Name: ניתוח אופטימלי של חלבונים מביציות קסנופוס ועוברים על ידי Immunoblotting (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: למד פרוטוקול אימונובלוטינג לניתוח חלבונים מביציות ועוברי קסנופוס. השיטה מאפשרת זיהוי רגולטורים תרגומיים ומספקת בסיס להשוואת מנגנוני בקרת סינתזת חלבונים בהתפתחות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Gurdon, J. B., Wickens, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Xenopus+oocytes+for+the+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The use of Xenopus oocytes for the expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 101, 370-386 (1983).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), (2010).</li>
<li>Coller, J., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+function+assays%3A+an+adaptable+approach+to+study+RNA+regulatory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tethered function assays: an adaptable approach to study RNA regulatory proteins.</a> Methods Enzymol. 429, 299-321 (2007).</li>
<li>Minshall, N., Allison, R., Marnef, A., Wilczynska, A., Standart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+assessed+using+the+tethered+function+assay+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Translational control assessed using the tethered function assay in Xenopus oocytes.</a> Methods. 51 (1), 165-169 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Cooke, A., Park, S., Dewey, C. N., Wickens, M., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li>
<li>Waghray, S., Williams, C., Coon, J. J., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+CAF1+requires+NOT1-mediated+interaction+with+4E-T+to+repress+translation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Xenopus CAF1 requires NOT1-mediated interaction with 4E-T to repress translation in vivo.</a> RNA. 21 (7), 1335-1345 (2015).</li>
<li>Neff, A. W., Wakahara, M., Jurand, A., Malacinski, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+analyses+of+cytoplasmic+rearrangements+which+follow+fertilization+and+accompany+symmetrization+of+inverted+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Experimental analyses of cytoplasmic rearrangements which follow fertilization and accompany symmetrization of inverted Xenopus eggs.</a> Development. 80 (1), 197-224 (1984).</li>
<li>Newman, K., Aguero, T., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of Xenopus oocytes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2018 (2), (2018).</li>
<li>Shaidani, N. -I., McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Obtaining Xenopus laevis eggs.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2021 (3), (2021).</li>
<li>Shaidani, N. -I., McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+Xenopus+laevis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Obtaining Xenopus laevis embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2021 (3), (2021).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> Development. 77 (1), 15-37 (1983).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dejellying+Xenopus+laevis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dejellying Xenopus laevis embryos.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Zahn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+table+of+Xenopus+development%3A+a+new+graphical+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Normal table of Xenopus development: a new graphical resource.</a> Development. 149 (14), dev200356(2022).</li>
<li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos%3A+I.+Characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30 (3), 675-686 (1982).</li>
<li>Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-to-zygotic+transition%3A+reprogramming+of+the+cytoplasm+and+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The maternal-to-zygotic transition: reprogramming of the cytoplasm and nucleus.</a> Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).</li>
<li>Park, S., Blaser, S., Marchal, M. A., Houston, D. W., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gradient+of+maternal+Bicaudal-C+controls+vertebrate+embryogenesis+via+translational+repression+of+mRNAs+encoding+cell+fate+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A gradient of maternal Bicaudal-C controls vertebrate embryogenesis via translational repression of mRNAs encoding cell fate regulators.</a> Development. 143 (5), 864-871 (2016).</li>
<li>Bull, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal%2C+a+genetic+factor+which+affects+the+polarity+of+the+embryo+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Bicaudal, a genetic factor which affects the polarity of the embryo in Drosophila melanogaster.</a> J Exp Zool. 161 (2), 221-241 (1966).</li>
<li>Mohler, J., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+maternal-effect+mutations+of+Drosophila+melanogaster+causing+the+production+of+double-abdomen+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dominant maternal-effect mutations of Drosophila melanogaster causing the production of double-abdomen embryos.</a> Genetics. 112 (4), 803-822 (1986).</li>
<li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal+C%2C+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies%2C+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li>
<li>Minegishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+left-right+asymmetric+decay+of+Dand5+mRNA+in+the+mouse+embryo+requires+a+Bicc1-Ccr4+RNA+degradation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced left-right asymmetric decay of Dand5 mRNA in the mouse embryo requires a Bicc1-Ccr4 RNA degradation complex.</a> Nat Commun. 12 (1), 4071(2021).</li>
<li>Maerker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicc1+and+Dicer+regulate+left-right+patterning+through+post-transcriptional+control+of+the+Nodal+inhibitor+Dand5%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bicc1 and Dicer regulate left-right patterning through post-transcriptional control of the Nodal inhibitor Dand5.</a> Nat Commun. 12 (1), 5482(2021).</li>
<li>Piazzon, N., Maisonneuve, C., Guilleret, I., Rotman, S., Constam, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicc1+links+the+regulation+of+cAMP+signaling+in+polycystic+kidneys+to+microRNA-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bicc1 links the regulation of cAMP signaling in polycystic kidneys to microRNA-induced gene silencing.</a> J Mol Cell Biol. 4 (6), 398-408 (2012).</li>
<li>Kraus, M. R. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+mutations+in+human+BICC1+resulting+in+Wnt+pathway+hyperactivity+associated+with+cystic+renal+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Two mutations in human BICC1 resulting in Wnt pathway hyperactivity associated with cystic renal dysplasia.</a> Hum Mutat. 33 (1), 86-90 (2012).</li>
<li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+Bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein Bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li>
<li>Bouvrette, D. J., Sittaramane, V., Heidel, J. R., Chandrasekhar, A., Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Bicaudal+C+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+causes+cystic+kidneys%3A+a+nonmammalian+model+of+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Bicaudal C in zebrafish (Danio rerio) causes cystic kidneys: a nonmammalian model of polycystic kidney disease.</a> Comp Med. 60 (2), 96-106 (2010).</li>
<li>Mahone, M., Saffman, E. E., Lasko, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Bicaudal-C+RNA+encodes+a+protein+containing+a+KH+domain%2C+the+RNA+binding+motif+of+FMR1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Localized Bicaudal-C RNA encodes a protein containing a KH domain, the RNA binding motif of FMR1.</a> EMBO J. 14 (9), 2043-2055 (1995).</li>
<li>Dowdle, M. E., Park, S., Blaser Imboden, S., Fox, C. A., Houston, D. W., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+KH+domain+in+Bicaudal-C+links+mRNA+binding+and+translational+repression+functions+to+maternal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A single KH domain in Bicaudal-C links mRNA binding and translational repression functions to maternal development.</a> Development. 146 (10), dev172486(2019).</li>
<li>Saffman, E. E., Styhler, S., Rother, K., Li, W., Richard, S., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+Bicaudal-C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein Bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li>
<li>Chalabi Hagkarim, N., Grand, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulatory+properties+of+the+Ccr4-Not+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The regulatory properties of the Ccr4-Not complex.</a> Cells. 9 (11), E2379(2020).</li>
<li>Chicoine, J., Benoit, P., Gamberi, C., Paliouras, M., Simonelig, M., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis%2C+cytoskeletal+organization%2C+and+its+own+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li>
<li>Kugler, J. -M., Chicoine, J., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+associates+with+a+Trailer+Hitch%2FMe31B+complex+and+is+required+for+efficient+Gurken+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C associates with a Trailer Hitch/Me31B complex and is required for efficient Gurken secretion.</a> Dev Biol. 328 (1), 160-172 (2009).</li>
<li>Kamenska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DDX6-4E-T+interaction+mediates+translational+repression+and+P-body+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DDX6-4E-T interaction mediates translational repression and P-body assembly.</a> Nucleic Acids Res. 44 (13), 6318-6334 (2016).</li>
<li>Ladomery, M., Wade, E., Sommerville, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xp54%2C+the+Xenopus+homologue+of+human+RNA+helicase+p54%2C+is+an+integral+component+of+stored+mRNP+particles+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Xp54, the Xenopus homologue of human RNA helicase p54, is an integral component of stored mRNP particles in oocytes.</a> Nucleic Acids Res. 25 (5), 965-973 (1997).</li>
<li>Wühr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+proteomics+of+the+Xenopus+laevis+egg+using+an+mRNA-derived+reference+database%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep proteomics of the Xenopus laevis egg using an mRNA-derived reference database.</a> Curr Biol. 24 (13), 1467-1475 (2014).</li>
<li>Kurien, B. T., Dorri, Y., Dillon, S., Dsouza, A., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+western+blotting+for+determining+antibody+specificities+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An overview of western blotting for determining antibody specificities for immunohistochemistry.</a> Methods Mol Biol. 717, 55-67 (2011).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Western blotting: an introduction.</a> Methods Mol Biol. 1312, 17-30 (2015).</li>
<li>Fisher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%3A+key+features+and+resources+of+the+Xenopus+model+organism+knowledgebase%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase.</a> Genetics. 224 (1), iyad018(2023).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+anarchy%3A+a+call+to+order%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibody anarchy: a call to order.</a> Nature. 527 (7579), 545-551 (2015).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+crisis%3A+blame+it+on+the+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reproducibility crisis: blame it on the antibodies.</a> Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).</li>
<li>Martin, S. A., Page, S. J., Piccinni, M. Z., Guille, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirming+antibody+specificity+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Confirming antibody specificity in Xenopus.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2020 (12), (2020).</li>
</ol>

הבנת מנגנונים תאיים מחייבת ניטור של מיני חלבונים ספציפיים. שאלות נפוצות כוללות כיצד הם משתנים בביטוי מרחבי וזמני, עם אילו חלבונים הם מתקשרים, ואם הם משתנים בתגובה לתנאים שונים. Immunoblotting, הידוע בכינוי "Western blotting", הוא מתודולוגיה מרכזית להתמודדות עם אתגרים אלה. ניסוי אימונו-בלוט מפריד חלבונים מדגימה מורכבת - למשל, ליזאט של תא שלם - ומזהה אותם באמצעות נוגדנים. באופן ספציפי, חלבונים עוברים דנטורציה ולאחר מכן מופרדים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) לפי גודל. החלבונים המפוצלים בגודל מועברים לתמיכה מוצקה, כגון קרום ניטרוצלולוזה, והחלבון המעניין מזוהה באמצעות ריאגנטים של נוגדנים. אימונובלוטינג הפך לחלק סטנדרטי מארגז הכלים של הביולוג המולקולרי. הוא משמש בדרך כלל לניטור ביטוי חלבונים בהקשרים שונים או כנקודת קצה לניסויים כגון מבחני משקעים חיסוניים. למרות היתרונות הללו, ניתוח רמות חלבון במצב יציב עם אימונובלוטינג מוכיח את עצמו כמאתגר, מכיוון שהבדיקה חייבת להיות אופטימלית עבור כל שלב והקשר ניסוי (איור 1).
הקשר מאתגר אחד הוא ניתוח חומר מצפרדע הטפרים האפריקאית Xenopus laevis. X. laevis הוא אורגניזם חשוב לחקר אינטראקציות רנ"א-חלבון. למערכת זו יתרונות רבים, ובראשם העובדה ש-X. laevis מייצר מאות ביציות ובהמשך מתפתח באופן סינכרוני עוברים בכל פעם. לכל ביצית יש ~25 מיקרוגרם של חלבוןשאינו חלמון 1, המספק חומר בשפע לניסויים ביוכימיים. הגודל הגדול (~1250 מיקרומטר)1 של ביציות ועוברים מקל גם על מיקרו-הזרקת mRNA לבטא באופן אקסוגני חלבונים מתויגים או מוטנטיים בקנה מידה2. תכונות אלו מאפשרות ניסויים רבי עוצמה לבחון בקרה תרגומית ב-X. laevis, כגון בדיקת הפונקציה הקשירה, שבה ניתן להעריך את ההשפעה של חלבון רגולטורי תרגומי על mRNA ללא קשר ליכולתו של אותו חלבון לקשור RNA 3,4,5,6. עם זאת, אימונובלוטינג בביציות ובעוברים של קסנופוס מלווה בקשיים, כולל הפרעות ממסות גדולות של טסיות חלמוןבתאים מוקדמים אלה, אשר יטשטשו את התוצאות אם לא יוסרו.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי לאימונובלטינג יעיל ב-X. laevis, עם דגש על זיהוי חלבונים רגולטוריים תרגומיים. אנו מספקים הוראות כיצד לאסוף ולעבד ביציות ועוברים כדי לדמות את הכתם החיסוני הסופי. כלולות גם הוראות מפורטות להעמסה והדמיה אופטימלית של חלבון, כמו גם מניעת זיהום חלמון של הדגימה. בנוסף, אנו דנים בשינויים אפשריים בפרוטוקול ובאסטרטגיות למציאת נוגדנים התואמים לחלבוני קסנופוס . בכוונתנו לספק לחוקרים הדרכה לבצע ללא מאמץ אימונובלוטינג כחלק מהניסויים שלהם באורגניזם מודל זה שאינו מנוצל כראוי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69139/69139fig1.jpg"> 
איור 1: זרימת עבודה עבור הכנת דגימת Xenopus וניתוח אימונובלוט לאחר מכן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69139/69139fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>עטיפת פרימיום כבדה בגודל 100 רגל רבוע</td><td>סארן</td><td>2570000130</td><td></td></tr><tr><td>10x Cell Lysis Buffer</td><td>טכנולוגיית איתות סלולרי</td><td>#9803</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואנול</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>תבנית אפייה/הגשה מוארכת בנפח 2 רבע</td><td>פיירקס</td><td>71160010116</td><td></td></tr><tr><td>2x בופר דגימות Laemmli</td><td>ביו-ראד</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-HA עם זיקה גבוהה</td><td>רוש</td><td>11867423001</td><td>הוכן לפי ההוראות ומשמש בדילול של 1:10,000.</td></tr><tr><td>אנטי-ארנב IgG, נוגדן המקושר ל-HRP</td><td>טכנולוגיית איתות סלולרי</td><td>7074S</td><td>משומשת בדילול של 1:30,000.</td></tr><tr><td>קלטת אוטורדיוגרפיה, 5 על 7 אינץ'</td><td>Research Products International</td><td>420057</td><td>לא הכרחי אם משתמשים במערכת הדמיה דיגיטלית.</td></tr><tr><td>עלי בל-ארט חד-פעמיים</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>BAF199230001</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ארנב Bicaudal-C (אנושי)</td><td>Envigo Bioproducts (כיום Inotiv)</td><td>לא זמין</td><td>הוזמן בהתאמה אישית. בשימוש בדילול של 1:20,000.</td></tr><tr><td>נוגדן ארנב Bicaudal-C (Xenopus)</td><td>Envigo Bioproducts (כיום Inotiv)</td><td>לא זמין</td><td>הוזמן בהתאמה אישית. בשימוש בדילול של 1:20,000. הפניה פארק ואח', 2016</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>A3294</td><td>תחליף לחלב דל שומן בבופר חוסם.</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5425</td><td>אפנדורף</td><td>13-864-456</td><td></td></tr><tr><td>סרט CL-XPosure</td><td>תרמופישר סיינטיפיק</td><td>34091</td><td>לא הכרחי אם משתמשים במערכת הדמיה דיגיטלית.</td></tr><tr><td>CNOT1 (D5M1K) נוגדן מונוקלונלי לארנב</td><td>טכנולוגיית איתות סלולרי</td><td>#44613</td><td>בשימוש בדילול של 1:2,000.</td></tr><tr><td>DDX6/RCK (D26C11) נוגדן מונוקלונלי לארנב</td><td>טכנולוגיית איתות סלולרי</td><td>#8988</td><td>משתמשים בדילול של 1:5,000.</td></tr><tr><td>E-Z Store ו-Pour Developer</td><td>הדמיית MXR</td><td>103633</td><td>לא הכרחי אם משתמשים במערכת הדמיה דיגיטלית.</td></tr><tr><td>E-Z Store ו-Pour Fixer</td><td>הדמיית MXR</td><td>114511</td><td>לא הכרחי אם משתמשים במערכת הדמיה דיגיטלית.</td></tr><tr><td>נוגדן מונוקלונלי GAPDH</td><td>פרוטינטק</td><td>60004-1-Ig</td><td>משמש בדילול של 1:40,000.</td></tr><tr><td>משחרר ג'ל</td><td>ביו-ראד</td><td>#1653320</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד עכבר IgG (H+L) לעזים, HRP</td><td>Invitrogen</td><td>A16066</td><td>הוכן לפי ההוראות ומשמש בדילול של 1:40,000.</td></tr><tr><td>חבילת קרח, 8 אונקיות, 5 x 3 x 1"</td><td>יולין</td><td>S-18256</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>מעבד פילם רפואי</td><td>קוניקה מינולטה</td><td>SRX-101A</td><td>לא הכרחי אם משתמשים במערכת הדמיה דיגיטלית.</td></tr><tr><td>מיני-פרוטיאן&nbsp; מנוף פתיחת קלטות</td><td>ביו-ראד</td><td>#4560000</td><td></td></tr><tr><td>מיני-פרוטיאן&nbsp; תא אלקטרופורזה אנכית טטרה</td><td>ביו-ראד</td><td>#1658004</td><td></td></tr><tr><td>מיכל אלקטרופורזה MSE PRO 700 מ"ל Western Blot</td><td>MSE Supplies</td><td>BB2369</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת ניטרוצלולוז, 0.45 ומיקרו; m</td><td>ביו-ראד</td><td>#1620115</td><td></td></tr><tr><td>חלב יבש דל שומן</td><td>סנאלאק</td><td>1570000180</td><td></td></tr><tr><td>פרוקסידאז אפיני Pure Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-035-003</td><td>הוכן לפי ההוראות ומשמש בדילול של 1:100,000.</td></tr><tr><td>פוליסורבייט (טווין) 20</td><td>ביוריאגנטים של פישר</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>פונסו S</td><td>מדעי החיים של VWR</td><td>K793-500ML</td><td>ניתן לבצע קירוב עם 0.5% Ponceau S, 1% חומצה אצטית</td></tr><tr><td>ספק כוח בסיסי של PowerPac</td><td>ביו-ראד</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>נדנדה דו-ממדית PR1MA במהירות משתנה</td><td>MidSci</td><td>R2D-30</td><td></td></tr><tr><td>סולם תקני חלבון דו-צבעי Precision Plus</td><td>ביו-ראד</td><td>#1610374</td><td>ניתן להשתמש בכל סולם חלבון לבחירה.</td></tr><tr><td>נייר פילטר כרומטוגרפיית תאית טהורה, 0.35 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-714-4</td><td></td></tr><tr><td>שחזור בופר הפשטת הכתמים המערביים</td><td>תרמופישר סיינטיפיק</td><td>#21059</td><td></td></tr><tr><td>כלוריד נתרן</td><td>פישר כימיקל</td><td>S640-10</td><td></td></tr><tr><td>תיבת אחסון 300 מ"ל</td><td>רוסטי מפאל</td><td>RST46608</td><td>לחסימת ממברנת ניטרוצלולוז, דגירה של נוגדנים ושטיפות</td></tr><tr><td>מצע הרגישות המרבית של SuperSignal West Femto</td><td>תרמופישר סיינטיפיק</td><td>#34094</td><td>מצע כימילומינסנטי משופר (ECL) הכולל שני רכיבים: לומינול ומגביר. מגיב ECL זה בעל רגישות נמוכה לפמטוגרמות.</td></tr><tr><td>מצע כימילומינסנצנטי SuperSignal West Pico PLUS</td><td>תרמופישר סיינטיפיק</td><td>#34580</td><td>מצע כימילומינסנטי משופר (ECL) הכולל שני רכיבים: לומינול ומגביר. למגיב ECL זה יש רגישות לפיקוגרם לפמטוגרמה.</td></tr><tr><td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 4&ndash; 12%, 10 ג'לים פוליאקרילאמיד באר</td><td>GenScript</td><td>M00652</td><td></td></tr><tr><td>אבקת בופר העברה</td><td>GenScript</td><td>M00652</td><td></td></tr><tr><td>טריס בסיס אולטרפיור</td><td>USBiological</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>אבקת בופר ריצה Tris-MOPS-SDS</td><td>GenScript</td><td>M00138</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח אופטימלי של חלבונים מביציות קסנופוס ועוברים על ידי immunoblotting

Optimized Analysis of Proteins from Xenopus Oocytes and Embryos by Immunoblotting

כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול החיסון שלנו, ניתחנו חלבוני בקרה תרגומיים מתויגים ואנדוגניים בשלושה סוגים של דגימות X. laevis: ביציות שלב VI, עוברים שלב 7 (בלסטולה) ועוברים שלב 10.5 (גסטרולה). שלבים אלה נבחרו מכיוון שהם משתרעים על פני מעבר אמצע הבלסטולה (שלב 8.5), המסמן את תחילתו של שעתוק זיגוטי חזק13,14. מכיוון שהתפתחות לפני המעבר לאמצע הבלסטולה מתרחשת בהיעדר שעתוק, עוברים פרה-זיגוטיים (כלומר, נשלטים על ידי האם) מסתמכים במידה רבה על מנגנוני בקרה תרגומיים כדי לבטא חלבוני גורל תאים ברזולוציה הזמנית והמרחבית הנכונה15. לכן, המעבר באמצע הבלסטולה הוא הקשר חיוני לחקר אינטראקציות RNA-חלבון.
כדי לנתח את ביטוי החלבון באמצעות אימונובלוטינג, הוזרקו ביציות ועוברים של X. laevis עם 500 pg של mRNA המקודד את המחצית הטרמינלית C של X. laevis Bicaudal-C (Bicc1) שהתמזגה ל-3x תגי זיקה של המגלוטינין (HA). בחרנו לנתח את Bicc1 בשל הרלוונטיות שלו לביולוגיה של Xenopus ולאינטראקציות חלבון-RNA. Bicc1 הוא חלבון קושר mRNA ומדכא תרגומי המנחה את החלטות גורל התא בעובר המוקדם 16,17,18. מאוחר יותר בהתפתחות, הוא משפיע על דפוס שמאל-ימין 19,20,21 ועל תפקוד האיברים, כולל הכליות 22,23,24,25. Bicc1 מכיל אזור המכוון דיכוי תרגומי5 ותחומי הומולוגיה של hnRNP K (KH) המתווכים קשירה ל-mRNAs ספציפיים 5,26,27,28.
תמציות הוכנו מחמש ביציות או עוברים שהוזרקו על ידי HA-Bicc1, יחד עם דגימות תואמות שלא הוזרקו כבקרות שליליות. עשירית מכל תמצית עברה אלקטרופורזה על ג'ל ביס-טריס בשיפוע של 4-12% והועברה רטובה על קרום ניטרוצלולוזה. צביעת פונסו של הממברנה כדי לזהות את החלבון הכולל אישרה העברה מוצלחת (איור 3A). כחלק מהמחקרים שלנו, יצרנו נוגדן בארנבים שמזהה את המחצית הטרמינלית C של חלבון Bicc1 האנושי. הנוגדן הזה שימש לאיתור חלבון Xl-Bicc1 אנדוגני ואקסוגני (איור 3B). עבודות קודמות הראו כי חלבון Bicc1 נעדר מביציות X. laevis , אך מתבטא בעוברים טרום-MBT, לפני שהגנום הזיגוטי פעיל16. זה מצביע על כך שבעוד ש-Bicc1 mRNA מצטבר במהלך הביציות, הוא מדוכא בתרגום. בהסכמה עם עבודה קודמת זו, Bicc1 אנדוגני לא זוהה בביציות. לעומת זאת, הנוגדן זיהה Bicc1 אנדוגני (~MW 107 kDa) בעוברים בשלב 7 ו-10.5. יחד, התוצאות האלה מאמתות שהנוגדן מזהה את החלבון האנדוגני Bicc1 (איור 3B, פאנל עליון, ראש חץ אדום). נוגדן Bicc1 זיהה חלבון קטן יותר של כ-70 kDa בתמציות שהוכנו מדגימות שהוזרקו על ידי mRNA (איור 3B, פאנל עליון, ראש חץ שחור, השווה נתיבים 2, 4 ו-6 עם נתיבים 1, 3 ו-5). כבקרה על הספציפיות של נוגדן Bicc1, הממברנה הופשטה ונבדקה מחדש עם נוגדן כנגד תג הזיקה של HA. נוגדן ה-HA זיהה את החלבון 70 kDa בדגימות שהוזרקו, אך לא זיהה את ה-Bicc1 האנדוגני (איור 3B, פאנל שני, ראש חץ שחור). זיהוי ה-HA-Bicc1 C-term משתנה בעוצמתו בין השלבים עקב הבדלים בביטוי החלבון מה-mRNA המוזרק בסוגי התאים השונים.
לאחר מכן, הרחבנו את התוצאות על ידי בדיקת הביטוי של חלבונים רגולטוריים תרגומיים אנדוגניים המקיימים אינטראקציה עם Bicc1. ראשית, ניתחנו את הביטוי של Ccr4-Not Transcription Complex Subunit 1 (Cnot1), חלבון פיגום גדול וחלק מקומפלקס Ccr4-Not deadenylase (CNOT). קומפלקס CNOT מרובה תת-יחידות הוא אחד הדדנילאזים האיקריוטיים העיקריים וידוע בעיקר בגיזום זנב הפולי (A) בקצה ה-mRNA השליח כהקדמה לפירוקם. עם זאת, לקומפלקס זה יש תפקידים מגוונים בבקרת תרגום המשתרעים מעבר לדדנילציה29. היינו מעוניינים לבחון את ביטוי Cnot1 בשל חשיבותו של קומפלקס CNOT לוויסות mRNA ותצפיות קודמות ש-Cnot1 מקיים אינטראקציה עם Bicc120,30. כדי לנתח את ביטוי Cnot1, השתמשנו בנוגדנים המזהה את החלבון האנדוגני Cnot1. הוא זיהה שני חלבונים ב-250 kDa ו-270 kDa בכל דגימה, הגודל החזוי של Cnot1 (איור 3B, פאנל שלישי). לפיכך, פרוטוקול זה מאפשר לנו לזהות בקלות מרכיב קריטי של קומפלקס רגולטורי. בנוסף, נתונים אלה תומכים ביכולתו של הפרוטוקול לזהות בהצלחה חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה.
כדי לבחון עוד יותר את יכולת ההכללה של תוצאות אלה, ניתחנו לאחר מכן דגימות לנוכחות של הליקאז בולט DEAD-box המעורב בדיכוי תרגומי, הליקאז 6 (Ddx6, שנודע בעבר כ-xp54 ב-Xenopus ו-me31b בדרוזופילה). Ddx6 הוא מרכיב חשוב בגרגירי ריבונוקלאופרוטאין, מעורב באחסון mRNA ומקיים אינטראקציה עם Bicc1 ו-Cnot1 6,31,32. נוגדן שזיהה את ה-Ddx6 האנדוגני זיהה חלבון של כ-54 kDa בכל דגימה (איור 3B, פאנל רביעי). הביטוי הופחת בעוברים זיגוטיים (איור 3B, השווה נתיבים 5 ו-6 ל-1-4), כפי שדווח קודם לכן33.
לבסוף, כדי להבטיח שההבדלים שראינו בין הדגימות נובעים מהבדלים בביטוי, הפשטנו וחקרנו מחדש את הכתם החיסוני עם נוגדן המזהה את האנזים גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (Gapdh). Gapdh משמש כ"בקרת העמסה" המתבטאת בכל מקום. רמות שוות ערך של ביטוי Gapdh מאשרות את צביעת פונסו: כמות שווה של חלבון כולל מנותחת על פני דגימות (איור 3B, פאנל חמישי).
יחד, תוצאות אלו מאשרות את יעילותה של שיטת אימונו-בלוט זו. הצלחנו לזהות Bicc1 אקסוגני ואנדוגני על פני שלבי התפתחות מרובים של X. laevis הרלוונטיים לחקר אינטראקציות RNA-חלבון: ביציות ועוברים טרום-MBT, המכילים רק mRNA שהושקעו על ידי האם, ועוברים לאחר MBT, הכוללים גם mRNA משועתקים זיגוטית. הצלחנו להכליל את התוצאות הללו על ידי ניתוח הביטוי של חלבוני בקרה תרגומיים מרובים במגוון משקלים מולקולריים (Bicc1, Cnot1 ו-Ddx6) ובקרת העמסה (Gapdh). אנו גם מראים שפרוטוקול זה יכול לשמש עבור עוברי X. tropicalis עם שינוי כדי להגדיל את כמות החומר המשמשת כדי להסביר את גודלם הקטן יותר (איור משלים 1).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69139/69139fig3.jpg"> 
איור 3: זיהוי רמות של חלבונים רגולטוריים תרגומיים באמצעות אימונובלוטינג ב- X. laevis. (A) צביעת Ponceau של הכתם החיסוני לזיהוי חלבון כולל מביציות X. laevis שלב VI, עוברים בשלב 7 ועוברים בשלב 10.5. כל נתיב מייצג 10% מהחלבון המוכן מתמצית (0.5 ביצית או עובר). (B) ניתוח אימונובלוט של חלבונים רגולטוריים תרגומיים נבחרים של X. laevis בביציות שלב VI, עוברים בשלב 7 ועוברים בשלב 10.5. נתיבים 2, 4 ו-6 תואמים לדגימות שהוזרקו עם מיקרו-RNA HA-Bicc1 לפני הניתוח, בעוד שנתיבים 1, 3 ו-5 משמשים כבקרות שליליות (לא מוזרקות). נוגדן α-Bicc1 שימש לבדיקת ביטוי של Bicc1 אנדוגני על פני שלבים (פאנל עליון). לאחר מכן הכתם הופשט ונבדק מחדש עם נוגדן לתג הזיקה HA כבקרה על ספציפיות נוגדנים α-Bicc1 (פאנל שני). כתמים הופשטו ונבדקו מחדש עבור חלבונים רגולטוריים נוספים באמצעות α-Cnot1 (פאנל שלישי) ו-α-Ddx6 (פאנל רביעי). α-Gapdh (הפאנל התחתון) שימש כבקרה להעמסת חלבון שווה. ראשי חץ אדומים מסמנים את המיקום של Bicc1 אנדוגני, בעוד ראשי חץ שחורים מסמנים את המיקום של HA-Bicc1 C-term המתבטא באופן אקסוגני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69139/69139fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: ניתוח אימונובלוט של חלבון Bicc1 ב-Xenopus laevis לעומת Xenopus tropicalis. נוגדן α-Bicc1 שימש לבדיקת ביטוי של Bicc1 אנדוגני ואקסוגני על פני כמויות שונות של תמצית עובר X. laevis ו-X. tropicalis . נתיב 1: 0.5 עובר X . laevis לא מוזרק. נתיב 2: 0.5 HA-Bicc1 הוזרק לעובר X. laevis . נתיב 3: 3 עוברי X. tropicalis לא מוזרקים. נתיב 4: 1 עובר X. tropicalis לא מוזרק. נתיב 5: 0.5 עובר X. tropicalis לא מוזרק. נעשה שימוש בשני נוגדנים המזהים את Bicc1 האנדוגני: האחד מורם כנגד Bicc1 אנושי (פאנל עליון) והשני מורם כנגד X. laevis Bicc1 (פאנל אמצעי). α-Gapdh (פאנל תחתון) שימש לבקרה על עומס חלבון שווה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69139/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

ניתוח אופטימלי של חלבונים מביציות קסנופוס ועוברים על ידי Immunoblotting

Analysis of proteins by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by immunoblotting (western blotting) is a vital ...

optimized-analysis-proteins-from-xenopus-oocytes-embryos

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Immunoblotting (המערבי סופג) הוא assay מהיר ורגיש לגילוי ואפיון של חלבונים אשר עובד על ידי ניצול סגוליות הטמון בזיהוי אנטיגן נוגדן. וידאו זה מספק פרוטוקולים להפרדת חלבון, חלבונים סופג על ממברנות, immunoprobing, להדמיה באמצעות מצעים chromogenic או chemiluminescent.

Immunoblot ניתוח

פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

השאלה כיצד הכרומטין רגולטורים ומדינות הכרומטין משפיעה על הגנום in vivo הוא מפתח להבנה של איך מוקדם החלטות גורל התא נעשות בעובר המתפתח שלנו. שבב Seq-הגישה הפופולרית ביותר לחקור תכונות הכרומטין ברמה-הוא גלובלית המפורטים כאן לעוברי צפרדעים.

Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים על ידי שבב Seq

בקרת סינתזת חלבונים מתרחשת בעיקר בשלב התחלת התרגום, ליקויים בו קשורים להפרעות מגוונות. כדי להבין טוב יותר את האטיולוגיה שלהם, תיארנו כאן פרוטוקול המשתמש בביציות Xenopus laevis המעריך את התרגום של תעתיק mos בנוכחות מוטציה של גורם התחלת התרגום eIF4G1.

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

מתוארת טכניקה חדשה לאיתור קולטנים אנדוגניים בשפע נמוך הקיימים בעוברי דג הזברה. קראנו לו AFLIP מכיוון שהוא מורכב מתיוג זיקה של הקולטן על ידי הליגנד שלו המקושר למשקעים חיסוניים.

איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

שיטה זו מתארת בגישה לשחזור ועמיד עבור ההשוואה של רמות החלבון ברקמות שונות, timepoints התפתחותיים שונים באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי blotting בגישה.

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-קריואיפקס, בה חלבון ממברנה APEX2 מתויג יכול להיות מקומי על ידי שידור אלקטרון מיקרוסקופ בתוך מבנה מיטבי משומר התא.

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

כאן אנו מתארים אפיון פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסות של שושלות תאים עם גורלות רקמות ידועים בעובר בעל חוליות Xenopus laevis .

ספקטרומטריית מסה מונחית שושלת תאים פרוטאומיקה בעובר המתפתח (צפרדע)

דגי זברה המכוונים לאלקטרופילים ומחמצנים תגובתיים (Z-REX) היא שיטה מבוססת ביולוגיה כימית לחקר איתות תגובתי של מולקולות קטנות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על דגים חיים בשלבי התפתחות שונים. כאן, אנו משלבים בדיקות סטנדרטיות בדגי זברה עם Z-REX לניתוח מסלולי איתות.

ניטור תגובות איתות ממוקדות בדגי זברה זחלים - Z-REX חושף מנגנונים מדויקים של תרופות אלקטרופיליות ומטבוליטים

למד פרוטוקול אימונובלוטינג לניתוח חלבונים מביציות ועוברי קסנופוס. השיטה מאפשרת זיהוי רגולטורים תרגומיים ומספקת בסיס להשוואת מנגנוני בקרת סינתזת חלבונים בהתפתחות.

ניתוח אופטימלי של חלבונים מביציות קסנופוס ועוברים על ידי Immunoblotting

גלה סרטונים נוספים