Summary
在这篇文章中，我们将描述测量扩散系数，使用多光子荧光漂白后恢复的过程。我们将开始通过调整样品沿光路的激光，并确定适当的实验参数，然后继续产生，最后装修荧光恢复曲线。
Abstract
多荧光漂白后的恢复是一个显微技术用于测量大分子物质的扩散系数（或类似的交通参数），可同时适用于
Protocol
1。校正光学系统。
MP - FRAP实验的关键设备包括：一个锁模激光源，电光细胞（束调制），脉冲发生器，分色，物镜，荧光过滤器，门控光电倍增管，和数据记录系统（光子计数器和多通道定标器）。
2。确定安全监察权力。
- 激光衰减低，但合理的，样品中的荧光产生的力量。
- 聚焦在样品
- 设置一个光子计数器集成在一个时间尺度更长的时间比预期的荧光恢复。随着焦距的体积举行的样本内固定（这是由一个点扫描来实现我们的显微镜软件），记录一个光子计数数据的合理数量的。
- 增加动力，并采取一系列的另一个光子计数数据。重复，直到在光子计数的增加，这似乎与尊重的权力增加显着减少。
- 剧情日志（光子计数）作为日志（电源）的功能。从两个斜坡的偏差显示在监视器的漂白。选择低于此切断电源，显示器的电源，但它允许一个合理的信噪比。
3。确定输入参数的脉冲发生器和多通道定标器。
- 决定备份的信封根据文献和/或斯托克斯 - 爱因斯坦方程和扩散方程的扩散系数和恢复时间的估计。
- 设置必要的参数值上的脉冲发生器和倍线器。
- 脉冲发生器，设置预漂白和漂白剂次。一个拇指规则是，预漂白剂应比预期的一半恢复时间的1-2倍，漂白时间应十分之一的预期的一半恢复时间。
- 洁牙机，设置斌宽度约一个半漂白工期，并设置每个记录箱的数量，这样的产品是您选定的bin宽度和每个记录箱大于或约等于你的预期的全面复苏，加上前期漂白剂和漂白剂次。
- 返回的脉冲发生器，并设置pre-bleach/bleach/monitor序列的频率等于一个值仅比的bin宽度倍的每个记录箱产品的倒数较小。 *
- 最后，设置的记录数/扫描定标器，在您所选择的显示器的电源信号强度的基础上。
*（1/frequency）脉冲发生器上设置一个完整的pre-bleach/bleach/monitor序列的时间比数据采集时间的洁牙机（斌宽x箱/记录），这是非常重要的。如果不符合这个标准，可能会出现多个漂白触发内的洁牙机上的单个记录。
- 显示器的电源设置到可接受的水平，确定以前。将漂白功率200兆瓦或以上显示器漂白试验期间确定的漂白截止。这些权力都是不同的电压设置跨PC水晶。
- 密封显微镜，关掉灯，打开光电倍增管，开始点扫描显微镜软件，然后启动脉冲发生器和洁牙机。
- 恢复曲线绘制曲线和标记三个要点：1）预漂白荧光，2）荧光立即漂白后，和3）在数据集的结束荧光分析。使用荧光值前，立即后的漂白剂，以更好地估计半恢复时间。
- 有了这个半恢复时间的估计，使用的经验法则前面提到预漂白剂，漂白剂，以确定新的价值观，和bin宽度工期。此外，使用数据集结束前的漂白剂荧光和荧光，以更好地估计实现全面复苏所需的时间。作为一个经验法则，应收集数据为一个时间段，允许的全面复苏，下半年的数据报道。
- 调整的脉冲发生器和倍线器的参数，一个新的曲线，并继续调整参数，直到你的曲线呈现出强烈的漂白剂和顺利回收。漂白时间可以记住，并应减少，下面的经验法则，如果可能的话。漂白的权力也可能被调整，如果过浅，或过深，漂白剂，是实现。
4。测试励磁饱和。
- 使用适当的监测和漂白剂的权力，确定以前，采取了一系列MP - FRAP曲线。每个恢复，规范化的预漂白荧光分析，使用适当的数学形式和非线性最小二乘拟合算法（见“数据分析”一节）。记录的漂白剂的深度参数的拟合值。
- 继续采取和分析漂白电源增加值连续系列MP - FRAP曲线。
- 剧情日志（漂白深度参数）日志（电源）功能。从两个斜坡的任何偏差表示励磁饱和。选择漂白力量，产生了强烈的漂白剂，但不会导致饱和。
5。继续采取MP - FRAP曲线。
- 继续采取曲线，上面一样，将所有参数设置正确。
6。数据分析。
- 从荧光数据删除的预漂白和漂白剂的数据，设置和调整的时间等数据，T = 0对应立即漂白后的荧光值。
- 规范化方面的平均预漂白荧光产生的荧光恢复。
- 使用适当的数学模型和一个非线性最小二乘拟合算法，如在MATLAB中的lsqcurvefit功能，适合标准化曲线。这里提出的模型帐户扩散和对流的影响荧光回收率：
F O漂白前的平均荧光，β是漂白剂的深度参数，τD为特征的扩散恢复时间，R为径向（W R）的宽度的轴向平方米的比例 （W Z）双光子焦距量，τVX = W R / V X，τVY = W ř / V Y，τVZ = W Z / V Z，V 2 = V + V Y 2 × 2 + V Z 2是对流的速度。对于密闭的成像平面的流量，τVZ→∞和1 /τVX + 1 /τVY可以换成1 /τVR 。在对流的情况下，分子中的两个指数函数为1，表达的是大大减少，只有两个拟合参数，β 和 τ剐。扩散系数D =瓦特R 2 /8τð很容易计算。
7。代表性的成果。
图1。代表性的漂白剂和恢复FITC - BSA的曲线。恢复良好的曲线呈现出较强的漂白剂和平稳回升，报告为下半年的数据完全恢复的荧光。
图2。FITC - BSA的规范化复苏曲线（红色）和相关的最小二乘（黑色）。这适合产量的52.9 UM2 / S的扩散系数，与文献报道一致。
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Discussion
多光子荧光漂白后恢复的力量在于，它能够探测与三维决议厚的样品。由于其在1990年的发展，MP - FRAP已被用来确定在细胞体， 体外厚的组织切片，并在体内组织和间质的扩散系数（或类似的交通参数） 。在这篇文章中，我们提出了必要的设备运行MP - FRAP实验，以及调整光路中的正当程序，设置实验参数，数据，以及恢复曲线分析。
适当的激发波长和发射滤光片的选择应遵循的双光子截面和发射光谱。这些信息通常包括各种染料的技术数据。此外，在调整激光束，它是重要的，达到回镜头的客观正确的溢出。这通常是通过添加扩束光学系统。扫描轴向和径向方向的分分辨率固定的荧光珠，然后策划和装修的荧光模式，以高斯找到的1 / e 2宽度与文献值比较，可以验证正确的溢出。
同样重要的是选择适当的监测和漂白权力。用于监控电源的荧光前和漂白后，应足够低，不会造成明显的漂白，但高到足以让一个良好的信号信噪比。漂白粉必须避免激发饱和。在MP - FRAP实验中，有一个上限，以激发率，这是对样本的权力事件的平方成正比。此限制的激励饱和制度，标志着开始。使用漂白的权力，在激励饱和制度产生的荧光恢复曲线将产生错误的扩散系数低。
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Acknowledgments
这项工作是由一个部国防时代的希望学者奖（W81XWH - 05 - 0396号）和皮尤学者在生物医学科学奖，以爱德华B.布朗第三。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:sapphire laser | Newport Corp. | Mai Tai | |
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | |
| Laser Scanning Microscope | Olympus Corporation | Fluoview | |
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | |
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | |
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | |
| FITC-BSA | Invitrogen | -- |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
