Test per alimenti geneticamente modificati

Gli alimenti geneticamente modificati sono prodotti che contengono uno o più ingredienti il cui DNA è stato specificamente alterato. La presenza di queste modifiche può essere rilevata utilizzando una tecnica chiamata reazione a catena della polimerasi.

La modificazione genetica degli alimenti è stata una questione controversa a causa delle preoccupazioni dibattute sulla salute e la sicurezza ambientale. La capacità di rilevare il DNA geneticamente modificato in campioni alimentari di interesse consente un processo decisionale informato sulla sicurezza e sui potenziali pericoli dell'uso di organismi geneticamente modificati, o OGM, nelle forniture alimentari.

La reazione a catena della polimerasi, o PCR, viene utilizzata per amplificare il DNA alimentare per determinare la presenza o l'assenza di sequenze geneticamente modificate. L'elettroforesi su gel estrae quindi il DNA amplificato attraverso una matrice di gel di agarosio e separa bande di DNA di diverse dimensioni che corrispondono a marcatori modificati o non modificati. Questi vengono poi confrontati con le bande di controllo di alimenti noti per contenere OGM o noti per essere privi di modifiche.

Questo video illustrerà i principi alla base della rilevazione del DNA geneticamente modificato da campioni di alimenti, come estrarre il DNA e amplificare i marcatori utilizzati nel processo di modificazione genetica e come stabilire la presenza o l'assenza di OGM nei campioni di alimenti.

La reazione a catena della polimerasi identifica le sequenze di DNA che sono state inserite nell'alimento geneticamente modificato. Il DNA è una molecola relativamente stabile, quindi i frammenti di DNA vitali adatti all'amplificazione possono essere isolati anche da prodotti altamente lavorati, come patatine di mais o hamburger di verdure. Un piccolo numero di sequenze regolatorie di DNA viene utilizzato per controllare l'espressione dei geni inseriti, quindi queste sequenze sono presenti nella maggior parte delle colture GM. Questa procedura identifica due dei più comunemente usati, il gene del promotore 35S e il gene terminatore della nopalina sintasi. La sequenza 35S è un forte promotore e, quando si attacca a un gene inserito, guida livelli costanti ed elevati di espressione. Il terminatore della nopalina sintasi è incluso per interrompere la trascrizione del gene inserito all'endpoint desiderato.

La PCR prevede cicli ripetitivi di riscaldamento e raffreddamento in un termociclatore, una macchina che controlla rigorosamente la temperatura delle provette di reazione della PCR. Riscaldamento del campione a 94 ? C provoca la denaturazione e la separazione dei filamenti di DNA. Raffreddamento rapido tra 45 e 65 ? C consente ai primer di ricottura ai filamenti di DNA separati. Infine, riscaldare a 72 ? C consente all'enzima polimerasi Taq di estendere i primer e completare la duplicazione della regione bersaglio.

Il primer per piante acquistato viene aggiunto a ciascun campione e si amplificherà in campioni contenenti DNA vegetale. I modelli positivi per gli OGM per 35S e NOS vengono utilizzati per fornire un controllo positivo per gli OGM. Un certificato non OGM viene utilizzato come controllo negativo. Se una di queste reazioni di controllo mostra bande impreviste, non ci si può fidare dei risultati dei campioni di prova.

Il DNA amplificato viene fatto passare attraverso un gel di agarosio mediante elettroforesi. I prodotti PCR vengono miscelati con un colorante e caricati in pozzetti. Il DNA è caricato negativamente e, quando viene caricato nel gel all'estremità del catodo della camera, si sposterà verso l'estremità dell'anodo quando viene applicata la corrente. I frammenti di DNA più grandi non possono muoversi facilmente attraverso la matrice di gel, quindi rimarranno più vicini al catodo, mentre le sequenze più piccole si muovono verso l'estremità dell'anodo, con conseguente separazione di DNA di dimensioni diverse in bande distinte.

Dopo l'elettroforesi, la colorazione con gel aiuta a visualizzare le bande di DNA separate.

Ora che abbiamo familiarità con i principi alla base del rilevamento degli OGM e dell'uso della PCR e dell'elettroforesi per l'identificazione degli OGM, diamo un'occhiata a come questo può essere effettuato in laboratorio.

Una volta identificati i prodotti alimentari di interesse, si può iniziare l'analisi. Per estrarre il DNA, prendere due provette pulite con tappo a vite, e in ciascuna di queste trasferire 500 ? L del reagente di isolamento del DNA acquistato, assicurandosi di pipettare la miscela su e giù tra le aliquote per miscelare uniformemente il reagente. Etichettare una delle provette come "non OGM" e l'altra come "Test".

Quindi, pesare 0,5 g di cibo certificato non OGM e metterlo in un mortaio pulito. Aggiungere 2,5 ml di acqua distillata e macinare con il pestello per 2 minuti per formare un impasto. Aggiungere altri 2,5 ml di acqua distillata e continuare a macinare l'impasto fino a quando non diventa abbastanza liscio da poter essere pipettato.

Pipetta 50 ? L del liquame noto non OGM alla provetta con tappo a vite etichettata "non OGM" contenente il reagente di isolamento del DNA. Ora aggiungi 50 ? L del campione di cibo di prova al tubo con tappo a vite contrassegnato con "Test". Agitare le due provette contenenti i campioni di cibo e il reagente del DNA per 1 minuto. Quindi, mettere i tubi a bagnomaria a 95 ? C per 5 min. Infine, mettere le provette in una centrifuga per 5 minuti. Dopo l'esame, dovrebbe essere formato un pellet solido sul fondo del tubo. Se dopo 5 minuti non si forma un pellet, centrifugare nuovamente per intervalli di 2 minuti fino a quando non si forma un pellet. I campioni possono ora essere utilizzati immediatamente per la PCR o conservati in frigorifero per un massimo di 1 settimana.

Innanzitutto, numera sei provette PCR. Questi numeri corrisponderanno al contenuto del tubo elencato nella Tabella. Posizionare ciascuna delle provette PCR etichettate in un supporto per microprovette con i tappi aperti.

Usando una punta fresca per ogni aggiunta, aggiungi 20 ? L primer indicato nella tabella a ciascuna provetta per PCR. Quindi, aggiungi 20 ? L dei campioni di DNA indicati nella tabella a ciascuna provetta per PCR. Pipettare su e giù per mescolare. Per i campioni pellettati, assicurarsi di pipettare solo dal surnatante ed evitare il pellet solido sul fondo delle provette. Infine, posizionare le provette per PCR in un termociclatore e programmarlo in modo che esegua le fasi di riscaldamento e raffreddamento indicate nella tabella.

Posizionare un gel di agarosio al 3% nella camera di elettroforesi con i pozzetti più vicini all'estremità del catodo. Aggiungere il tampone TAE nella camera per coprire 2 mm sopra il vassoio del gel. Raccogliere le provette per PCR dal termociclatore e metterle in un supporto per microprovette. Utilizzando ogni volta un puntale di pipetta nuovo, aggiungere 10 ? L di colorante di caricamento del DNA acquistato su ciascun campione e mescolare bene.

Usando ogni volta una punta fresca, caricare i pozzetti del gel di agarosio con 20 ? L di righello di peso molecolare in un pozzetto, e 20 ? L di ciascun campione nei pozzetti successivi, come indicato in questa tabella. Impostare la camera di elettroforesi in modo che funzioni a 100 V per 30 minuti.

Una volta che il gel ha terminato di funzionare, scollegare con cautela la camera del gel, rimuovere il vassoio e far scorrere il gel in un vassoio per la colorazione. Immergere il gel nella macchia di gel 100x acquistata per 5 minuti, agitando delicatamente il vassoio per distribuire la macchia. Una volta macchiato, trasferire il gel in un contenitore per il lavaggio e risciacquare con acqua di rubinetto per circa 10 s. Decolorare lavando tre volte in acqua tiepida del rubinetto per 3 minuti ciascuna, ciascuna con una leggera agitazione per ottenere i migliori risultati. Se necessario, continuare a colorare in acqua tiepida fino a raggiungere il contrasto desiderato.

La presenza o l'assenza di una banda di 200 bp nella corsia 4 indica se l'alimento in esame contiene OGM. I primer per piante determinano se il DNA vegetale è stato estratto con successo dal campione. Il controllo degli alimenti non OGM è un indicatore di risultati falsi positivi, qualora si verifichino. Se il controllo alimentare non OGM risulta positivo, significa che la PCR è stata contaminata ad un certo punto. Il controllo del modello OGM-positivo è un indicatore di falsi negativi. Se il controllo del modello OGM-positivo non si amplifica, c'è un problema con la reazione PCR e non ci si può fidare di un risultato OGM-negativo dell'alimento in esame.

I gel possono essere posizionati su una carta bianca o gialla per fornire uno sfondo contrastante per evidenziare le bande di DNA, oppure è possibile ottenere un maggiore contrasto utilizzando una scatola di luce UV.

La capacità di testare alimenti o prodotti per verificare la presenza di ingredienti geneticamente modificati è pertinente a una serie di applicazioni scientifiche o normative.

Ci sono alcune prove che il DNA transgenico proveniente da colture geneticamente modificate può essere introgredito nei genomi delle popolazioni di colture selvatiche. Ad esempio, gli impollinatori possono facilitare questo trasferimento fertilizzando le piante selvatiche con polline proveniente da una fonte geneticamente modificata. Si tratta di una preoccupazione, in quanto gli impatti della diffusione di questi geni inseriti sugli ecosistemi nel loro complesso non sono ben compresi. I test PCR delle popolazioni selvatiche possono fornire dati sulla potenziale diffusione o sul successo del contenimento degli inserti genetici.

La mancanza di etichettatura o l'etichettatura errata degli ingredienti geneticamente modificati può essere una preoccupazione per i consumatori. Ciò può essere dovuto alle preferenze di consumo del consumatore o alla potenziale introduzione di allergeni durante il processo GM, anche se quest'ultimo è controverso. In alcuni paesi, gli ingredienti geneticamente modificati devono essere elencati sulle confezioni degli alimenti. I comitati normativi di tali paesi possono utilizzare i test PCR per verificare l'accuratezza dell'etichettatura degli alimenti.

Laddove la modificazione genetica introdotta in una coltura conferisce resistenza ai pesticidi, alcuni studi hanno sollevato preoccupazioni sulla produzione di "super-erbacce". In sostanza, queste possono essere qualsiasi pianta non inizialmente bersaglio per la modifica che ottiene la resistenza ai pesticidi attraverso meccanismi come l'introgressione o l'ibridazione. Queste piante potrebbero quindi essere in grado di diffondersi con maggiore successo ed essere più difficili da controllare rispetto a quelle senza l'inserto. I test PCR per la modificazione genetica possono aiutare a evidenziare e tracciare tali potenziali popolazioni per determinare se questa diffusione potrebbe rivelarsi problematica.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE ai test per gli alimenti OGM. A questo punto dovresti comprendere i principi alla base dell'identificazione degli alimenti geneticamente modificati mediante PCR, come estrarre e amplificare il DNA dal cibo e come determinare se il tuo campione di cibo è stato geneticamente modificato. Grazie per l'attenzione!