Summary
Ein einfacher Test, um die sedierende Wirkung von Ethanol auf Maß
Abstract
Niedrige Dosen von Ethanol verursachen fliegt hyperaktiv werden, während hohe Dosen sedierende werden. Die Empfindlichkeit gegenüber Ethanol-induzierten Sedierung eines bestimmten fliegen Stamm mit, dass der Stamm s Ethanol Präferenz korreliert und daher Sedierung ist eine sehr relevante Maßnahme, um die Genetik der Alkohol Antworten und trinken zu studieren. Wir zeigen einen einfachen Weg, fliegt aussetzen Ethanol und messen ihre berauschende Wirkung. Der Test beschreiben wir können bestimmen, akute Empfindlichkeit sowie Ethanol-Toleranz durch wiederholte Exposition induziert. Es erfordert keine technisch aufwendige Setup, und kann daher in jedem Labor mit grundlegenden fliegen Kultur-Tools angewendet werden.
Protocol
1. Erstellen der Bestrahlungskammer
- Schneiden Sie ein Fläschchen Stecker in zwei Hälften mit einer Rasierklinge. Alternativ können Sie auch Wattebäusche.
- Schieben Sie das Fläschchen Plug Hälfte oder die Watte, auf den Boden eines Lebensmittels Fläschchen um eine glatte Oberfläche, dass Fliegen nicht in. stecken machen
- Wenn Sie mehrere Exposition Kammern, stellen Sie sicher, dass die Fläschchen Plug-and-Food bis zu dem gleichen Volumen in jeder Kammer. Eine Markierung auf der Seite der Flasche kann dies erleichtern.
2. Offenlegen der Fliegen
- Sammelt 8 fliegt von einem Geschlecht, Alter 1-5 Tage, dem Tag vor der Bestrahlung in regelmäßigen Essen Fläschchen ohne Hefe.
- Label sie im Code, so dass der Experimentator den tatsächlichen Genotyp / Stamm ist geblendet.
- Übertragung der acht fliegt in die Exposition Kammern durch Antippen. Nicht zu betäuben.
- Fügen Sie eine kleine Menge der Nahrung Farbstoff, zB Acid Blue 9, bis 200 Proof Ethanol, damit es gut sichtbar.
- Streichen Sie die Unterseite einer Flasche Stecker, oder Wattebausch, mit 0,5 ml Ethanol.
- Legen Sie die Ethanol-Stecker in die Exposition Durchstechflasche. Stellen Sie sicher, dass der Alkohol in das Fläschchen, und nicht gegen die Wand der Durchstechflasche nach.
- Starten Sie einen Timer auf.
3. Rekord Ethanol-induzierten Rausch
- Jede Minute, nachdem der Timer gestartet wird, tippen Sie auf die Exposition Kammer auf der Bank, um die Fliegen zu erschrecken und zu beobachten sie für 10 Sekunden.
- Notieren Sie die Anzahl der stationären Fliegen für jede Minute. Fliegen sind stationär, wenn sie nicht aussteigen dem Rücken, an einem Ort bleiben, oder schnell zu vibrieren ihre Flügel über den gesamten Zehn-Sekunden-Beobachtung-Periode. Letzterer fliegt gelten als stationäre, weil die überwiegende Mehrheit dieser fliegt stationär zwischen den Perioden des schnellen Flügel Bewegung sind. Fliegen sind nicht stationär, wenn sie aussteigen dem Rücken und zu Fuß entfernt und / oder bis das Fläschchen Wand.
- Eine Exposition Studie ist abgeschlossen, wenn 4 oder mehr Fliegen als stationäre aufgezeichnet.
- Entsorgen Sie fliegt und lassen Sie die Belichtung Kammer Luft für die spätere Wiederverwendung.
4. Bestimmen Sie die Zeit auf 50% Sedierung
Die Zeit bis zu 50% Sedierung (ST50) ist die Zeit nach dem Start der Ethanol-Exposition, wenn vier der acht fliegt stationär bleiben. Dieser wird wie folgt bestimmt:
Entweder: die erste Messung Minute, wenn genau vier fliegt stationär sind.
Oder: wenn weniger als vier Fliegen (Y1) sind an einem Zeitpunkt (Minute X), und mehr als vier (Y2) bei der nächsten Messung Zeitpunkt (Minute X +1), dann linear interpoliert die ST50 mit Hilfe der Formel stationär:
ST50 = (4 - Y1) / (Y2 - Y1) + X
5. Wiederholen Sie die Exposition gegenüber Toleranz zu bestimmen
Offenlegen der Fliegen
- Bestimmen Sie die ST50 (wt) für die Wildtyp-Kontrollstamm in Ihrem Experiment verwendet.
- Setzen Sie den experimentellen Gruppen von Fliegen zu Ethanol wie oben beschrieben.
- Messen Sie ihre ST50 (1), aber weiterhin aussetzen, bis Sie die Zeit, 2x ST50 (wt) zu erreichen.
- Übertragen Sie die fliegt zurück in ein leeres Fläschchen Nahrung, und halten Sie für 4 Stunden.
- Re-Setzen Sie die Fliegen, und bestimmen Sie die ST50 (2) der Exposition 2.
Bestimmen Toleranz
Berechnen Toleranz in% (ST50 (2) / ST50 (1) - 1) x100.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Sehen Sie hier sind einige repräsentative Ergebnisse, die wir mit 6-8 Fläschchen Fliegen pro Genotyp und Dosis erhalten. Wenn Ihr Standardfehler ist wesentlich größer, dann ein systematisches Problem wahrscheinlich aufgetreten. Stellen Sie sicher, dass das Ethanol in die Exposition Kammern Gesichter, und dass die Kammern das gleiche Volumen sind.
Abbildung 1. Dosis-Wirkungs-Kurve von Wildtyp-Fliegen auf steigende Prozentzahlen von Ethanol ausgesetzt. Acht Fläschchen Fliegen wurden pro Dosis und Geschlecht ausgesetzt. Männliche und weibliche Fliegen zeigen die gleichen ST50 bei jeder Dosis (p> 0,22, 2-Wege-ANOVA), während die ST50 über Dosierungen sinkt signifikant mit steigenden Ethanol-Dosis (p <0,001). Beachten Sie, dass aus überfüllten Flaschen fliegen kann wesentlich kleiner als jene von gesunden Flaschen, und dies Größenunterschied kann die ST50 beeinflussen. Seed jede Flasche mit 15-20 Frauen über 1-2 Tage, um eine optimale Larven Dichte pro Flasche zu bekommen.
Abbildung 2. Exposing fliegt entweder 90% oder 100% Ethanol gibt den zuvor beschriebenen Ethanol-Widerstand durch den weißen rabbit1 mutation2 (p <0,001, 2-Wege-ANOVA) verursacht.
Abbildung 3. Repeat Exposition gegenüber 100% Ethanol, im Abstand von 4 Stunden recovery interval, führt zu einem deutlichen Anstieg der ST50 nach dem zweiten Exposition (p <0,001, gepaarter t-Test). Beachten Sie, dass die Fliegen für 24 Minuten wurden während der ersten Exposition (entsprechend auf das Doppelte ihrer na ve ST50) ausgesetzt. Exposure für einen kürzeren Zeitraum (12 Minuten) nicht zu einem signifikanten Anstieg in ST50 bei wiederholter Exposition (Daten nicht gezeigt).
Discussion
In dieser Präsentation haben wir eine einfache Möglichkeit, Ethanol-induzierten Rausch auf der Grundlage früherer Untersuchungen durch Bainton et al bestimmen skizziert. 2000 1 und Rothenfluh et al. 2006 2. Da Alkohol-induzierte Sedierung mit Alkohol trinken bevorzugt 3 korreliert ist, ist dieser Test relevant für das Studium der durch Alkoholkonsum bedingte Störungen. Der beschriebene Assay basiert auf erschrecken-induzierten negativen Geotaxis basiert, und wie ein Alkohol Exposition stört diese angeborene Reaktion. Vor Beginn der Aufnahmen sicher, dass alle Ihre Fliegen zeigen eine normale Reaktion auf eine solche erschrecken, dh nach dem Klopfen Sie die Fliegen in der Lebensmittel-Fläschchen, sie sollten alle nach oben aus dem Boden in einem 10 Sekunden Beobachtungszeit. Beispiele von Fliegen mit einer verringerten negativen Geotaxis gehören Knall-und Kleinschreibung Beschlagnahme Mutanten 5, und Lokomotion-defizienten Fliegen durch die Degeneration von Dopamin-Neuronen 6 verursacht.
Auch wenn die beschriebene Assay ist relativ einfach, verdienen zwei Variablen die größte Aufmerksamkeit, um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Erstens sollten alle Exposition Fläschchen die gleiche Menge sein. Dazu gehört auch, dass der Boden des Fläschchens die gleiche Menge an Nahrung + Fläschchen Stecker / Wattebausch, sowie das Einlegen der Ethanol-haltigen Stecker die gleiche Strecke für jede Flasche enthält. Eine komplett leere Flasche kann für diesen Test verwendet werden, aber es führt zu längeren ST50-Werte, die Verringerung der Durchsatz des Assays.
Dieser Test eignet sich auch zur Höhe der Toleranz fliegt bestimmen zu entwickeln, auf Wiederholung Ethanol Exposition. Eine Reihe von Variablen sollte bei der Wiederholung Belichtungen werden. Erstens ist die inter-Belichtungsintervall hier als 4 Stunden beschrieben. Diese Variable kann geändert werden, aber wir empfehlen es nicht weniger als 2 Stunden, um Abstand von Ethanol aus der ersten Exposition zu gewährleisten. Siehe Scholz et al. 2000 4 für die Kinetik der Ethanol-Toleranz Entwicklung und Verfall. Die zweite Variable zu prüfen, ist die Dauer der ersten Exposition. Dies hat natürlich das gleiche für die Kontrolle und die experimentellen Fliegen werden. Dies kann jedoch nicht in der gleichen Menge Ethanol geliefert, diese beiden fliegen Stämme führen. Sedated fliegt absorbieren mehr Ethanol als aktive Fliegen 2, also eine Sorte, die früher möglicherweise eine höhere Dosis als zu einem späteren sedierenden Belastung erhalten sediert, und entwickeln so mehr Toleranz durch eine höhere Anfangsdosis. Es wird dringend warnen die Leser beim Vergleich Toleranz Entwicklung der Stämme, die Unterschiede in den Anfangsbedingungen ST50 (1) zu zeigen.
Der Test wir hier beschreiben, ist ein nützliches Werkzeug in leicht und reproduzierbar zu ermitteln, fliegt Verhaltensreaktionen auf Alkohol.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Aylin Rodan für die kritische Durchsicht des Manuskripts und die Mitglieder des Labors für hilfreiche Diskussionen. Diese Forschung wird durch die NIH, R01AA019526 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Exposure vials | www.flystuff.com | 32-116 | |
| Plugs | www.flystuff.com | 49-102 | |
| Acid Blue 9 | Sigma-Aldrich | 861146 |
References
- Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y., Singh, C. S., Moore, M. S. Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).
- Rothenfluh, A., Threlkeld, R. J., Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. S., Heberlein, U. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Feany, M. B., Bender, W. W. Nature. 404, 394-398 (2000).
