Summary
Este sentido, demuestran la fabricación de estructuras a base de colágeno del tejido, con mioblastos esqueléticos. Estas construcciones de ingeniería 3-D se puede utilizar para sustituir o reparar los tejidos
Abstract
A pesar de que los marcapasos electrónicos para salvar vidas los dispositivos médicos, su rendimiento a largo plazo en pacientes pediátricos puede ser problemática debido a las restricciones impuestas por el tamaño pequeño de un niño y su crecimiento inevitable. En consecuencia, hay una verdadera necesidad de terapias innovadoras diseñadas específicamente para los pacientes pediátricos con trastornos del ritmo cardíaco. Proponemos que una alternativa conductor biológica que consiste en una matriz a base de colágeno que contiene autologously células derivadas de una mejor podrían adaptarse al crecimiento, reducir la necesidad de cirugías recurrente, y en gran medida a mejorar la calidad de vida de estos pacientes. En el presente estudio, se describe un procedimiento para la incorporación de cultivos primarios de células con mioblastos esqueléticos dentro de una matriz de hidrogel para diseñar una construcción de tejido quirúrgicamente implantable que servirá como un conducto eléctrico entre las cámaras superior e inferior del corazón. En última instancia, esperamos con este tipo de ingeniería tisular para restablecer la conducción eléctrica auriculoventricular en los niños con bloqueo cardíaco completo. En vista de ello, aislamos los mioblastos de músculo esquelético de ratas Lewis neonatal y la placa que en laminina recubierto platos de cultivo de tejidos utilizando una versión modificada de los protocolos establecidos
Protocol
Parte 1: Montar la construcción de moldes de fundición
- Use una hoja de afeitar para reducir a la mitad el tubo de silicona (VWR) y cortarlo en tres pedazos cm de largo.
- Coloque una gota de RTV adhesivo implantes de silicona de calidad (Rhodia) en el interior de cada extremo de la tubería.
- Rápidamente coloque un pedazo pequeño (1 cm x 1 cm) de malla de poliéster (McMaster-Carr) sobre la caída de adhesivo de silicona y alinearla con el extremo de la tubería. Esto proporcionará una superficie ligeramente elevada y plana para la conexión construir. Repita para el otro extremo.
- Deje que el molde para secar a temperatura ambiente durante 3 días. Es útil para hacer moldes de 20 a 30 a la vez, ya que son esencialmente desechables.
- Una vez que el adhesivo esté completamente seco, almacenar estos moldes en un vaso lleno de etanol al 70% hasta que se necesiten. Este paso ayudará a esterilizar los moldes y el producto terminado se muestra en la Figura 1.
Parte 2: Preparación para el aislamiento de células con mioblastos
- Diluir 1 mg laminina (Sigma) en 250 ml de 0,22 micras, esterilizada por filtración de buffer fosfato salino (PBS) que contiene 1% de penicilina / estreptomicina (Invitrogen) y el 1% Fungizone (Invitrogen).
- Escudo 150 mm placas de cultivo tisular (BD Falcon) con 4 ml de la solución diluida de laminina paso 1.1 e incubar a 37 º C durante al menos 4 horas antes de la galjanoplastia mioblastos esqueléticos primaria.
- Hacer que el medio de mioblastos mediante la mezcla de F-10 de Ham mezcla de nutrientes (Sigma) con 20% de SFB (Atlanta Biologicals), 5 ng / L Factor de crecimiento de fibroblastos (Promega), 1% penicilina / estreptomicina (Invitrogen), y el 1% Fungizone ( Invitrogen).
- Prepare la solución de los músculos esqueléticos digestión mediante la disolución de 1 g de ~ 295 U / mg de colagenasa 2 (Worthington) en 100 ml de 2,4 U / mL Dispasa-2 (Roche). Añadir 0,037 g de CaCl 2 y mezclar bien. Filtro de esterilizar el tampón de digestión con un disco de 0.2 micras de filtro instalado en una jeringa de 10 ml y almacenar alícuotas a -20 ° C. Coloque la cantidad necesaria para la digestión de los tejidos a 37 ° C, junto con los medios de comunicación de mioblastos.
Parte 3: Aislamiento de mioblastos de músculo esquelético
- El uso de pinzas y tijeras pequeñas, eliminar músculos paravertebrales de la muerte neonatal ratas Lewis por corte en la parte posterior de la médula espinal, quitando la piel y las capas de la fascia y los músculos de la escisión.
- En una campana de cultivo de tejidos, el lugar de los músculos extirpado en un tubo cónico de 50 ml (BD Falcon) llena con 40 ml de solución salina Hanks 1X (Balanced HBSS) (Invitrogen) en el hielo. Dejar que las tiras musculares que se depositan en el fondo del tubo y retire con cuidado la mayor parte de los restos de líquido y sangre por succión al vacío con una pipeta Pasteur estéril en una campana de la cultura (Baker).
- Vierta las piezas del músculo recogieron sobre una placa de cultivo de 150 mm y eliminar la mayor cantidad de líquido que queda como sea posible con la succión. Usando dos de un solo filo hojas de afeitar pelos en el tejido hasta formar una pasta espesa. Vierta precalentado solución de digestión de la pasta y la transferencia de la mezcla a un tubo de 50 ml fresca con una pipeta de 10 ml. Durante la digestión enzimática, el tejido es de vez en cuando triturado (sin burbujas) con una pipeta de 10 mL equipado en un teléfono inalámbrico con una pipeta-Aid (Drummond). Una vez más, permitir que el tejido para resolver y eliminar el exceso de líquido.
- Coloque el tubo en una plataforma oscilante y digerir a 37 º C durante unos 30 minutos.
- Una vez que el músculo está licuado, pasar a través de un colador celular 70 micras (BD Falcon) y se centrifuga a temperatura ambiente durante 10 minutos a 600 xg (Beckman GP). Con una pipeta de Pasteur y de succión, retire la mayor cantidad de líquido posible y resuspender el precipitado con 10 ml de medio de mioblastos caliente.
- Pre-placa de las células en una placa de 150 mm sin recubrimiento de cultivo de tejidos durante 15 minutos para ayudar a eliminar los fibroblastos.
- Transferencia de las células que aún no han conectado a la cultureware laminina recubierto y se diluye de modo que no es un plato para cada 1 a 2 crías de rata. Colocar la placa en una incubadora humidificada conjunto a 37 º C con CO2 al 5%.
Parte 4: Usar las construcciones de ingeniería tisular (5 ml)
- Después de 1 a 2 días, retire 10 de los 150 mm placas de cultivo de tejidos de mioblastos de la incubadora, lavar dos veces con 37 ° C PBS 1X, y añadir 4 ml de agua tibia 0,05% de tripsina-EDTA a cada plato. Retorno de las placas a la incubadora durante 5 min.
- Cosecha de los mioblastos separado de las placas en la cubierta la cultura y recoger el líquido en un tubo de 50 ml (BD Falcon). Utilizar 10 ml de medio de mioblastos para lavar todos los platos y combinar esto con las células en el tubo de centrífuga. Que sedimenten las células a temperatura ambiente durante 10 minutos a 600 xg (Beckman GP) y eliminar el exceso de líquido como se describe en el paso 3.5.
- Resuspender las células con mioblastos en 1,6 ml de medio de mioblastos y el lugar en el hielo.
- Con unas pinzas, retire con cuidado la construcción de 4 moldes de paso 1,5 y enjuague dos veces con PBS 1X. Vacío de aspiración de todos los rastros de PBS con una pipeta Pasteur antes de colocar cada molde en un cu tejidos de 6 pocilloslture placa (BD Falcon).
- Reúna a los otros reactivos necesarios para la preparación de la construcción (F10 Jamón de 10X, los antibióticos, el colágeno tipo 1 [3,9 mg / ml] [6] y Matrigel ™) en el hielo y mantener los medios de comunicación de mioblastos a 37 º C. Combine 500 l 10 veces más de Ham F10, 100 l de penicilina / estreptomicina, 100 Fungizone l, 1,6 mL de colágeno, y 750 ™ l Matrigel en un tubo cónico de 15 ml. Mezclar la solución durante 10 segundos utilizando una Mini-vórtice (VWR) establece en 10 y el lugar en el hielo.
- A continuación, añadir 80 l de NaHCO3 y la suspensión de mioblastos a partir del paso de 3,3 a la mezcla del paso 3.5. Vortex toda la mezcla durante 10 segundos y volver el tubo al cubo de hielo durante unos minutos para limpiar la solución de burbujas.
- Con cuidado, tire la mezcla en los moldes antes de que comience a solidificarse con una pipeta de 10 ml. Cada molde tiene capacidad para aproximadamente 1 ml de líquido viscoso. Trate de evitar la introducción de burbujas de aire durante este procedimiento.
- Transferir cuidadosamente la placa que contiene las construcciones de fundición a la incubadora. Después de aproximadamente 30 minutos, retire las construcciones solidificado de la incubadora y añadir con cuidado a cada medio de mioblastos y para cubrir el tejido construir. Devolver la placa a la incubadora (Figura 2).
Parte 5: Los resultados representativos
Cuando este protocolo se ejecuta correctamente, la construcción del tejido de mioblastos que contienen está listo para la implantación in vivo (es decir, cuando se saca del molde) o más en los análisis in vitro después de 2 días.
Figura 1. Ejemplos de completar la construcción de moldes (ver Paso 1.5).
Figura 2. A solidificado mioblastos tejido que contiene la construcción [1].
Figura 3. Perfiles en H & E manchadas de un tejido que contiene la construcción de mioblastos. "A" representa un corte longitudinal y "B" muestra una sección transversal.
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Discussion
Los moldes en los que será la construcción de tejido reparto se puede hacer en cualquier forma y tamaño, sin embargo, es necesario que haya al menos dos puntos de fijación. De lo contrario, la matriz y las células forman una estructura esférica y las células mueren. En el presente Protocolo, se describe el uso de una malla de poliéster para este propósito, sin embargo, también hemos utilizado con éxito una malla de acero inoxidable. Obviamente, los moldes más grandes requieren más células, y un mayor volumen de los demás componentes. Al hacer los moldes, es importante reducir al mínimo la cantidad de silicona adhesivo utilizado y para asegurarse de que se encuentra en los extremos de la tubería. Esto se debe a mioblastos cerca de la cola tienden a no ser viable, incluso después de varios días de curado. Además, es prudente a la placa de los mioblastos sólo por un día o dos antes de preparar las construcciones de tejidos como fibroblastos contaminantes se multiplican rápidamente y eventualmente desbordar los componentes miogénica de la cultura. Del mismo modo, los mioblastos no debe ser plateado densamente porque las células en contacto unos con otros se comienzan a fusionarse y diferenciarse en miotubos. En lo que respecta a la fabricación de las construcciones de tejido, hay un número de fuentes disponibles en el mercado del colágeno tipo 1, sin embargo, cada uno de demostrar las diferencias en la tasa de solidificación y la consistencia del producto final. Además, es esencial que la preparación de colágeno no se irradia con luz UV ya que este proceso inhibe el proceso de gelificación. En nuestras manos, las construcciones de cambio de color de un color rosa oscuro a un color rosa pálido durante la solidificación. Finalmente, nuestra preparación de colágeno es el ácido-solubilizados (no pepsina digerida), por lo que el pH de la mezcla en el paso 3.5 es necesario aumentar mediante la adición de NaHCO3 antes de la incorporación de las células.
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Disclosures
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en el Hospital de Niños de Boston.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (HL068915; HL088206), un Premio al Investigador Nuevo en el Fondo de Investigación Thrasher, y las contribuciones al Fondo de conducción cardiaca en el Hospital de Niños de Boston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone tubing | VWR international | 60985-724 | |
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | |
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma-Aldrich | N6908 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Dispase-2 | Roche Group | 10295825001 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | 46H8863 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega Corp. | G5071 | |
| 150 mm tissue culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| 7.5% NaHCO3 | GIBCO, by Life Technologies | 25080-094 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 6-well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| 50 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352098 | |
| 15 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352099 | |
| 0.2 μm filter | Nalge Nunc international | 194-2520 |
References
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
