Immunoblotting כמותית של שורות תאים כסטנדרט לאימות Immunofluorescence לכימות תנועת סמן חלבונים בדגימות הרקמות שגרתיות

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפתולוגיה של סרטן, על ידי כימות חלבונים סמנים ביולוגיים מחומר ביופסיה מעובד באופן שגרתי. היתרונות העיקריים של טכניקה זו ביחס אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית, הם כי הוא אובייקטיבי, יש מגוון דינמי רחב, ומאפשר כימות של חלבונים בסוגי תאים ספציפיים. נוכחות או היעדר של חלבונים מסוימים שנקרא סמן ביולוגי, או יותר במיוחד, השפע היחסי של חלבונים אלה בדגימות ביופסיה סרטן יכול להיות מאוד שימושי בקבלת אבחנה פתולוגית ספציפית של סוגים מסוימים של סרטן.

אבל זה יכול להיות גם שימושי בחיזוי התגובה לטיפולים בסרטן, ולכן טכניקה זו רלוונטית הן לאבחון והן לטיפול בחולים עם סרטן. פרוטוקול זה עוסק בעיקר באופן השימוש בכימות חלבונים בקווי תאים מונצחים כדי לאמת את האופי הכמותי של ההתמדה המבוססת על כשל חיסוני. אבל חשוב לציין כי immunofluorescence יכול בקלות להיות משולב לתוך גישה multiplexed, ולהחיל על דגימות ביופסיה ראשוניות.

מי שיסייעו וידגים הליך זה יהיו לי בודרו, טכנאי, ושיקל וירק, מנהל התפעול. שניהם ממעבדת המלכה לפתולוגיה מולקולרית. כדי להתחיל, צנטריפוגה התאים שנקטפו בעבר בצינור חרוט 50 מיליליטר ב 225 Gs במשך חמש דקות.

Decant supernatant, ולתלות מחדש את גלולת התא ב10 מיליליטר של PBS. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים המתווסת ב 225 Gs במשך חמש דקות. להשעות את גלולת התא עם 10 מיליליטר של 10%NBF.

ואז לה הדגיר את התאים בטמפרטורת החדר על נדנדה ב 24 RPMs לילה. לאחר תיקון התאים, צנטריפוגה התאים ב 225 Gs במשך חמש דקות. לאחר מכן להסיר את supernatant ולתלות מחדש את התאים ב 500 microliters של PBS.

מעבירים את התאים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ומעבירים את התאים באמצעות צנטריפוגה. לאחר מכן, שאף את העל-טבעי. הוסף כ 500 microliters של 1%agarose פתרון לכל צינור המכיל תאים.

לאחר מכן, פיפטה את התערובת למעלה ולמטה לערבב. לאחר פתרון התא agarose מתקשה, להוסיף מיליליטר אחד של 10%NBF לצינורות. מאוחר יותר, להסיר את NBF מן הדגימות.

השתמש בסכין גילוח כדי להסיר את תקע התא, והכנס את התקע לקלטת רקמת פלסטיק. עבד דגימות בן לילה עם מעבד רקמות אוטומטי. לאחר מכן, להטמיע את הדגימות שעווה פרפין, באמצעות שיטות היסטולוגיה סטנדרטיות.

באמצעות מכשיר מערך רקמות, לקצור ליבות כפולות 6 מילימטר מבלוק הפרפין, ולהכניס אותם לתוך בלוק פרפין ריק. לאחר מכן, השתמש במיקרוטום כדי להכין שני חלקים היסטולוגיים של קו התאים החדש שנוצר, TMA. לאחר מכן הר את החלקים על מגלשת היסטולוגיה, ו deparaffinize אותם.

תחילה, טען את שתי השקופיות של קו התא TMA למערכת הכתמים האוטומטית. הכתם צד אחד בדילול הנוגדנים הראשוני האופטימלי, והשאיר את הצד השני כמגלשת בקרה שלילית. לשתי השקופיות, יש למרוח הסכם נגד גרעיני ונוגדן משני.

לאחר תהליך הכתמים, מוסיפים את הרטירמיד אות הגברה reagents. לאחר מכן, לסרוק את השקופיות immunostained באמצעות גלי העירור והאיתור המתאימים עבור פלואורופורים ששימשו. השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי לזהות את התא התא המעניין, בין אם גרעין או ציטופלסמה, ולכרות את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת, או MFI, עבור כל שורה.

כדי לקבוע לאיזה קו תא יש את השפע הגדול ביותר של חלבון היעד, אלקוט מוכן ליקר התא לפזר לתוך צינורות microcentrifuge. לאחר מכן הוסיפו 2.5 מיקרוליטרים של חיץ 6x laemly, ומספיק מאגר תמיסת RIPA כדי להביא את הנפח הכולל ל-15 מיקרוליטרים. לאחר מכן, לטעון ג'ל דף SDS, עם סולם חלבון, ואת הדגימות שהוכנו בעבר.

לאחר מכן, לטעון חיץ laemly לתוך בארות ריקות. מפעילים את הג'ל עד שהצבע הכחול מגיע לתחתית הצלחת. לאחר ביצוע העברת חלבון יבשה למחצה, השתמשו בסכין גילוח כדי לחתוך את הממברנה אופקית כדי להפריד את החלבון המעניין מחלבון הבקרה.

בצע חסימות ודגירה נוגדנים על פי הוראות היצרנים. לאחר מכן מניחים את רצועות הממברנה בשקית ניילון שקופה. השתמש P1000 פיפטה כדי לכסות את הממברנות עם תערובת ECL.

לאחר מכן לאטום את השקית, ולהידגר את הממברנות בטמפרטורת החדר בחושך במשך 1 עד 2 דקות. לאחר מכן, מניחים את שקית הניילון המכילה את הממברנות בפלטפורמת הדמיה דיגיטלית. השתמש chemiluminescence וזיהוי סמן colorimetric כדי ללכוד חשיפות שונות של הממברנה.

באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, או תצפית חזותית, לקבוע איזה קו תא מבטא את החלבון היעד ביותר. לאחר immunoblotting דילול סדרתי של קו תא זה, לפתוח את תמונות החשיפה באמצעות תוכנה לניתוח תמונה. השתמש בכלי בחירות מלבניות כדי לבחור את הנתיב הראשון של הג'ל.

לאחר מכן עבור לניתוח, ג'לים, ובחר נתיב ראשון. חזור על תהליך זה על-ידי הזזת כלי הבחירות המלבני לנתיב הבא, עבור לניתוח, ג'לים ובחר בנתיב הבא. לאחר מכן, עבור לניתוח, ג'לים, ותווי עלילה.

השתמש בכלי הקו הישר כדי לצייר קווים לאורך הבסיסים של כל שיא, כדי להסיר את רעשי הרקע. לאחר מכן השתמש בכלי שרביט כדי לבחור כל שיא, ולקבל את עוצמת הפס של כל שיא מחלון התוצאות. צור פיזור בעוצמת הלהקה לעומת כמות החלבון הכוללת שנטענה עבור כל נוגדן ראשי באמצעות תפוקת הצפיפות.

לאחר מכן, השתמש בקו של התאמה הטובה ביותר ותצפית חזותית כדי לקבוע את המיקום של הטווח הדינמי ליניארי של כל נוגדן. בחר ריכוז חלבון המניב עוצמת פס בטווח ליניארי, ולבצע immunoblot של כל קו התא lysates עם ריכוז חלבון זה, כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, בצעו צפיפות בסריקות הדיגיטליות, ובחרו חשיפות המניבות אותות בטווחים ליניאריים שזוהו בעבר עבור כל נוגדן.

לאחר מכן, לחשב את היחס של עוצמת רצועת חלבון היעד לטעינת עוצמת רצועת הבקרה עבור כל קו תא. לבסוף, השתמש בתוכנה סטטיסטית כדי לבצע בדיקת מתאם פירסון בין הערכים המתקבלים מניתוח תמונה של כתמי IF, ואלה המתקבלים immunoblotting. פרוטוקול זה שימש כדי לאשר את היכולת של IF כדי לקבוע את הכמות היחסית של חלבון אנטי אפטומטי Bcl-2.

דילולים משתנים של הנוגדן העיקרי נבדקו על רקמת השקדים האנושית עם מכתים אימונוהיסטולוגיה. עבור ניסוי זה, דילול של 1 עד 50 נקבע להיות הדילול האופטימלי שהניב אות חזק עם מעט רעשי רקע. דילול זה שימש כדי להכתים את קו התא TMA על ידי immunofluorescence, וניתוח תמונה שימש לכמת את האות Cytoplasmic Cy5 המיוחס Bcl-2.

בהתבסס על האימונובלו לכל קווי התאים שנבדקו, לגרנטה-519 היה השפע הגדול ביותר של Bcl-2. לאחר מכן נעשה שימוש באימונובלו של הדילול הסדרתי של ליזאט Granta-519 כדי למצוא את הטווח הדינמי ליניארי של Bcl-2, ולשלוט בחלבון GAPDH. הטווח הדינמי עבור Bcl-2 בהקשה זו נע בין עוצמת הלהקה של כמעט 0, ל 7500 יחידות.

הטווח הדינמי של GAPDH נע בין 3000 ל-6500 יחידות. האימונובלו חזר על עצמו עם חשיפות בטווח ליניארי זה. והיחס בין Bcl-2 ל- GAPDH חושב עבור כל קו תא.

בדיקת מתאם פירסון הראתה כי יחסי האינטנסיביות של immunoblotting היו חזקים באופן חיובי בקורלציה עם קריאות אינטנסיביות של IF כמותי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לחשוף את הממברנה הסופית עבור נקודות זמן מרובות, על מנת למצוא את החשיפה האופטימלית שבה כל הלהקות נמצאות בטווחים ליניאריים בהתאמה. לאחר אימות האופי הכמותי של פרוטוקול IF, ניתן לשנות אותו עבור מולטיפלקס IF, בדגימות רקמה מעובדות באופן שגרתי על מנת לענות על שאלות קליניות כגון היכן מתבטא חלבון יעד.