К. Элеганс Экструзия Гонада: Техника быстрого вскрытия

Overview

Это видео описывает метод, чтобы вскрыть гонады от взрослых C. elegans гермафродитов, в результате чего ткани, которые подходят для иммуностиминга и флуоресцентной визуализации.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Gervaise и Arur, пространственного и временного анализа активного ERK в C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (2016).

1. Рассечение взрослых червей для получения гонад

1. Выберите 100 - 150 WT (N2) или желаемого генотипа червей на желаемой и специфической стадии развития (L1, L2, L3, L4, взрослый ит.д. .) в 100 л буфера M9 в 1,5 мл микроцентрифуг трубки.
2. Заполните трубку микроцентрифуга 900 МКЛ буфера M9 (см. Таблицу материалов). Центрифуга труб при температуре 1000 х в микроцентрифуге в течение 1 мин при температуре окружающей среды.
3. Аккуратно удалите 900 мкл буфера M9 и отбросьте. Удалите буфер под рассеченным микроскопом, чтобы черви не были случайно удалены.
4. Повторите шаги 1.2 - 1.3 еще два раза со свежим буфером M9 каждый раз. Это гарантирует, что любые бактерии, которые были перенесены с червями эффективно смываются.
5. После окончательной стирки удалите из трубки 900 МКЛ буфера M9 и выбросьте.
6. Перенесите оставшиеся 100 МКЛ буфера M9, содержащего 100 - 150 червей с наконечником микропипетта 200 йл, на плоскую нижнюю стеклянную часовую тарелку. Убедитесь, что наконечник микропайпетта разрезан на отметке 10 МКл перед использованием. Не резка кончика приведет к стрижке червей.
7. Добавьте 1 - 3 МКЛ 0,1 М левамизола к стеклянной часовой тарелке, содержащей червей в буфере M9. Аккуратно вихрем levamisole и M9, чтобы даже смешивания до тех пор, пока черви перестают двигаться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Запасы левамизола могут храниться при -20 градусах цельсия для длительного хранения. Здесь используйте более высокую концентрацию 1 - 3 мм, чем описано в литературе23 из 0,2 - 0,25 мМ левамизола, чтобы добиться быстрой потери подвижности у животных. Если животные слишком долго блистали в жидкой суспензии, то полученные модели dpERK в гонадах могут быть переменными (из-за стресса или отсутствия питания или обоих). Более воспроизводимые окрашивания были достигнуты с 1 - 3 мМ левамизол для вскрытия.
8. Прикрепите две иглы 25 G к двум шприцам 1 мл (размер шприца не имеет значения, датчик иглы имеет решающее значение). Позиция одного шприца в каждой руке(рисунок 1).
9. Под рассечением микроскопа, положение каждой иглы под и над каждым червем, как показано на рисунке 1 и место тонкой разрез на червя вблизи второй фарингеальной лампы в ножницы, как движение. После одного разреза в червь перейти к следующему животному, пока все животные в блюдо были сокращены по крайней мере один раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Помните, что шаги 1.8 - 1.9 чувствительны к времени. Рассекают всех червей в блюде менее чем за пять минут для воспроизводимого шаблона dpERK. Более длительное время вскрытия приведет к выключению сигнала dpERK, особенно в зоне 1. При необходимости при необходимости оставайтесь в отведенном сроке, отрегулируйте количество червей на раунд вскрытия(т.е.50 червей против 150).
   1. В случае, если экструдированная гонада не видна во время вскрытия, не пытайтесь еще раз сократить в том же животном. Обычно это будет только спарить животное и не приведет к экструзии гонада. Вместо этого перейти к следующему животному. Черви, где гонады не выдавливются, будут отображаться как таковые на слайдах, которые будут сделаны в разделе 6 и могут быть проигнорированы во время визуализации
      ПРИМЕЧАНИЕ: Через все вскрытия и обработки шаги, важно иметь в виду, что гонад будет оставаться прилагается к телу / туши. Не заставить гона и тело друг от друга с иглой. Часто аномальный разрыв в гонадной ткани в попытке разорвать гонады из организма может привести к ложным сигналом антитела. Тело / туша может быть проигнорировано во время изображения шаги, и только гонад изображения. Кроме того, иногда кишечные клетки могут также служить в качестве внутреннего контроля / соматический контроль за антителами время анализа.

Рисунок 1: Демонстрация позиций иглы во время вскрытия. Слева: Фотография вскрытия в процессе. Справа: Позиции иглы со ссылкой на червя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flat bottom glass watch dish	Agar Scientific	AGL4161	We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles	BD PrecisionGlide	305122
Syringes (could be 1 or 5 mL)	BD Syringes	1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole	Sigma	L9756
*M9 Buffer Recipe			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.