Padronização de Células-Tronco Embrionárias Usando o Chip Bio Virar

Summary

Demonstramos um método simples para colocar as células em locais desejados sobre um substrato. Este método padrões células lançando um chip de silicone contendo micropoços preenchidos com células na superfície do substrato. Este método oferece uma nova forma de modular a sinalização difusíveis e juxtacrine entre as células.

Abstract

Interações célula-célula consistindo de sinalização e difusíveis contato célula-célula (sinalização juxtacrine) são importantes em vários processos biológicos como o crescimento do tumor, a diferenciação de células-tronco, células-tronco e auto-renovação. Uma série de métodos existem atualmente para modular sinalização celular in vitro. Um método de modular a quantidade total de sinalização difusíveis é variar a densidade de semeadura de células durante a cultura. Devido à natureza aleatória de semeadura de células, isso resulta em uma considerável variação no espaçamento célula-real ea quantidade de contato célula-célula, e não pode prescrever o meio ambiente local. Uma abordagem mais específica para a sinalização celular modular é a utilização de inibidores moleculares ou abordagens genéticas para derrubar proteínas específicas de sinalização, mas ambos os métodos são mais adequados para a manipulação de um pequeno número de moléculas. Aqui, nós demonstramos uma nova abordagem para sinalização célula-célula de modulação que modula o meio ambiente local de um aglomerado de células, colocando números diferentes de células nos locais desejados sobre um substrato. Este método oferece uma forma complementar para controlar a sinalização local difusíveis e juxtacrine entre as células. Nosso método faz uso do Chip Bio Flip (BFC), um chip de silicone microfabricated contendo centenas-de-milhares de micropoços, cada tamanho para segurar ou uma única célula ou um pequeno número de células. Nós carregar o chip com células simplesmente pipetando-los para a matriz de poços e lavar as células descarregado fora do array. O chip é então colocado sobre um substrato, no qual as células saem dos poços e na superfície do substrato, mantendo a sua padronização. Depois que as células têm ligado, o chip pode ser removido (ou deixadas por diante). Esta abordagem para padronização celular é o único que: 1) não altera a química do substrato, permitindo assim que as células a proliferar e migrar; 2) permite modelar em qualquer substrato, incluindo da cultura de tecidos de isopor, vidro, Matrigel, e mesmo alimentador de camadas de células, e 3) é compatível com a impressão microcontact tradicional, permitindo a criação de ilhas de matriz extracelular com células colocadas dentro dessas ilhas. Neste vídeo, demonstramos a padronização de células-tronco embrionárias de camundongos em cultura de tecidos de poliestireno utilizando o BFC.

Protocol

Fazendo uma BFC

BFCs são feitos por moldagem PDMS (polidimetilsiloxano) sobre um wafer 4 master "Si.

Fazendo um wafer mestre

1. Comece por desidratação as bolachas Si por 30 min a 130 ° C.
2. Coloque o wafer sobre um spin-coater, despeje SU8-2050 (Microchem) sobre o wafer, rampa de 300 rpm / s para 3000-4000 rpm, e giro por 30 s para produzir alturas característica de 40-30 mm, respectivamente.
3. Depois de girar, coloque a bolacha em um 65 ° C placa, imediatamente rampa até a temperatura a 95 ° C por 5-6 min, em seguida, rampa para baixo a 65 ° C.
4. Expor as bolachas a uma dose de UV de 200 mJ / cm ² em um alinhador de contatos usando uma máscara de campo escuro.
5. Coloque as bolachas em uma placa 65 ° C, imediatamente rampa até a temperatura para 95 ° C por 4-5 min, em seguida, rampa para baixo a 65 ° C.
6. Desenvolver as bolachas em acetato de PM e Isopropanol.
7. Silanizadas as bolachas por 30 min usando hexametildisilazano (Shin-Etsu MicroSi), ou (Tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-triclorosilano (t2492 KG, Especialidades UCT, Bristol, PA), para evitar de PDMS aderindo ao mestre wafer de silício.

Fichas de moldagem

1. Mix PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) em uma proporção de 10:1, despeje-o sobre a bolacha Si master (~ g 15 por wafer), e deixe-o cura de noite à temperatura ambiente.
2. Descasque as curada PDMS fora do wafer Si e cortar cada chip usando uma lâmina de barbear.
3. Vínculo cada chip para uma lâmina de microscópio 1x1 centímetros corte para fácil manuseio.

Preparando o BFC para uso

1. Embeber o overnight BFC em PBS, a fim de prevenir a absorção de mídia no PDMS durante o experimento.
2. Seca os chips com um Kimwipe (Kimtech Science).
3. Coloque uma gota de 7,5% albumina sérica bovina (BSA) (~ 200 mL) na superfície padronizada do BFC, e depois raspá-lo com uma ponta de pipeta para dispersar a BSA e retire as bolhas dos poços.
4. Deixe a BSA na superfície BFC por pelo menos 0,5 horas. O ideal é agitar a BSA a cada 15 minutos para evitar que crostas.
5. Para se ajustarem ao BFC dentro de um prato de 35x10 milímetros TCPS (Falcon, 35-3001), corte as bordas de uma maneira TCPS prato meia para baixo de modo que a ¾ "binder clips (Office Depot) caberá ao longo da borda prato para prender o chip e prato juntos.
6. Cortar uma junta espaçador (frame-moldado com 20'20 borda externa milímetros, borda milímetros 15'15 interior, e 250-500 mm de espessura) de uma folha de PDMS (Specialty Products Silicone) ou qualquer outro silicone, e aplicá-lo ao prato usando uma pinça.

Células com uma padronização BFC

1. Esterilizar o prato, junta, BSA revestido chip, e 2 grampos da pasta sob luz UV durante 1 minuto.
2. Aspirar a BSA e lavar o BFC duas vezes com 200 mL PBS.
3. Adicione a gelatina ao prato TCPS corte se necessário para o seu celular-line. Caso contrário, a superfície molhada TCPS com alguns meios de comunicação antes de aplicá-lo para o chip (veja abaixo). Isso evita que se formem bolhas na câmara.
4. Após aspiração do PBS, pipetar 200 mL de solução de célula (~ 1 × 10 ⁶ células / mL) sobre a superfície BFC. Permitir que as células se contentar com 5-10 min.
5. Incline o BFC para um canto em um ângulo de 15 ° ~ e, lentamente, a solução da pipeta celular desligado, com uma pipeta de 200 mL. Então, coloque o flat BFC e adicionar 100 mL de PBS ou mídia em branco para o canto oposto BFC. Lavar o BFC desta forma um adicional de 2-4 vezes, se necessário, para limpar todas as células das regiões inter-bem.
6. Pipetar 200 mL da mídia sobre a superfície do chip. Aspirar gelatina / media da TCPS. Em seguida, inverta o prato pré-molhada e lentamente empurre para cima BFC, no prato.
7. Aplique uma pasta de cada clipe, a dois lados da câmara para selá-lo. Remova os pinos de metal da grampos da pasta, para que prato permanece nível quando capotou.
8. Finalmente, virar rapidamente a configuração mais, evitando qualquer movimento desnecessário, e colocá-lo na incubadora.

Discussion

Embora o protocolo e vídeo mostrado aqui descrevem como usar o BFC ^um padrão de células-tronco embrionárias de rato (mESCs), BFCs pode ser usado para padrão de praticamente qualquer tipo de célula de interesse. A única mudança pode-se precisar fazer é alterar o tamanho das microcavidades. Em nossa experiência, para usar o BFC às células padrão único de outro tipo de célula, um diâmetro de micropoços e altura igual a 10 microns maior que o diâmetro das células unattached funciona melhor.

BFCs também pode ser usado para as células padrão em outros substratos, incluindo outras células, sem alterações significativas no protocolo. Padronização em uma camada de células existentes é uma vantagem da abordagem BFC sobre abordagens tradicionais padrões celulares desde celltypes certos, incluindo mESCs e CES humanos, requerem células de apoio ou alimentação para manter seu fenótipo adequado em cultura.

Uma aplicação do BFC que estamos buscando é a utilização do BFC para investigar sinalização entre as células-tronco embrionárias de camundongos. Semeando células individuais em reticulados quadrados, com espaçamentos de grade diferente, nós modulam a velocidade com que as moléculas de sinalização são trocadas por células. Fazendo poços maiores (com um diâmetro de 40 microns), podemos também recolher um número maior (~ 2-10) células em um determinado local, alterando localmente densidade celular. Além disso, podemos colocar uma série de pequenos poços em estreita proximidade um do outro, resultando em um padrão de substrato onde a densidade de células locais é alto por células não estão em contato. Desta maneira, podemos modular a sinalização de forma independente e difusíveis juxtacrine entre as células. Tendo células em uma grade também torna muito mais fácil de rastrear células durante vários dias. Acreditamos que a facilidade de padronização célula com o BFC vai encorajar outros pesquisadores a utilizá-lo em seus estudos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Silicon master mould
Tissue culture dishes	Falcon BD	35-3001	35 mm
3/4" binder clips
PBS
hexamethyldisiloxane	Shin-Etsu MicroSi
New Item	MicroChem Corp.	SU8-2050
PM acetate
Isopropanol
BSA			7.5% Bovine Serum Albumin