Summary
Этот протокол описывает производство KLRG1 тетрамер, который является мощным инструментом для анализа KLRG1 лигандами.
Abstract
Убийца ячейки лектин-подобный рецептор G1 (KLRG1) является трансмембранный гликопротеин II типа тормозных рецепторов принадлежащих тип С лектин-подобный надсемейства. KLRG1 существует как мономер и как дисульфид-связанных гомодимера. Это хорошо сохраняется рецептор находится на самых зрелых и недавно активированных NK клеток, а также на подмножестве эффектор / память Т-клеток.
Использование KLRG1 тетрамер, а также другие методы, E-, N-, и R-кадгерины были определены как KLRG1 лигандами. Эти Са 2 +-зависимые межклеточных молекул адгезии состоит из внеклеточного домена, содержащий пять кадгерина повторяет ответственность за межклеточных взаимодействий, трансмембранный домен и цитоплазматический домен, который связан с актином цитоскелета.
Генерация KLRG1 тетрамер имеет важное значение для идентификации KLRG1 лигандами. KLRG1 тетрамер также уникальный инструмент для выяснения роли кадгерина и KLRG1 играть в регуляции иммунного ответа и целостности тканей.
Protocol
Подготовка тел включения
- Привить 4 х 500 мл колб ТБ каждый из которых содержит 50 мкг / мл карбенициллин и хлорамфеникол с ночной культуры бактерий выражения KLRG1 плазмиды конструкции. Когда OD достигает 0,6 А при 600 нм, вызывают с добавлением 0,4 М IPTG и инкубировать культуру дополнительно 4 часа тряски при температуре 37 ° C.
- Ресуспендируют собранных клеток в ресуспендирования буфера рН = 8,0 (50 мМ Трис-HCl, 25% (W / V) сахарозы, 1 мМ EDTA, 10 мМ DTT). Примечание: гранулы могут быть заморожены на данном этапе.
- Бассейн не более 60 мл бактериальной resuspensions в полипропиленовых стакан. При необходимости отрегулируйте до 60 мл с TE буфера рН 8,0 и размешать смесь с половинной скоростью.
- Для перемешивания смеси добавить падение мудрых: лизоцима (окончательный = 1 мг / мл), MgCl2 (окончательный = 5 мм), 2 мг ДНКазы я в 50% глицерин, содержащийся 75 мМ NaCl, Triton-X100 (окончательный = 1%), DVB-T ( Окончательный = 10 мм).
- Разрушать ультразвуком решение на льду в течение 1,5 мин и центрифуги лизатов при 5000 оборотов в течение 10 мин при 4 ° C.
- Декантируйте супернатант.
- Добавьте 15 мл промывочного буфера рН = 8,0 (50 мМ Трис-HCl, 0,5% Тритон Х-100, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT).
- На льду, разрушать ультразвуком решение в течение 1,5 мин, пока осадок полностью ресуспендировали.
- Центрифуга образцов при 5000 оборотов в течение 10 мин при 4 ° C.
- Повторите 5 раз мыть.
- Повторите 5б промывочным буфером без Тритон Х-100, центрифуги и ресуспендируют в 4 мл буфера ТЕ.
- Возьмите сырой массы тел включения суспензии и хранить в ТЕ буфере при концентрации от 30 до 100 мг / мл.
Рефолдинг KLRG1
- Сделать 1 л рефолдинг буфер рН = 8,0 (0,4 М аргинин-HCl, 0,1 М Трис рН 8-8.3, 2 мМ ЭДТА, 0,2 мМ PMSF, 3 ЭДТА без ингибитора протеазы таблетки, 5 мМ GSH и 0,5 мМ GSSG) и холод до 4 ° С при перемешивании.
- Подготовка тел включения для закачки в складных смеси: Это идеальное место, чтобы сделать 5 10 инъекций каждый с 0,25 0,5 мкМ концентрации таким образом, чтобы конечная концентрация белка будет 2 3 мкМ.
- Растопить объемом 50 мг суспензии телец включения в 7 M GnHCl 10 мМ β-меркаптоэтанола.
- Держите телец включения / GnHCl смеси при температуре 37 ° С в течение 30 - 40 мин и вихревые каждые 5 мин для обеспечения полного плавления (суспензия станет ясно, когда полностью растаял).
- Центрифуга при максимальной скорости в течение 30 мин в микроцентрифужных при 4 ° С и передачи супернатант в 15 мл центрифужную пробирку. Не передать любую из небольших черновато гранул.
- Регулировка громкости с впрыском буфера (3 M GnHCl, 10 мМ NaAcetate, рН 4.2,10 мМ ЭДТА).
- Inject 1 мл разведенной телец включения каждый час. Когда инъекций, перемешать на высокой скорости, добавить 1 мл разведенного падение тел включения по капле с 2-х секунд между каждой капли. Когда инъекция делается, перемешать на низкой скорости.
- Продолжить ночь перемешивания при низкой скорости при 4 ° C.
Концентрация рефолдинг Реакции
- После протокол Millipore с, концентрат 1 л предварительно фильтруется (0,22 мкм фильтром) рефолдинг реакции с помощью Amicon мешалкой клеток и YM10 NMWL ультрафильтрации мембрана 10K (Millipore) до ~ 10 мл.
- Концентрат до ≤ 2 мл с использованием Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
Очистка KLRG1 тетрамер
- Установка AKTAFPLC при 4 ° С в зависимости от GE Healthcare пособий.
- Purify мономера форме KLRG1 по размеру хроматографии использованием Sephacryl С-200 16/60 с высоким разрешением колонки (GE Healthcare) в 20 HEPES мм и 150 мм NaCl. (См. рисунок 1).
- Концентрат до 1 мл использованием Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
- Используйте Бира фермента в соответствии с протоколом алчность с до biotinylate KLRG1 мономера.
- Свободный биотин устраняется по размеру хроматографии, как в 2.
- KLRG1 молекула tetramerized путем смешивания KLRG1 мономера с 4-кратным молярным избытком PE сопряженных стрептавидином (BD Biosciences).
Представитель Результаты
Рисунок 1. Представителю положительных результатов от размера Akta FPLC хроматографии из сложил KLRG1. График показывает разделение мономера (83,52 мл), димер (56,36 мл) и мультимера (36,26 мл) форма сложил KLRG1. Пик при 94,25 мл представляет буфер обмена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе, показано, как очистить, biotinylate и tetramerize KLRG1. KLRG1 тетрамер могут быть использованы для обозначения KLRG1 лигандов с помощью проточной цитометрии. Хотя рефолдинг условия должны быть проверены эмпирически для каждого белка, других C-типа лектинов может быть tetramerized использованием аналогичных протоколов. Использование tetramerized белков в качестве зондов, лиганды-сиротам C-типа рецепторов лектинов потенциально могут быть идентифицированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Найденко за помощь в оптимизации рефолдинг условиях. Эта работа была поддержана исследовательский грант NIH AI58181 Лорана Brossay. Синди Banh поддерживается NIH НРСА F31 AI080230.
Стефани Terrizzi и Синди Banh в равной мере участвовать в этой работе.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche Group | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | EMD Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | EMD Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | EMD Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
- Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity. 31, 35-46 (2009).
- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.
