C. Elegans Gonad Ekstrudering: En hurtig dissektion Teknik

Overview

Denne video beskriver en metode til at dissekere gonads fra voksne C. elegans hermafroditter, hvilket resulterer i væv, der er egnede til immunostaining og fluorescerende billeddannelse.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Gervaise og Arur, Rumlig og Tidsmæssig Analyse af Aktiv ERK i C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (2016).

1. Dissektion af voksne orme til opnåelse af gonads

1. Vælg 100 - 150 WT (N2) eller den ønskede genotype af orme på det ønskede og specifikke udviklingsstadium (L1, L2, L3, L4, voksen osv.)i 100 μL M9 buffer i et 1,5 mL mikrocentrifugerør.
2. Mikrocentrifugerøret fyldes med 900 μL M9-buffer (se materialetabel). Centrifuge rørene ved 1.000 x g i en mikrocentrifuge i 1 min ved omgivelsestemperatur.
3. Fjern forsigtigt 900 μL af M9-bufferen og kassér. Fjern bufferen under et dissekerende mikroskop for at sikre, at ormene ikke fjernes ved et uheld.
4. Gentag trin 1.2 - 1.3 to gange mere med frisk M9 buffer hver gang. Dette sikrer, at alle bakterier, der blev overført med ormene, vaskes effektivt væk.
5. Efter den endelige vask fjernes 900 μL M9 buffer fra røret og kasseres.
6. De resterende 100 μL M9-buffer, der indeholder ormene 100-150 med en 200 μL-micropipettespids, overføres til en flad bundglasurskål. Sørg for, at mikropipettespidsen skæres ved 10 μL-mærket før brug. Hvis spidsen ikke skæres, vil det resultere i klipning af ormene.
7. Der tilsættes 1 - 3 μL på 0,1 M levamisole til glasurskålen, der indeholder ormene i M9-bufferen. Hvirvl forsigtigt levamisole og M9 for at gøre det muligt selv at blande, indtil ormene holder op med at bevæge sig.
   BEMÆRK: Levamisole-lagrene kan opbevares ved -20 °C til langtidsopbevaring. Her skal du bruge den højere koncentration på 1 - 3 mM end det, der er beskrevet i litteratur23 af 0,2 - 0,25 mM levamisole for at opnå hurtigt tab af mobilitet hos dyrene. Hvis dyrene flay rundt for længe i væske suspension, de deraf følgende mønstre af dpERK i gonads kan variere (på grund af stress eller mangel på ernæring eller begge dele). Mere reproducerbare farvningsmønstre er opnået med 1 - 3 mM levamisole til dissektion.
8. Fastgør to 25 G nåle til to 1 mL sprøjter (størrelsen af sprøjten betyder ikke noget, måleren af nålen er kritisk). Placer en sprøjte i hver hånd (Figur 1).
9. Under et dissekerende mikroskop skal du placere hver nål under og over hver orm som vist i figur 1 og placere et fint snit på ormen nær den anden svælgpære i en sakslignende bevægelse. Efter et snit i ormen gå videre til det næste dyr, indtil alle dyrene i skålen er blevet skåret mindst én gang.
   BEMÆRK: Vær opmærksom på, at trin 1.8 - 1.9 er tidsfølsomme. Disseker alle orme i skålen på under fem minutter for et reproducerbart dpERK-mønster. Længere dissektionstider vil resultere i, at dpERK-signalet slukkes, især i zone 1. Juster antallet af orme pr. dissektionsrunde (dvs.50 orme vs. 150), hvis det er nødvendigt for at forblive inden for den tildelte tidsramme.
   1. Hvis en ekstruderet gonad ikke er synlig under dissektionen, må du ikke forsøge et andet snit i det samme dyr. Normalt vil det kun forskyde dyret og ikke resultere i ekstrudering af gonaden. Gå i stedet videre til det næste dyr. Orme, hvor gonaderne ikke ekstruderer, vises som sådan på de dias, der vil blive lavet i afsnit 6 og kan ignoreres under billedbehandling
      BEMÆRK: Gennem alle dissektions- og behandlingstrinne er det vigtigt at huske på, at gonaden forbliver fastgjort til kroppen / slagtekroppen. Tving ikke gonaden og kroppen fra hinanden med nålen. Ofte gange en afvigende tåre i gonadal væv i et forsøg på at afskære gonaad fra kroppen kan resultere i falske antistof signal. Kroppen/slagtekroppen kan ignoreres under billedtrinnene, og kun gonad afbildes. Derudover kan tarmcellerne nogle gange også tjene som interne kontroller / somatiske kontroller for det antistof, der analyseres.

Figur 1: Demonstration af nålepositioner under dissektioner. Til venstre: Fotografi af en dissektion i processen. Til højre: Nålepositioner med henvisning til ormen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flat bottom glass watch dish	Agar Scientific	AGL4161	We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles	BD PrecisionGlide	305122
Syringes (could be 1 or 5 mL)	BD Syringes	1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole	Sigma	L9756
*M9 Buffer Recipe			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.