Summary
במאמר זה נתאר את הליך למדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות רב פוטון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching. נתחיל על ידי יישור לייזר לאורך השביל אופטי המדגם קביעת פרמטרים ניסיוניים נאותה, ולאחר מכן להמשיך לייצר והתאמת עקומות בסופו של דבר התאוששות פלואורסצנטי.
Abstract
Multi-הקרינה ההתאוששות לאחר photobleaching היא טכניקה מיקרוסקופיה למדידת מקדם דיפוזיה (או פרמטרים תחבורה מקביל) של מקרומולקולות, והוא יכול להיות מיושם גם
Protocol
1. יישר את אופטיקה.
הציוד מפתח עבור הניסוי MP-FRAP כוללים: מצב נעול מקור לייזר, Pockels Cell (עבור קרן אפנון), דופק גנרטור, dichroic, עדשה אובייקטיבי, מסנן הקרינה פליטה, צינור מכפיל סגורות, ומערכת נתונים הקלטה (פוטון לדלפק ואת רב Scaler).
2. קביעת סמכויות לפקח על בטוח.
- להחליש את הלייזר לשלטון, נמוך, אבל סביר להפקת הקרינה בתוך המדגם.
- פוקוס בתוך המדגם.
- הגדרת מונה פוטון לשלב מעל ציר הזמן הרבה יותר מאשר ההתאוששות הקרינה הצפויה. עם נפח מוקד שנערך נייח בתוך המדגם (על תוכנת מיקרוסקופ שלנו זו מושגת על ידי סריקה נקודה), שיא מספר סביר של נתונים לספור פוטון.
- להגדיל את הכוח לקחת סדרה נוספת של נתונים פוטון לספור. חזור על הפעולה עד העלייה ספירת פוטון נראה להפחית באופן משמעותי ביחס להגדיל את כוחה.
- מגרש יומן (ספירת פוטון) כפונקציה של log (כוח). סטייה מדרון של שני מצביע על הלבנת במהלך לצג. בחר ככוח לצג עוצמה נמוכה זה לחתוך, אבל המאפשרת אות סביר יחס רעש.
3. קביעת פרמטרים של קלט כדי הגנרטור הדופק רב Scaler.
- קבע בחזרה-of-the-המעטפה הערכות של מקדם הדיפוזיה וזמן ההתאוששות מבוסס על ספרות / או את משוואת סטוקס-איינשטיין את המשוואה דיפוזיה.
- הגדר את ערכי הפרמטרים הדרושים על מחולל את הדופק ואת Scaler.
- על מחולל את הדופק, לקבוע את הזמנים מראש אקונומיקה אקונומיקה. קבוצה טובה של כללי אצבע הוא כי אקונומיקה מראש צריך להיות 1-2 פעמים גדול יותר הפעם צפויה התאוששות וחצי, הזמן אקונומיקה צריך להיות עשירית הזמן הצפוי להתאוששות וחצי.
- על Scaler, להגדיר את רוחב בן כ משך one חצי אקונומיקה, ולהגדיר את מספר פחי לכל רשומה כזו, כי המוצר של רוחב בן שבחרת פחי לכל רשומה הוא גדול או שווה בקירוב התאוששות מלאה צפויה שלך פלוס מראש -אקונומיקה אקונומיקה פעמים.
- חזור אל הגנרטור דופק ולקבוע את תדירות רצף pre-bleach/bleach/monitor שווה ערך רק קטן יותר מאשר הפוך המוצר של רוחב פעמים בן מספר פחי לכל רשומה. *
- לבסוף, להגדיר את מספר הרשומות / סריקה על Scaler המבוסס על עוצמת האות בכל הכוח שבחרת לפקח.
* חשוב מאוד כי זמן ברצף pre-bleach/bleach/monitor מלאה (1/frequency) מוגדר על הגנרטור הדופק עולה בזמן איסוף הנתונים (רוחב x פחי bin / שיא) מוגדר על Scaler. אם זה הקריטריונים לא מתקיים, מעורר אקונומיקה מרובים עשוי להופיע בתוך הרשומה יחיד על Scaler.
- הגדר את הכוח לפקח לרמה מקובלת, נקבע קודם לכן. הגדר את כוח אקונומיקה כדי mW 200 או כך מעל הפסקת הלבנה נקבע במהלך הבדיקה לנטר הלבנה. סמכויות אלה הן כמפורט במתחים שונים ברחבי גביש ה-PC.
- חותם את המיקרוסקופ, לכבות את האורות, להדליק PMT, להתחיל לסרוק נקודה על תוכנת מיקרוסקופ, ולאחר מכן להפעיל את גנרטור הדופק Scaler.
- ניתוח עקומת התאוששות וכתוצאה מכך על ידי התוויית עקומת וסימון שלוש נקודות חשובות: 1) את הקרינה מראש אקונומיקה, 2) את הקרינה מיד לאחר אקונומיקה, ו 3) את הקרינה בסוף ערכת הנתונים. השתמש ערכי הקרינה מראש ומיד לאחר אקונומיקה כדי להעריך טוב יותר את זמן מחצית התאוששות.
- עם הערכה זו של זמן מחצית ההתאוששות, השתמש כללי אצבע שתוארו קודם לכן כדי לקבוע ערכים חדשים עבור אקונומיקה, טרום אקונומיקה, ורוחב המשכים סל. כמו כן, השימוש הקרינה מראש אקונומיקה הקרינה בסוף הנתונים מוגדר טוב יותר להעריך את הזמן הנדרש כדי להשיג החלמה מלאה. ככלל אצבע, יש לאסוף נתונים עבור פרק זמן המאפשר התאוששות מלאה ידווחו על המחצית השנייה של הנתונים.
- כוונו את הפרמטרים על גנרטור הדופק Scaler, לקחת עקומת חדש, ולהמשיך tweaking את הפרמטרים עד עקומת שלך תערוכות אקונומיקה חזקה והתאוששות חלקה. זכור כי משך אקונומיקה יכול, וצריך, להיות מופחת מתחת שלטונו של האגודל, אם אפשר. הכוח אקונומיקה עשוי גם להיות מותאם אם רדוד מדי או עמוק מדי, אקונומיקה מושגת.
4. מבחן הרוויה עירור.
- באמצעות צג המתאים סמכויות אקונומיקה, נקבע בעבר, לנקוט שורה של MP-FRAP עקומות. ניתוח כל התאוששות, מנורמל ל פלואורסצנציה מראש אקונומיקה, באמצעות טופס מתמטיים מתאימים שאינו ליניארי הריבועים הפחותים אלגוריתם מתאים (ראה "ניתוח נתונים" להלן). הקלט את הערך של הפרמטר מצויד עומק אקונומיקה.
- המשך נטילת וניתוח סדרת רצופים של MP-FRAP עקומות להגדיל את הערכים של כוח אקונומיקה.
- מגרש יומן (עומק פרמטר אקונומיקה) כפונקציה של log (כוח). כל סטייה מן המדרון של שני מציין הרוויה עירור. בחר כוח אקונומיקה כי התשואות אקונומיקה חזקה, אבל אינו גורם הרוויה.
5. המשך נטילת MP-FRAP עקומות.
- להמשיך לקחת את הקימורים, כאמור לעיל, כל הפרמטרים יהיה להגדיר כראוי.
6. ניתוח נתונים.
- הסר את הנתונים מראש אקונומיקה אקונומיקה מהנתונים הקרינה להגדיר ולהתאים את הנתונים בזמן כזה t = 0 המתאים לערך הקרינה מיד לאחר אקונומיקה.
- נרמל את ההתאוששות הקרינה וכתוצאה מכך לגבי הקרינה מראש אקונומיקה הממוצע.
- התאימו את עקומת מנורמל באמצעות מודל מתמטי מתאים אלגוריתם שאינו ליניארי, הריבועים הולם, כגון תפקוד lsqcurvefit ב MATLAB. המודל המוצג כאן מהווה החלמה הקרינה מושפעת דיפוזיה וגם זרם הסעה:
היכן F o היא הקרינה מראש אקונומיקה הממוצע, β הוא פרמטר עומק אקונומיקה, τ D הוא הזמן האופייני התאוששות diffusive, R הוא היחס בין הכיכר של צירית (w z) כדי רדיאלי (w r) רוחבי של נפח מוקד שני הפוטונים, τ VX r = w / v x, τ VY = w r / v y, τ VZ = w z / v z, ו v 2 v = x 2 + v y 2 + z v 2 הוא מהירות הזרימה הסעה. עבור זרימה מוגבלת המטוס הדמיה, τ VZ → ∞ ו 1 / τ VX + 1 / τ VY ניתן להחליף 1 / τ VR. בהעדר זרימת הסעה, הן exponentials במונה ללכת 1 והביטוי מצטמצם מאוד, רק שני פרמטרים מתאימים, β ו - τ ד. מקדם דיפוזיה מחושב בקלות D = w r 2 / 8τ ד.
7. נציג תוצאות.
באיור 1. אקונומיקה ייצוגית עקומת התאוששות עבור FITC-BSA. עקומת התאוששות טובה תערוכות אקונומיקה חזקה והתאוששות חלקה, עם הקרינה בבית החלמה מלאה שדווח עבור המחצית השנייה של הנתונים.
איור 2. עקומת התאוששות מנורמל עבור FITC-BSA (אדום) ואת בכושר הקשורים הפחות ריבועים (שחור). התאמה זו התשואות מקדם דיפוזיה של 52.9 um2 / s, עולה בקנה אחד עם הספרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כוחה של התאוששות רב פוטון הקרינה לאחר photobleaching טמון ביכולתה לחקור דגימות עבה עם רזולוציה 3D. מאז הפיתוח שלה של 1990, MP-FRAP נעשה שימוש כדי לקבוע את מקדם דיפוזיה (או פרמטרים תחבורה מקביל) בגוף התא, לשעבר פרוסות vivo רקמה עבה, ברקמות interstitium vivo ו. במאמר זה, הצגנו את הציוד הדרוש להפעלת ניסוי MP-FRAP, כמו גם את ההליך המתאים יישור נתיב קרן, קביעת פרמטרים ניסיוניים, לקיחת נתונים, שחזור וניתוח עקומות.
האפשרויות של גל עירור מתאים מסנן פליטה צריך להיות מונחה על ידי שני הפוטונים חתכים ואת ספקטרום הפליטה. מידע זה נכלל לעתים קרובות עם הנתונים הטכניים צבעים שונים. בנוסף, יישור קרן הלייזר, חשוב שגדשו תקין של העדשה האחורית של המטרה להיות מושגת. מטרה זו מושגת בדרך כלל על ידי הוספת expander קרן במערכת אופטית. שגדשו פרופר ניתן לאמת על ידי רזולוציית סריקה תת חרוזי ניאון קבוע בשני הכיוונים צירית לבין רדיאלי ואז בקשירת קשר והתאמת פרופילי פלואורסצנטי Gaussians כדי למצוא את 1 / e 2 רוחבי להשוואה עם ערכי הספרות.
חשוב גם לבחור ניטור הולם סמכויות הלבנה. הכוח להשתמש כדי לפקח על הקרינה טרום ופוסט אקונומיקה צריכה להיות נמוכה מספיק כדי לא לגרום ניכר הלבנה, אבל גבוהה מספיק כדי לאפשר יחס אות לרעש טוב. הכוח הלבנת להימנע הרוויה עירור. בניסוי MP-FRAP יש גבול עליון לשיעור עירור הקרינה, אשר עומד ביחס לכיכר האירוע כוח על המדגם. גבול זה מסמן את תחילתה של המשטר הרוויה עירור. עקומות התאוששות Fluorescence הופק באמצעות כוחות אקונומיקה ההפעלה במשטר הרוויה עירור תניב מקדמי דיפוזיה נמוכה בטעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מחלקת הביטחון של עידן פרס המלומד התקווה (מס 'W81XWH-05-0396) וכן חוקר Pew פרס למדעי ביו אדוארד בראון ב III.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:sapphire laser | Newport Corp. | Mai Tai | |
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | |
| Laser Scanning Microscope | Olympus Corporation | Fluoview | |
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | |
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | |
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | |
| FITC-BSA | Invitrogen | -- |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
