגדנים.
מסקנות
- אימונובלוטינג (Immunoblotting) היא שיטה מהימנה לזיהוי חלבונים.
- טכניקה נכונה מבטיחה העברה וויזואליזציה מדויקות.
- שיטה זו חיונית לחקר ביטוי ותפקוד של חלבונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
אימונובלוטינג (Immunoblotting) מספק שיטה רגישה וספציפית לגילוי חלבונים מטרה בדגימות ביולוגיות מורכבות, ובכך תומך בתיקוף מטרות בשלב מוקדם ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליך גילוי תרופות. על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית של אינטראקציות אנטיגן-נוגדן, הוא מגביר את הביטחון החזוי במודולציה של מסלולים ובמרלוונטיות של ביומרקרים. בדיקה זו משמשת באופן שגרתי למיון היפותזות טיפוליות ולתיעדוף מובילים (leads) על בסיס נתוני ביטוי חלבון פונקציונליים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות זיהוי אנטיגנים ספציפיים המזוהים על ידי נוגדנים פוליקלונליים או מונוקלונליים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של מעורבות המטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים.
- ערך ניבוי: מסייע בסינון ותיעדוף תיקי פיתוח באמצעות אספקת נתונים על ביטוי חלבון פונקציונלי להערכת הרלוונטיות של המטרה ומנגנון הפעולה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לתהליכי עבודה המשכיים על ידי אישור העברת החלבון ושלמות הממברנה.
- שחזוריות: מאפשרת זיהוי חלבונים סטנדרטי באמצעות תנאי הפרדה אלקטרופורטית והעברה עקביים.
- פלט כמותי: תומכת בהערכה מהימנה של תרכובות באמצעות ויזואליזציה כימילומניסצנטית או כרומוגנית של פסי חלבון.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין תיקוף המטרה בשלב הגילוי למודלים פרה-קליניים באמצעות זיהוי עקבי של אנטיגנים במערכות שונות.
- הלימה של סממנים ביולוגיים: תומכת בזיהוי של שינויים חלבוניים רלוונטיים למחלה או תזוזות בביטוי הקשורות להתערבות פרמקולוגית.
- החלטות מותאמות סיכון: מספקת מידע עבור קריטריונים לקידום על ידי אימות מודולציה של המטרה בהקשרים ביולוגיים רלוונטיים.
שילוב של זרימת עבודה ותהליכי עיבוד (Pipeline)
אימונובלוטינג (Immunoblotting) משמש כבדיקה מרכזית ברצף הגילוי, ומקשר בין בדיקת השערות ראשוניות לגבי מטרות לבין זיהוי מובילים ותיקוף פרה-קליני, באמצעות זיהוי וכמתית מדויקים של חלבונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי זיהוי אנטיגנים ספציפיים בדגימות חלבון לאחר אלקטרופורזה של ג'ל.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של בדיקות באמצעות העברה סטנדרטית של חלבונים לממברנות ניטרוסלולוז, PVDF או ניילון עם סמני משקל מולקולרי הניתנים לזיהוי.
- אנליזה: מספקת קריאות כמותיות באמצעות זיהוי מבוסס נוגדנים, המאפשר השוואה של רמות חלבון בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שלב הגילוי לרציפות פרה-קלינית על ידי אימות נוכחותם ומודולציה של מטרות במערכות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה לשימוש חוזר לזיהוי חלבונים בפרויקטים מרובים, ובכך מפחיתה פיתוח כפול של בדיקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות זיהוי ישיר של האנטיגן.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות פרוטוקולים מוגדרים להעברה, חסימה וויזואליזציה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי אספקת נתונים פונקציונליים של חלבונים המפחיתים סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון המבוסס על נתונים מאומתים של מעורבות מטרה ו modulate של מסלול.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופורזה של חלבונים, טיפול בממברנות וטכניקות זיהוי מבוססות נוגדנים.
- תלוי במכשור לאלקטרופורזה של ג'ל, העברה חשמלית (electro blotting) ומערכות דימיג לזיהוי כרומוגני או כימילומינסנטי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של בופרי חסימה, טווחי דילול של נוגדנים ותנאי שטיפה כדי להבטיח הדירות.
- כולל שיקולי התאמה לסוגי ממברנות שונים (ניטרוצלולוז, PVDF, ניילון) ולדרישות ההקדמה והחסימה המתאימות להן.
- מוגבל על ידי הצורך בנוגדנים ספציפיים באיכות גבוהה ובתנאי חסימה אופטימליים כדי למזער את רעש הרקע.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title/ Prologue
0:56
Introduction
1:22
Separating Protein Samples by Gel Electrophoresis
2:06
Assembling the Immunoblot Sandwich
5:43
Transferring Proteins from Gel to Membrane
7:52
Immunoprobing Membrane with Directly Conjugated Secondary Antibody
10:45
Immunoprobing with Avidin-Biotin Coupling to Secondary Antibody
14:26
Visualization of Immunoblot with Chromogenic Substrates
15:32
Conclusion
