Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Primeiro, prepare agarose adicionando o meio E3, que fornece cálcio aos embriões descorioados para agarose derretida. Em seguida, adicione MS222 a embriões de anestesia. Esfrie a mistura de agarose a 38 graus Celsius, perto de solidificar.
Em seguida, insira totalmente um êmbolo em um capilar de vidro e elavide um embrião, certificando-se de que ele entre de cabeça primeiro. Uma vez que a agarose solidifique, use fita para segurar a vertical capilar em um béquer contendo e3 médio. O fundo capilar aberto promove a troca de gás para a amostra de embrião.
Coloque o capilar no suporte da amostra de um microscópio de fluorescência de folha de luz. O laser forma uma folha de luz fina, permitindo um objetivo de detecção - posicionado perpendicular à amostra - para capturar uma imagem transversal. No protocolo de exemplo, montaremos embriões de zebrafish para visualizar o olho em desenvolvimento.
Comece com a preparação da agarose. Derreta uma alíquota preparada de 1 mililitro de 1% de ponto de fusão baixo em E3 médio a 70 graus Celsius. Após cerca de 15 minutos, transfira 600 microliters de agarose derretido em um tubo fresco de 1,5 mililitro, e adicione 250 microliters de E3 médio, 50 microliters de 0,4% MS222, e 25 microliters de solução de estoque fluorescente vórtice.
Coloque o tubo em um bloco de aquecimento a cerca de 39 graus Celsius, para deixar a agarose se aproximar de seu ponto de gelatina. Em seguida, empurre os desêmulas com ponta de Teflon até o fundo de capilares de vidro de diâmetro interno de 1 milímetro. Prepare cinco destes.
Agora, brevemente vórtice a mistura de agarose e, em seguida, transfira cinco embriões com uma quantidade mínima de líquido nele.
A cabeça deve entrar antes da cauda e não pode haver bolhas de ar. Elasenhe solução suficiente para que haja cerca de dois centímetros de agarose acima do embrião e 1 centímetro de agarose abaixo dela.
Desenhe um embrião em cada capilar antes de prosseguir. Esta etapa requer alguma prática para dominar.
Quando a agarose se solidificar completamente, armazene as amostras em meio E3, apoiando os capilares em uma parede de béquer com plasticina, com a abertura inferior em solução.
As fendas nas mangas devem ser voltadas para fora. Em seguida, conecte um parafuso de grampo e insira o capilar através do suporte, até que a faixa de cor preta fique visível do outro lado. Evite tocar no êmbolo.
Em seguida, aperte o parafuso do grampo. Em seguida, empurre um centímetro de agarose para fora do capilar e corte-o. Em seguida, insira a haste no disco porta-amostras.
Antes de carregar o disco de amostra, verifique se o estágio está na posição mais alta do software de controle. Em seguida, use trilhos orientadores para deslizar o suporte e amostrar para baixo no microscópio. Agora, imagem a amostra escolhida conforme descrito no protocolo de texto.
