Summary
우리는 기판에 원하는 장소에서 세포를 삽입하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. 이 방법은 패턴을 기판에 전지 가득 microwells를 포함하는 실리콘 칩을 틀지하여 세포를. 이 방법은 세포 사이의 diffusible 및 juxtacrine 신호를 조절하는 새로운 방법을 제공합니다.
Abstract
diffusible 신호와 세포 세포 접촉 (juxtacrine 신호)의 구성 세포 - 세포 상호 작용은 종양 성장, 줄기 세포 분화와 줄기 세포 자체 재생과 같은 다양한 생물 학적 과정에 중요합니다. 방법 숫자는 현재 체외에서 세포 신호를 변조하기 위해 존재합니다. diffusible 신호의 modulating 총액의 한 가지 방법은 문화 중에 세포 시딩 밀도를 변경할 수 있습니다. 셀 심는 실제 셀 - 셀 간격 및 셀 셀 문의 금액에 상당한 차이이 결과와 지역 환경을 처방할 수의 무작위 특성으로 인해. modulating 세포 신호에 대한보다 구체적인 접근 방식은 특정 신호 단백질을 노크 분자 억제제 또는 유전자 접근 방법을 사용하는 것입니다하지만, 이러한 방법 모두는 최고의 분자 작은 숫자를 조작하는 데 적합합니다. 여기, 우리는 기판에 원하는 장소에서 세포의 서로 다른 숫자를 배치하여 세포의 클러스터의 로컬 환경을 modulates modulating 세포 세포 신호 전달에 대한 새로운 접근 방식을 보여줍니다. 이 방법은 세포 사이의 지역 diffusible 및 juxtacrine 신호를 제어하는 보완적인 방법을 제공합니다. 우리의 방법은 바이오 플립 칩 (BFC)의 사용, 단일 셀 또는 셀 작은 숫자 중 하나를 잡아 microwells, 각 크기의 수백 - 투 - 수천을 포함하는 microfabricated 실리콘 칩을 수 있습니다. 우리는 단순히 우물의 배열에 그들을 pipetting하고 배열에서 내렸어요 세포를 세척하여 세포와 칩로드합니다. 세포들이 patterning을 유지, 우물과 기판에 빠질 의하여이 칩은 다음, 기판에 뒤집혀 있습니다. 세포가 첨부되면 칩 (또는 왼쪽) 제거할 수 있습니다. 세포 patterning이 방법은 독특한 것을에 : 1) 따라서 세포가 세포 분열 따위에 의해 번식하고 마이 그 레이션 수 있도록 기판의 화학을 변경하지 않고 조직 문화 폴리스티렌, 유리, matrigel 포함한 모든 기판에 patterning이 가능 2), 그리고 심지어 피더 세포 레이어를하며, 3) 그 제도 안에 세포와 세포외 기질 제도의 창조를 허용 전통 microcontact 인쇄와 호환됩니다. 이 비디오에서는, 우리는 BFC를 사용하여 조직 문화의 폴리스티렌에 마우스 배아 줄기 세포의 patterning을 보여줍니다.
Protocol
BFC 만들기
BFCs는 4 "시 마스터 웨이퍼를 통해 성형 polydimethylsiloxane (PDMS)에 의해 만들어집니다.
마스터 웨이퍼 만들기
- 130 30 분시의 웨이퍼를 dehydrating부터 시작 ° C.
- 스핀 - coater에서 웨이퍼를 놓고, 각각 40~30밀리미터의 기능을 높이를 얻을 수 30 s에 대한 3000-4000 RPM 300 RPM / s에서 램프, 웨이퍼에 SU8 - 2050 (Microchem)을 붓고, 그리고 스핀.
- 스피닝 후 65 ° C 열판에 웨이퍼를 장소, 즉시 ° C 5-6 분, 그리고 65 ° C. 그것을 아래 진입로 95 온도를 램프
- 어두운 필드 마스크를 사용하여 연락처 aligner 200 MJ / cm 2의 UV 복용에 웨이퍼를 노출.
- 65 ° C 열판에 웨이퍼를 놓고 즉시 95의 온도를 램프 ° 후 4-5 분 C 및 65 ° C. 그것을 아래로 램프
- PM 아세테이트 및 이소프로판올의 웨이퍼를 개발할 수 있습니다.
- 헥사 메틸 디 실록산을 (신 Etsu MicroSi)를 사용하여 30 분 웨이퍼를 Silanize, 또는 (Tridecafluoro - 1 ,1,2,2 - tetrahydrooctyl) - 1 - trichlorosilane에서 PDMS를 방지하기 위해 (t2492 - KG, UCT Specialities, 브리스톨, PA) 시 마스터 웨이퍼에 준수.
성형 칩
- 10시 1분 비율 혼합 PDMS은 (다우 코닝, Sylgard 184), 마스터시 웨이퍼 (웨이퍼 당 ~ 15g)을 통해 그것을 부어,하고 실온에서 하룻밤 치료하자.
- 필시 웨이퍼에서 PDMS를 치료하고 면도날을 사용하여 각 칩을 잘라 버릴거야.
- 쉽게 처리할 수있는 1x1 cm 컷 현미경 슬라이드에 본드 각 칩을.
사용 BFC 준비
- 실험 중에 PDMS에 미디어의 흡수를 방지하기 위해 PBS에 BFC 하루를 만끽해보세요.
- Kimwipe (Kimtech 과학)로 칩을 건조.
- 7.5 %의 감소를 넣어 소 혈청 알부민 (BSA) (~ 200 ML) BSA를 분산하고 우물에서 모든 거품을 제거하는 피펫 팁 그것을 긁어 다음 BFC의 패턴 표면에합니다.
- 적어도 0.5 시간 동안 BFC 표면에 BSA를 남겨주세요. 이상적으로 BSA에게 crusting 방지하기 위해 매 15 분 선동.
- 35x10 mm TCPS 요리 내부 BFC (팔콘, 35-3001)를 맞추려면, 아래 있도록 TCPS 요리 절반 방식의 테두리를 잘라 그 어 "바인더 클립 (오피스 디포)는 칩 클램프하기 위해 접시 가장자리를 통해 들어갈 것이고, 함께 요리.
- PDMS 시트에서 스페이서 가스켓 (20'20 mm 바깥 가장자리, 15'15 mm 안쪽 가장자리와 2백50~5백밀리미터 두께와 프레임 형태) (실리콘 특수 제품) 또는 다른 실리콘을 잘라, 그리고 요리에 적용 핀셋을 사용합니다.
BFC로 Patterning 세포
- 1 분 자외선 아래 접시, 가스켓, BSA - 코팅 칩, 2 바인더 클립을 소독.
- BSA를 대기음 200 ML PBS로 두 번 BFC를 씻어.
- 휴대폰 라인에 필요한 경우 컷 TCPS 요리에 젤라틴 추가합니다. 그렇지 않으면, 칩 (아래 참조)에 적용하기 전에 일부 매체와 TCPS 표면을 젖었어. 이것은 챔버의 형성에서 거품을 방지합니다.
- PBS를 aspirating 후, 세포 솔루션 피펫 200 ML (~ 1 × 10 6 세포 / ML) BFC 표면. 세포 5-10 분 정착하자.
- ~ 15 ° 각도로 한 구석에 BFC를 기울이기 천천히 200 ML의 피펫으로 세포 솔루션을 피펫. 그런 다음, BFC 평면을 배치하고 반대 BFC 코너에 PBS 또는 빈 미디어의 100 ML를 추가합니다. 상호 물론 지역의 모든 세포를 취소하고,이 방식으로 필요한 추가 2-4 번, BFC를 씻어.
- 칩 표면에 미디어의 피펫 200 ML. TCPS에서 젤라틴 / 미디어 대기음. 그런 다음 미리 침수 요리를 반전 천천히 그릇에, BFC의 최대 밀어.
- 바인더 그것을 봉인하기 위해 챔버의 양측에 각각 클립 적용합니다. 이상의 이성을 상실 때 요리는 레벨 남아 있도록 바인더 클립에서 금속 접지 단자를 제거합니다.
- 마지막으로, 신속하게 불필요한 움직임을 피하는 동안에 걸쳐 설치를 플립, 그리고 보육에 놓으십시오.
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Discussion
여기에 나와있는 프로토콜 및 비디오 패턴 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에 BFC 1을 사용 설명하지만, BFCs는 패턴의 관심 실질적으로 모든 세포 유형을 사용할 수 있습니다. 하나는해야 수있는 유일한 변화는 microwells의 크기를 변경하는 것입니다. 우리의 경험에서 가장 잘 작동 다른 세포 유형, microwell 직경과 무소속의 세포 직경보다 10 미크론와 같은 높이의 패턴을 하나의 세포로 BFC를 사용할 수 있습니다.
BFCs는 프로토콜의 중요한 변경없이 다른 세포를 포함한 다른 기판, 패턴에 세포에도 사용할 수 있습니다. 기존 셀 계층에 Patterning는 mESCs 인간 ESCs 포함한 특정 celltypes는, 지원이나 피더 세포 문화에서 적절한 표현형을 유지하기 위해 수행해야하기 때문에 기존의 세포 patterning 접근 방식을 통해 BFC 접근법의 장점입니다.
우리가 추구하는 BFC 중 하나는 응용 프로그램은 마우스 배아 줄기 세포 사이에 신호 조사 BFC를 사용하는 것입니다. 다른 그리드 spacings와 광장 lattices의 단일 세포를 시딩함으로써, 우리는 신호 분자가 세포에 의해 교환되는 속도를 조절. 큰 우물 (40 미크론의 직경)함으로써, 우리는 로컬 세포 밀도를 변경, 특정 위치에 더 큰 숫자 (~ 20-10) 세포를 수집할 수 있습니다. 또한, 우리는 세포가 접촉되지 않은 지역으로 세포 밀도가 높은 기판 패턴의 결과, 서로 가까이에있는 작은 우물의 숫자를 배치할 수 있습니다. 이런식으로, 우리는 독립적으로 세포 사이 diffusible 및 juxtacrine 신호를 조절하실 수 있습니다. 그리드의 세포를 갖는하면 며칠 동안 세포를 추적하기가 훨씬 더 쉬워집니다. 우리는 BFC와 세포 patterning의 용이성이 다른 연구자들이 연구에 사용하는 것이 좋습니다 것입니다.
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Acknowledgments
이 작품은 NIH 부여 EB007278에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Silicon master mould | |||
| Tissue culture dishes | Falcon BD | 35-3001 | 35 mm |
| 3/4" binder clips | |||
| PBS | |||
| hexamethyldisiloxane | Shin-Etsu MicroSi | ||
| New Item | MicroChem Corp. | SU8-2050 | |
| PM acetate | |||
| Isopropanol | |||
| BSA | 7.5% Bovine Serum Albumin |
References
- Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment. Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).
