バイオフリップチップを用いた胚性幹細胞のパターニング

Summary

我々は、基板上に所望の位置にセルを配置するための簡単​​な方法を示しています。このメソッドは、パターン基板上への細胞で満たされたマイクロウェルを含有するシリコーンチップを反転して細胞を。このメソッドは、セル間の拡散性とjuxtacrineシグナリングを変調する新しい方法を提供します。

Abstract

拡散性シグナル伝達および細胞間接触（juxtacrineシグナリング）で構成された細胞間相互作用は、腫瘍の増殖、幹細胞の分化、および幹細胞の自己複製のような多数の生物学的プロセスにおいて重要である。メソッドの数は現在、in vitroでの細胞内シグナル伝達を調節するために存在します。拡散性シグナル伝達の変調総量の一つの方法は、培養中の細胞の播種密​​度を変化させることです。細胞播種、実際の細胞間の間隔と細胞間接触の量にかなりの変化でこの結果、及び地域の環境を処方することができないのランダムな性質に起因する。変調細胞のシグナル伝達のためのより具体的なアプローチは、特定のシグナル伝達タンパク質をノックダウンする分子阻害剤や遺伝的アプローチを使用することですが、これらのメソッドの両方が最良の分子の数が少ないが操作するのに適しています。ここで、我々は、基板上に所望の位置でセルの異なる数字を配置することで細胞のクラスタのローカル環境を調節する調節する細胞間シグナル伝達への新しいアプローチを示しています。このメソッドは、セル間の局所拡散性とjuxtacrineシグナリングを制御するための補完的な方法を提供します。我々の手法はバイオフリップチップ（BFC）、細胞の単一細胞または小数値のいずれかを保持するためにマイクロウェルの数百から数千、各サイズを含む微細加工シリコンチップを使用しています。我々は、単に井戸の配列にそれらをピペッティングし、配列からアンロードされた細胞を洗浄することにより、細胞をチップにロードする。細胞は彼らのパターニングを維持し、井戸のそして基板上に落ちるそれによってチップは、その後、基板上に反転されます。細胞が接続した後、チップは（または上左）削除することができます。細胞のパターニングへのこのアプローチは、その点でユニークです：1）このように細胞が増殖して移行できるように、基板の化学的性質を変更しないこと、2）任意の基板上にパターン形成を可能にする、組織培養ポリスチレン、ガラス、マトリゲルを含む、とさらにフィーダー細胞層、および3）それらの島々の中に置かれた細胞と細胞外マトリックスの島々の創造を可能にする、従来のマイクロコンタクトプリンティングと互換性があります。このビデオでは、我々はBFCを用いて組織培養ポリスチレン上にマウス胚性幹細胞のパターニングを示す。

Protocol

BFCの作成

BFCsは4"シリコンマスターウエハ上に成形ポリジメチルシロキサン（PDMS）で作られています。

マスターのウェハの作成

1. 130℃で30分間Siウェハを脱水することにより開始℃に
2. スピンコーター上にウエハを配置、それぞれ、40〜30ミリメートルの機能の高さを得るために30秒のためにウェーハ、300回転/秒の3000から4000回転までのランプ、そしてスピンにSU8 ​​- 2050（マイクロケム）を注ぐ。
3. スピンした後、65℃ホットプレート上にウエハを配置、直ちに℃で5〜6分間、その後65℃にランプダウン95に温度をランプアップ
4. 暗視野マスクを使用して、コンタクトアライナで200ミリジュール/ cm ²のUV用量にウェハを公開。
5. 65ウェーハを置き° Cホットプレート、直ちに° C 4-5分間95に温度をランプアップし、65℃の下のそれをランプ
6. PMアセテートとイソプロパノールのウェーハを開発する。
7. からPDMSを防ぐために、ヘキサメチルジシロキサン（信越MicroSi）、または（トリデカフルオロ-1,1,2,2 - テトラヒドロ）-1 - トリクロロシランを（t2492 - KG、UCT特産、ブリストル、ペンシルバニア州）、使用して30分間ウェーハをSilanize Siのマスターのウェハに付着。

成形チップ

1. 10:1の比でミックスPDMS（ダウコーニング、Sylgard 184）、マスターのSiウェハ（ウェハ当たり約15 g）を介してそれを注ぐ、そしてそれは、室温で一晩硬化させることができます。
2. Siウェーハオフ硬化PDMSピールとカミソリの刃を使用して各チップを切り出した。
3. 扱いやすいの1x1センチカットの顕微鏡のスライドへの結合の各チップを。

使用するためのBFCの準備

1. 実験中にPDMSにメディアの吸収を防ぐために、PBSでBFC一晩浸漬する。
2. キムワイプ（Kimtech科学）のチップを乾燥させます。
3. 7.5％の低下を置くウシ血清アルブミン（BSA）（〜200mL）をBSAを分散させ、井戸からの気泡を除去するためにピペットチップでそれをこすりしBFCのパターン化表面上に、と。
4. 少なくとも0.5時間BFC表面にBSAを残す。理想的にはBSAの痂皮を防ぐために15分毎に撹拌。
5. 35x10 mmのTCPSディッシュ（ファルコン、35〜3001）の内側BFCに合わせて、¾"バインダークリップが（オフィスデポ）チップをクランプするために皿の縁に合うれるようにダウンTCPS皿の半分ほどの縁切ると一緒に料理。
6. PDMSシート（シリコン特選商品）や他のシリコンからスペーサーガスケットを（20'20ミリメートル外側の縁、15'15ミリメートル内縁、及び250〜500ミリメートルの厚さで枠状）カットし、皿にそれを適用するピンセットを使って。

BFCとパターニング細胞

1. 1分間UV光下皿、ガスケット、BSAでコーティングされたチップ、2バインダークリップを滅菌する。
2. BSAを吸引し、200 mLのPBSで2回BFCをすすぐ。
3. あなたのセルラインに必要な場合にはカットTCPSディッシュにゼラチンを追加します。そうでない場合は、（下記参照）チップに適用する前に、いくつかのメディアでTCPS表面を濡らし。これにより、チャンバー内に形成される気泡を防ぎます。
4. PBSを吸引後、細胞溶液のピペットを200mL（〜1 × 10 ⁶細胞/ mL）BFC表面に。細胞は5〜10分間のために解決しましょう​​。
5. 〜15 °の角度で角の1つにBFCを傾けて、ゆっくりと200mLのピ​​ペットで細胞溶液をオフピペット。その後、BFC平らに置き、反対側のBFCのコーナーにPBSまたはブランクメディアを100 mLを加え。間だけでなく地域からのすべてのセルをクリアするには、この方法で、必要に応じて追加の2-4回、BFCをすすいでください。
6. チップの表面上にメディアのピペットを200mL。 TCPSからゼラチン/培地を吸引除去する。その後、事前に接液皿を逆さにしてゆっくりと皿に、BFCの上を押してください。
7. それを密封するためにチャンバーの両側に、それぞれのクリップバインダーを適用します。裏返し時にその料理が水平を保つようにバインダークリップから金属製プロングを取り外します。
8. 最後に、すぐに不要な動きを避けながら上にセットアップを反転し、インキュベーターに入れてください。

Discussion

パターンのマウス胚性幹細胞（mESCs）にBFC ^1を使用して記述するここに示されているプロトコルやビデオが、BFCsはパターンに興味のある実質的に任意のセル型を使用することができます。一つ加える必要が唯一の変更は、マイクロウェルの大きさを変更することです。我々の経験で、最高の動作する​​別の細胞型、マイクロウェルの直径と結合されていない細胞の直径よりも大きい10ミクロンに等しい高さのパターン単一細胞にBFCを使用する。

BFCsは、プロトコルの大幅な変更を加えることなく、他の細胞を含む他の基質、上のパターンのセルに使用することができます。既存の細胞層上にパターニングはmESCsと人間のES細胞を含む特定のcelltypesは、、サポートやフィーダー細胞が培養内の適切な表現型を維持するために必要とするので、従来の細胞のパターニング手法よりもBFCのアプローチの利点の1つです。

我々が追求しているBFCの一つのアプリケーションは、マウス胚性幹細胞間のシグナリングを調査するBFCを使用することです。異なるグリッド間隔で正方形の格子に、単一の細胞を播種することにより、我々は、シグナル分子が細胞によって交換される速度を調節する。大規模な井戸を（40ミクロ​​ンの直径を持つ）することにより、我々はまた、局所的に細胞密度を変えること、与えられた場所で大きい数字（〜2-10）の細胞を収集することができます。さらに、我々は、細胞が接触していないことで、ローカルの細胞密度が高い基板パターンで、その結果、相互に近接して小さな井戸の数を配置することができます。この方法で、我々は独立して細胞間の拡散性とjuxtacrineシグナリングを調節することができる。グリッド内のセルを持つことも、数日間にわたって細胞を追跡することが容易になります。我々は、BFCと細胞パターン形成の容易さは他の研究者は彼らの研究でそれを使うことを奨励することを信じています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Silicon master mould
Tissue culture dishes	Falcon BD	35-3001	35 mm
3/4" binder clips
PBS
hexamethyldisiloxane	Shin-Etsu MicroSi
New Item	MicroChem Corp.	SU8-2050
PM acetate
Isopropanol
BSA			7.5% Bovine Serum Albumin