Summary
이 문서에서 우리는 photobleaching 후 다중 광자 형광 복구를 사용하여 확산 계수를 측정하기위한 절차를 설명합니다. 우리는 샘플에 대한 광학 경로를 따라 레이저를 정렬하고 적절한 실험 매개 변수를 결정함으로써 시작되며, 다음 발생을 계속하고 마지막으로 피팅 형광 복구 곡선.
Abstract
photobleaching 후 다중 형광 복구 macromolecules의 확산 계수 (또는 유사한 전송 매개 변수)을 측정하는 데 사용되는 현미경 기술이며, 모두에 적용할 수있는
Protocol
1. 광학을 맞춥니다.
MP - FRAP 실험을위한 주요 장비는 다음과 같습니다 모드 잠금 레이저 소스, Pockels 셀 (빔 변조에 대한), 펄스 발생기, 이색성, 객관적인 렌즈, 형광 방출 필터, 게이 티드 photomultiplier 튜브 및 데이터 기록 시스템 (광자 카운터 그리고 멀티채널 스케일러).
2. 안전 모니터 권한을 확인합니다.
- 샘플 내에서 형광 창출을위한 낮은지만, 합리적인, 전원에 레이저를 감쇠.
- 샘플 내에 중점을두고 있습니다.
- 더 이상 기대 형광 복구보다 시간 척도를 통해 통합하는 광자 카운터를 설정합니다. 초점 볼륨 (우리 현미경 소프트웨어이이 지점 검사에 의해 이루어집니다) 샘플 내에 정지 개최와 함께, 광자 개수 데이터의 합리적인 숫자를 기록합니다.
- 힘을 증가하고 광자 카운트 데이터의 또 다른 시리즈를 가져가라. 광자 카운트의 증가는 전력 증가와 관련하여 현저하게 감소로 나타날 때까지 반복합니다.
- 로그 (전원)의 함수로 플롯 로그 (광자 카운트). 두 아이의 기울기로부터 편차는 모니터 기간 동안 표백 나타냅니다. 모니터의 전원 아래에 상처를 해제하는 전원을 선택하지만, 노이즈 비율 합리적인 신호를 허용하는.
3. 펄스 발생기와 다중 스케일러의 입력 매개 변수를 확인합니다.
- 확인 다시 - 오브 - 더 - 봉투 문학 및 / 또는 스톡 - 아인슈타인 방정식과 확산 방정식에 따라 확산 계수 및 복구 시간을 추정하고 있습니다.
- 펄스 발생기 및 스케일러에 필요한 매개 변수 값을 설정합니다.
- 펄스 발생기에서 사전 표백제 및 표백 시간을 설정합니다. 엄지의 규칙의 좋은 세트는 미리 표백제는 기대 반 복구 시간보다 1-2 배 큰되어야하고, 표백제 시간은 예상 하프 복구 시간 한 열번째해야합니다.
- 스케일러에서 약 절반 표백제 기간에 빈의 너비를 설정하고 기록 당 방식의 숫자를 설정 선택한 빈 폭 및 레코드 당 방식의 제품보다 크거나 예상 완전히 회복 플러스 미리 약 같다 그러한 - 표백과 표백 시간.
- 펄스 발생기로 돌아가 빈 너비 시간 당 기록 방식의 수를 제품의 반전보다 단지 작은 값을 동일 pre-bleach/bleach/monitor 순서의 빈도를 설정합니다. *
- 마지막 레코드의 수를 설정 / 선택한 모니터의 전원에서 신호 강도에 따라 스케일러를 검사합니다.
* 그것은 펄스 발생기에 설정된 완벽한 pre-bleach/bleach/monitor 순서 (1/frequency)의 시간이 스케일러에 설정된 데이터 수집 시간 (빈 폭 X 방식 / 기록)보다 큰 것이 매우 중요합니다. 이 기준이 충족되지 않을 경우, 여러 표백제 트리거는 스케일러에서 단일 레코드 내에 나타날 수 있습니다.
- 이전에 결정 수용 수준으로 모니터의 전원을 설정합니다. 모니터 표백 테스트 중에 결정 표백 컷오프 위 200 MW 정도로 표백제 전원을 설정합니다. 이러한 파워는 PC의 결정에 걸쳐 서로 다른 전압으로 설정 둘 수 있습니다.
- , 불을 끄기 PMT 켜고, 현미경 소프트웨어에 지점 검사를 시작 현미경을 봉쇄, 다음 펄스 발생기 및 스케일러를 시작합니다.
- 1) 사전 표백제 형광, 2) 형광 즉시 포스트 표백제 및 데이터 세트의 끝에 3) 형광 : 곡선을 세우고있는 세 가지 중요한 사항을 표시하여 결과 복구 곡선 분석. 형광 값 사전 즉시 더 반 복구 시간을 추정 후 표백제.를 사용하여
- 하프 복구 시간이 예상과 함께, 사전 표백제, 표백에 대한 새로운 가치를 결정하기 이전에 설명한 엄지 손가락의 규칙, 그리고 빈 폭 기간이를 사용합니다. 또한,보다 완전한 회복을 달성하는 데 필요한 시간을 추정하기 위해 설정 데이터의 끝에 사전 표백제 형광 및 형광을 사용합니다. 엄지의 규칙으로, 데이터는 데이터의 후반에 대해보고해야하는 전체 복구를 위해 허용하는 기간 동안 수집해야합니다.
- 귀하의 곡선은 강력한 표백 및 원활한 복구를 전시 때까지 펄스 발생기 및 스케일러에 매개 변수를 조정 매개 변수를 새로운 곡선을 그리고 조정을 계속합니다. 가능하다면, 표백제 기간 수는 점을 명심하고, 엄지의 규칙 아래에 감소한다. 너무 약하거나 너무 깊이 표백제를 얻을 경우 표백 파워도 조정할 수 있습니다.
4. 여기 채도에 대한 테스트합니다.
- 이전에 결정 적절한 모니터 및 표백 능력을 사용하여 MP - FRAP 곡선 일련의 가져가라. 적절한 수학적 형식과 비선형 최소 제곱 피팅 알고리즘을 (아래의 "데이터 분석"참조)를 사용하여, 사전 표백제 형광으로 표준화된 각각의 복구를 분석할 수 있습니다. 표백제 깊이 매개 변수의 장착 가치를 기록합니다.
- 표백 파워의 가치를 증가에서 MP - FRAP 곡선의 연속 시리즈 복용 분석 진행합니다.
- 로그 (전원)의 함수로 플롯 로그 (표백 깊이 매개 변수). 두 아이의 기울기로부터 편차는 여기 채도를 나타냅니다. 강한 표백제를 산출 표백 전원을 선택하지만, 채도를 발생하지 않습니다.
5. MP - FRAP 곡선을 복용 계속합니다.
- 위와 같이 모든 매개 변수가 제대로 설정됩니다 곡선을 복용 계속합니다.
6. 데이터 분석.
- 형광 데이터에서 미리 표백제 및 표백 데이터를 같은 시간 데이터를 설정 및 조정을 제거하는 것이 바로 사후 표백제 형광 값 t = 0에 해당합니다.
- 평균 미리 표백제 형광와 관련하여 발생하는 형광 복구를 정상화.
- 적절한 수학적 모델과 같은 MATLAB에서 lsqcurvefit 함수로 비선형 최소 제곱 피팅 알고리즘을 사용하여 표준 곡선 맞추기. 여기에 제시 모델 확산 및 대류 흐름 모두에 의해 영향을 형광 recoveries 계정에 대한 :
F O가 미리 표백제 평균 형광 어디에, β는 표백 깊이 매개 변수이며, τ D의 특성 잘 퍼지는 복구 시간, R은의 요골 (W R) 넓이로 축의 제곱의 비율 (W Z)입니다 두 광자 초점 볼륨, τ VX가 = W R / V X, τ VY = W R / V Y는 τ VZ = w Z / V Z와 V 2 = V는 x 2 + V Y 2 + V Z 2입니다 대류 흐름의 속도. 이미징 비행기에 갇혀 흐름의 경우, τ VZ → ∞ 및 1 / τ VX + 1 / τ VY 1 / τ VR로 교체할 수 있습니다. 대류 흐름의 부재에서 분자 두 exponentials 1로 이동하여 표현은 크게 두 피팅 파라미터 β와 τ D로 줄어 듭니다. 확산 계수는 쉽게 D = W R 2 / 8τ D로 계산됩니다.
7. 대표 결과.
그림 1. 대표 표백제와 FITC - BSA에 대한 복구 곡선. 좋은 복구 곡선은 데이터의 후반에 대해보고하는 전체 복구에서 형광과 함께 강력한 표백 및 원활한 복구를 전시하고 있습니다.
그림 2. FITC - BSA를위한 표준화 복구 곡선 (적색)와 관련된 최소 제곱 적합 (블랙). 이 적합 문헌과 일치 52.9 um2 / s의 확산 계수를 산출.
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Discussion
photobleaching 후 다중 광자 형광 회복의 능력은 3D 해상도 두꺼운 샘플을 탐사하는 기능에있다. 1990 년대에 개발 이후, MP - FRAP은 세포 기관, 전직 생체내 두꺼운 조직 슬라이스하고, 생체내 조직과 interstitium에의 확산 계수 (또는 유사한 전송 매개 변수)를 결정하는 데 사용되었습니다. 이 문서에서는, 우리는 실험 매개 변수를 설정 데이터를 복용하고, 복구 곡선을 분석, MP - FRAP 실험뿐만 아니라 빔 경로를 정렬을위한 적절한 절차를 실행하는 데 필요한 장비를 제시했습니다.
적절한 여기 파장과 방출 필터의 선택은 두 광자 교차 섹션 및 방출 스펙트럼에 의해 유도해야합니다. 이 정보는 자주 각종 염료에 대한 기술 자료에 포함되어 있습니다. 또한, 레이저 빔을 정렬에, 그것은 목표의 뒤에 렌즈의 적절한 overfilling을 달성하는 것이 중요합니다. 이것은 종종 광학 시스템에 빔 확장기를 추가하여 수행됩니다. 적절한 overfilling는 축 방향과 요골 모두 하위 해상도 고정 형광 구슬을 스캔 후하려 문학 값과 비교에 대한 1 / E 2 폭을 찾을 수 Gaussians에 형광 프로필을 피팅하여 확인하실 수 있습니다.
적절한 모니터링 및 표백 권력을 선택하는 것도 중요합니다. 모니터에 사용되는 전원을 형광 사전 및 사후 표백제 좋은 신호 대 잡음 비율에 대한 충분한 높은 표백 감지할 수있을 정도의 원인이되지 낮아 있어야하지만. 표백 전원이 여기 채도를 방지해야합니다. MP - FRAP 실험에서 시료의 전원 사건의 제곱에 비례하는 형광 여기 속도에 상한이 있습니다. 이 제한은 여기 포화 정권의 시작을 표시합니다. 여기 채도 정권에서 작동 표백 파워를 사용하여 생산 형광 복구 곡선은 잘못 낮은 확산 계수를 얻을 것입니다.
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Acknowledgments
이 작품은 호프 학술 상 국방 시대의학과 (제 W81XWH - 05-0396)과 에드워드 B. 브라운 III에 의생명 과학 수상의 퓨 학술 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:sapphire laser | Newport Corp. | Mai Tai | |
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | |
| Laser Scanning Microscope | Olympus Corporation | Fluoview | |
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | |
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | |
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | |
| FITC-BSA | Invitrogen | -- |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
