Encyclopedia of Experiments: Biology
È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo Contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Forbered først agarose ved å tilsette E3-medium, som leverer kalsium til dechorionated embryoer til smeltet agarose. Deretter legger du til MS222 for å bedøve embryoer. Avkjøl agaroseblandingen til 38 grader Celsius, nær størkning. Velg noen dechorionated embryoer som uttrykker fluorescerende proteiner, og overfør dem til agaroseblandingen.
Deretter setter du et stempel helt inn i en glasskapillær og tegner opp ett embryo, og sørger for at det kommer inn i hodet først. Når agarose størkner, bruk tape for å holde kapillæren oppreist i et beger som inneholder E3-medium. Den åpne kapillærbunnen fremmer gassutveksling for embryoprøven.
Plasser kapillæren i prøveholderen på et lysarkfluorescensmikroskop. Laseren danner et tynt lysark, slik at et deteksjonsmål - plassert vinkelrett på prøven - for å fange et tverrsnittsbilde. I eksempelprotokollen vil vi montere sebrafiskembryoer for å avbilde det utviklende øyet.
Begynn med å forberede agarose. Smelt en forberedt 1 milliliter aliquot på 1% lavt smeltepunkt agarose i E3 medium ved 70 grader Celsius. Etter ca 15 minutter, overfør 600 mikroliter smeltet agarose til et friskt, 1,5 milliliter rør, og tilsett 250 mikroliter av E3 medium, 50 mikroliter av 0,4% MS222, og 25 mikroliter av virvelalisert fluorescerende perle lagerløsning.
Plasser røret i en varmeblokk på ca. 39 grader Celsius, for å la agarose nærme seg gelépunktet. Skyv deretter Teflon-tippede stempel ned til bunnen av 1 millimeter glass kapillærer med indre diameter. Forbered fem av disse.
Nå, kort vortex agarose blandingen og deretter overføre fem embryoer med en minimal mengde væske inn i den. Deretter setter du inn en kapillær og aspirerer ett embryo, hodet først.
Hodet må komme inn før halen, og det kan ikke være noen luftbobler. Tegn opp nok løsning, så det er omtrent to centimeter agarose over embryoet og 1 centimeter agarose under den.
Trekk ett embryo inn i hver kapillær før du fortsetter. Dette trinnet krever litt øvelse å mestre. Forbered deg på det ved hjelp av ikke-verdifulle embryoer.
Når agarose størkner helt, oppbevar prøvene i E3-medium ved å støtte kapillærene til en begervegg med plasticine, med bunnåpningen i oppløsning. Monter først prøveholderen. Sett først inn to plasthylser av riktig størrelse mot hverandre i stammen.
Spaltene på hylsene må vende utover. Fest deretter en klemskrue og sett kapillæren gjennom holderen til det svarte fargebåndet blir synlig på den andre siden.
Stram deretter klemskruen. Skyv deretter en centimeter agarose ut av kapillæren og trim den av. Sett deretter stammen inn i prøveholderskiven.
Før du laster inn prøvedisken, må du kontrollere at scenen er i øverste posisjon i kontrollprogramvaren. Bruk deretter styreskinner til å gli holderen og prøve ned i mikroskopet. Nå, bilde den valgte prøven som beskrevet i tekstprotokollen.
