Summary
Göbek kordonu, farklı şekillerde düz kas hücreleri izole etmek için kullanılır. Bu çalışmada izole düz kas hücreleri için enzimatik tedavi kullanılır.
Abstract
Insan göbek kordonu (UC), doğumdan hemen sonra kolayca elde edilebilir bir biyolojik örnek. Bu biyolojik örnek, çoğu zaman atılan ve toplama doğan veya annenin sağlığı için herhangi bir ek risk anlamına gelmez. Ayrıca, hiçbir etik kaygıları artırdı. UC bir ven ve her iki endotel hücreleri (EC) iki arter tarafından bestelenmiş
Protocol
- Arterler 3-7 cm UC parçalarından elde edilir.
- Arterleri çevreleyen Wharton jöle makas ile keserek dikkatlice kaldırıldı.
- Disseke arterlerin bir ucundan bir dış çapı 0.6-1mm bir künt uç iğne 7mm yerleştirildi.
- Kan damarları içinde kalan kaldırmak için, damar dikey olarak düzenlenen ve yaklaşık 20 ila 40 ml serum fizyolojik solüsyonu (PSS) ile perfüze, bir iğne bağlı 20 ml şırınga kullanarak. Gerekirse, bu yıkama adım birkaç kez tekrarlandı.
- % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye RPMI 1640 kullanarak aynı prosedür tekrarlandı.
- Bir ekstremite kan damarının kapalı idi. 10 ml şırınga, iğne bağlı ve 3 mL kollajenaz tip I (Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi (HBSS) 800 birim / ml) ile perfüze edildi. Sonra diğer extremityof gemi de kapatıldı.
- Geminin fosfat 15 dakika 37 ° ° C ajitasyon için tuzlu su solüsyonu (PBS), tamponlu ile inkübe edildi.
- Geminin ucu serbest SMC'lere toplamak için kesildi sonra. Arterlerde% 5 FBS ve 50-ml tüp için antibiyotik ile desteklenmiş DMEM-F12 yaklaşık 20 ila 40 ml serpmek.
- Tüp, oda sıcaklığında (250 g, 8 dk) santrifüj edildi ve hücre pelletini DMEM-F12 5 ml% 5 FBS ile takviye yeniden süspanse edildi.
- Hücre süspansiyonu T-balon kollajen kaplı transfer ve 37 inkübe ° C,% 5 CO 2 nemlendirilmiş bir atmosfer altında.
- , 37, 5 16 saat, yapışmaz hücre ve hücresel drebis çıkarıldı sonra 5 ml kültür ortamı eklendi ve hücrelerin inkübe edildi ° C,% 5 CO 2 nemlendirilmiş bir atmosfer altında .
- SMC'lere izdiham ulaşana kadar hücre kültür ortamı, 2, 3 günde bir değiştirildi.
- Hücreleri izdiham elde ettikten sonra, iki veya üç 25 cm 2, T-şişeler içine numaralı seribaşı.
Temizleme
- Kavuz konteyner iğneler atın.
- Büyük biohazard konteyner şırınga atın.
- Tüm doku, küçük bir biohazard çantaya koyun. Çanta ve dondurma kapatın -20 ° yakma kadar santigrat.
- Virüsit tüm araçların en az 10 dakika bekletin.
- Kullanılmayan ortamları buzdolabı dönün.
- Biyolojik tehlikeli atık eldiven atın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SMC konstriktör ilaçlar ile gelecek deneyleri için model olarak izole etmek için kullanılan ve yapısal olarak, L-tipi kalsiyum kanalları karakterize vasküler fonksiyon hücresel ve moleküler yönlerini incelemek ve doku mühendisliği onları kullanmak için olabilir. SMC'lere ve EC, insanlarda kullanılmak üzere yarı sentetik kan damarlarının üretiminde kullanılabilir yeni Biyomalzemelerin gelişimi için esastır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Amato Lusitano Hastanesi, Castelo Branco Portekiz.
Hastanesi Sousa Martins, Guarda Portekiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 3103806 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| Antibiotic | 10 μL/ 1 mL of medium | ||
| Scissors | Sterilized | ||
| Needle | Diameter of 0.6-1mm | ||
| Syringe | 10 - 20 mL | ||
| Physiological Saline Solution (PSS) | 20-40 mL per artery | ||
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 3 mL per artery |
| Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS) | Diluted collagenase | ||
| Phosphate buffered saline solution (PBS) | Warmed to 37°C |
References
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
