Summary
في هذه المقالة سوف نقوم وصف الإجراء لقياس معامل الانتشار باستخدام متعدد الفوتون مضان الانتعاش بعد photobleaching. سنبدأ من خلال تنظيم ليزر على طول المسار الضوئي للعينة ، وتحديد المعايير المناسبة التجريبية ، ثم يستمر توليد وتركيب أخيرا منحنيات الانتعاش مضان.
Abstract
متعددة مضان الانتعاش بعد photobleaching هو أسلوب المجهري تستخدم لقياس معامل نشر (أو المعلمات النقل مماثلة) من الجزيئات ، ويمكن تطبيقها على حد سواء
Protocol
1. محاذاة البصريات.
المعدات الرئيسية لتجربة MP - FRAP ما يلي : وضع غير الساحلية مصدر الليزر Pockels الخلية ، (على تعديل شعاع) ، ومولد النبض ، مزدوج اللون ، عدسة موضوعية ومضان تصفية الانبعاثات ، وبوابات أنبوب مضخم للضوء ، ونظام تسجيل البيانات (الفوتون العداد والأقنية مقلحة).
2. تحديد صلاحيات مراقبة آمنة.
- الليزر لتخفيف من قوة ، وانخفاض ، ولكن معقولة لتوليد مضان داخل العينة.
- التركيز داخل العينة.
- تعيين عداد الفوتون لدمج أكثر من فترة زمنية أطول بكثير من المتوقع انتعاش مضان. التنسيق مع وحدة التخزين الثابتة التي عقدت ضمن العينة (على البرمجيات المجهر لدينا ويتحقق ذلك عن طريق فحص نقطة) وسجل عدد معقول من بيانات تعداد الفوتون.
- زيادة القوة واتخاذ سلسلة أخرى من البيانات العد فوتون. كرر حتى الزيادة في تعداد الفوتون يبدو أن يقلل بشكل ملحوظ فيما يتعلق بزيادة الطاقة.
- سجل مؤامرة (بحساب الفوتون) بوصفها وظيفة من السجل (السلطة). والانحراف عن منحدر اثنين يشير تبيض خلال العرض. اختيار كقوة الشاشة السلطة التي هي دون هذا قطع ، ولكن الذي يسمح للإشارة إلى نسبة الضوضاء معقولة.
3. تحديد معلمات الإدخال إلى مولد النبض ومقلحة الأقنية.
- تحديد الخلفية للالمغلف في تقدير معامل الانتشار والانتعاش مرة على أساس و / أو الأدب المعادلة ستوكس آينشتاين والمعادلة نشرها.
- تعيين قيم المعلمة الضرورية على مولد النبض وقشارة و.
- على مولد النبض ، وتعيين عصور ما قبل التبييض والتبييض. وهناك مجموعة جيدة من قواعد التجربة هو أن ما قبل التبييض وينبغي 1-2 مرات أكبر من الشوط الانتعاش المتوقع ، والوقت الذي ينبغي أن يكون واحدا التبييض عشر الانتعاش المتوقع half الوقت.
- على قشارة ، مجموعة بن لعرض ما يقرب من نصف مدة التبييض ، وتعيين عدد من صناديق لكل سجل مثل هذا المنتج من العرض الخاص بن مختارة وصناديق لكل سجل أكبر من أو يساوي تقريبا إلى الشفاء التام من المتوقع بالاضافة الى ما قبل التبييض ، وأوقات التبييض.
- عودة الى مولد النبض وضبط تردد من تسلسل pre-bleach/bleach/monitor يساوي قيمة أصغر من مجرد معكوس للمنتج من المرات عرض بن لعدد من صناديق في السجل. *
- أخيرا ، تعيين عدد السجلات / المسح على مقلحة على أساس كثافة إشارة في وسعكم رصد المختار.
* من المهم جدا أن الوقت لإكمال سلسلة pre-bleach/bleach/monitor (1/frequency) تعيين على مولد النبض أكبر من الوقت لجمع البيانات (عرض × بن صناديق / رقم قياسي) تعيين على قشارة. اذا لم يتم تلبية هذه المعايير ، قد يؤدي التبييض متعددة تظهر ضمن سجل واحد على قشارة.
- تعيين مراقبة السلطة إلى مستوى مقبول ، التي سبق تحديدها. تعيين قوة التبييض إلى 200 ميغاواط أو حتى أعلى من القطع تبيض تحدد خلال الاختبار رصد التبييض. هذه القوى على حد سواء كما الفولتية مختلف أنحاء الكريستال PC.
- ختم المجهر ، اغلاق الاضواء ، بدوره على PMT ، تبدأ تفحص نقطة على البرامج المجهر ، ثم بدء تشغيل مولد النبض وقشارة.
- تحليل منحنى الانتعاش الناجم عن رسم المنحنى ، ووضع علامات على ثلاث نقاط مهمة : 1) مضان قبل التبييض ، 2) ومضان مباشرة بعد التبييض ، و 3) ومضان في نهاية مجموعة البيانات. استخدام القيم مضان على الفور قبل وبعد التبييض لتقدير أفضل في المرة نصف الانتعاش.
- مع هذا التقدير في ذلك الوقت نصف الانتعاش ، واستخدام قواعد الإبهام التي حددت من قبل لتحديد قيم جديدة للالتبييض ، وقبل التبييض ، وعرض بن لفترات. أيضا ، استخدم مضان قبل التبييض ومضان في نهاية مجموعة البيانات لتحسين تقدير الوقت اللازم لتحقيق الانتعاش الكامل. وكقاعدة عامة ، ينبغي جمع البيانات عن الفترة الزمنية التي يسمح للانتعاش الكامل ليكون أبلغ في النصف الأخير من البيانات.
- ضبط المعلمات على مولد النبض وقشارة ، تأخذ منحنى جديدا ، وتستمر حتى التغيير والتبديل المعلمات المنحنى الخاص يسلك التبييض قوية والانتعاش على نحو سلس. نضع في اعتبارنا أن مدة التبييض يمكن ، ويجب خفضها الى ما دون سيادة الإبهام ، إذا أمكن ذلك. ويمكن أيضا أن تكون قوة التبييض تعديلها إذا ضحلة جدا ، أو عميقة جدا ، ويتم التوصل إلى التبييض.
4. اختبار لتشبع الإثارة.
- رصد استخدام الصلاحيات المناسبة والتبييض ، والتي سبق تحديدها ، واتخاذ سلسلة من MP - FRAP المنحنيات. تحليل كل الانتعاش ، إلى تطبيع مضان قبل التبييض ، وذلك باستخدام الشكل المناسب الرياضية والساحات الأقل غير الخطية الخوارزمية المناسب (راجع "تحليل البيانات" أدناه). سجل قيمة المجهزة للمعلمة عمق التبييض.
- مواصلة اتخاذ وتحليل سلسلة متعاقبة من MP - FRAP منحنيات الى زيادة قيم قوة التبييض.
- سجل مؤامرة (التبييض المعلمة العمق) كدالة للتسجيل (السلطة). أي انحراف عن منحدر اثنين يشير التشبع الإثارة. اختيار السلطة التي تعطي التبييض التبييض قوية ، ولكن لا يسبب التشبع.
5. مواصلة اتخاذ MP - FRAP المنحنيات.
- مواصلة اتخاذ المنحنيات ، كما ذكر أعلاه ، فإن جميع المعايير المحددة بشكل صحيح.
6. تحليل البيانات.
- إزالة البيانات قبل التبييض والتبييض من البيانات مضان تعيين وضبط مثل هذه البيانات في الوقت الذي ر = 0 يناظر قيمة مضان مباشرة بعد التبييض.
- تطبيع الانتعاش مضان الناتجة فيما يتعلق مضان قبل التبييض المتوسط.
- تناسب منحنى تطبيع باستخدام النموذج المناسب وخوارزمية رياضية غير خطية ، المربعات المناسب ، مثل وظيفة في lsqcurvefit MATLAB. النموذج المعروض هنا لحسابات المبالغ المستردة مضان يتأثر كلا نشرها وتدفق الحمل الحراري :
حيث F o هي مضان قبل التبييض المتوسط ، β هو المعلمة عمق التبييض ، τ D هو السمة وقت الانتعاش ناشر ، R هي نسبة مربع من المحوري (ث ض) بعرض ل(ث ص) شعاعي لل حجم تنسيق ثنائي الفوتون ، τ VX ث = ص / ت س ، τ VY = ث ص / ت ذ ، ث = τ VZ ض / ي ت ، و ت 2 = ت × 2 + 2 + ص ت ت ض 2 هو سرعة تدفق الحمل الحراري. لتدفق يقتصر على الطائرة والتصوير ، وτ VZ → ∞ و 1 / τ اكس + 1 / τ يمكن استبدال VY مع 1 VR τ /. في غياب تدفق الحمل الحراري ، سواء في البسط exponentials انتقل إلى (1) وتقلص إلى حد كبير في التعبير ، وإلا لاثنين من المعلمات المناسب ، ودال β τ. ويتم احتساب معامل الانتشار بسهولة كما = D D ث 2 / 8τ ص.
7. ممثل النتائج.
الشكل 1. التبييض الممثل ومنحنى الانتعاش للFITC - BSA. يسلك منحنى الانتعاش القوي جيدة التبييض والانتعاش على نحو سلس ، مع مضان في استرداد كامل المبلغ عنها في النصف الأخير من البيانات.
الشكل 2. تطبيع منحنى الانتعاش للFITC - BSA (الحمراء) وما يرتبط بها من المربعات الصغرى تناسب (أسود). هذا يصلح تعطي معامل انتشار 52.9 ق / um2 ، بما يتفق مع الأدب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قوة متعددة الفوتون مضان الانتعاش بعد photobleaching تكمن في قدرته على تحقيق عينات سميكة مع القرار 3D. منذ تطوره في عام 1990 ، وقد استخدمت MP - FRAP لتحديد معامل نشر (أو المعلمات النقل المماثلة) في أجسام الخلايا ، بحكم فيفو شرائح الأنسجة سميكة ، والأنسجة في الجسم الحي والخلالي. في هذه المقالة ، قدمنا المعدات اللازمة لتشغيل تجربة MP - FRAP ، فضلا عن الإجراء المناسب لمواءمة مسار شعاع ، إعداد المعلمات التجريبية ، مع البيانات ، وتحليل المنحنيات الانتعاش.
وينبغي أن يسترشد الخيارات لطول موجة الإثارة المناسبة وتصفية الانبعاثات من قبل الفروع ، عبر ثنائية الفوتون والأطياف الانبعاثات. في كثير من الأحيان يتم تضمين هذه المعلومات مع البيانات الفنية للالأصباغ المختلفة. أيضا ، في محاذاة شعاع الليزر ، من المهم أن يتحقق الملئ السليم للعدسة الخلفي من الهدف. ويتم إنجاز هذا في كثير من الأحيان عن طريق إضافة المتوسع شعاع للنظام البصري. ويمكن التحقق منها عن طريق المسح الضوئي المناسب الملئ الفرعي القرار الخرز الفلورسنت ثابتة في كل الاتجاهات المحورية والشعاعية والتخطيط ومن ثم تركيب لمحات مضان Gaussians العثور على 1 / 2 ه بعرض للمقارنة مع قيم الأدب.
من المهم أيضا أن تختار مناسبة للرصد والقوى التبييض. الطاقة المستخدمة لرصد مضان قبل وبعد التبييض وينبغي أن تكون منخفضة بما يكفي كي لا يسبب ملموس التبييض ، ولكنها مرتفعة بما يكفي للسماح لنسبة الإشارة إلى الضجيج جيدة. يجب على السلطة تبيض تجنب التشبع الإثارة. في تجربة MP - FRAP هناك حدا أعلى لسعر الإثارة مضان ، والتي تتناسب مع مربع الحادث السلطة في العينة. هذا الحد علامات بداية الإثارة النظام التشبع. ومنحنيات الانتعاش مضان المنتجة باستخدام القوى العاملة في التبييض الإثارة نظام معاملات التشبع العائد المنخفض نشر خطأ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الدفاع عصر جائزة الباحث الأمل (رقم W81XWH - 05-0396) ، ثم باحثا في مركز بيو للجائزة العلوم الطبية الحيوية لبراون إدوارد الثالث باء.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:sapphire laser | Newport Corp. | Mai Tai | |
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | |
| Laser Scanning Microscope | Olympus Corporation | Fluoview | |
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | |
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | |
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | |
| FITC-BSA | Invitrogen | -- |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
