Summary
De ziekte van Lyme is de meest gerapporteerde vector overgedragen ziekte in Noord-Amerika. De verwekker, Borrelia burgdorferi is een spirocheet bacterie overgedragen door Ixodes teken. Transmissie en detectie van infectie bij diermodellen wordt geoptimaliseerd door het gebruik van teek voeding, die hier beschreven.
Abstract
Toezending van het etiologische agens van de ziekte van Lyme, Borrelia burgdorferi, gebeurt door de bevestiging en bloed voeden van Ixodes soorten op teken zoogdiergastheren. In de natuur kan deze zoönotische bacteriële pathogenen verschillende reservoir gastheren gebruiken, maar de wit-betaalde muis (Peromyscus leucopus) is de primaire reservoir voor larven en nimfen teken in Noord-Amerika. Mensen zijn incidentele gastheren vaakst besmet met B. burgdorferi door de beet van teken in de nimfenstadium. B. burgdorferi past zijn gastheren gehele enzoötische cyclus, zodat de mogelijkheid om de functies van deze spirocheten en hun effecten verkennen zoogdierlijke gastheren vereist het gebruik van teken geeft. Daarnaast is de techniek van xenodiagnosis (met behulp van de natuurlijke vector voor detectie en herstel van een besmettelijke agent) bruikbaar in studies van cryptische infectie geweest. Voor het verkrijgen teken nymphal die haven B. burgdorferi,teken worden gevoed live-spirocheten in cultuur door middel van capillaire buizen. Twee diermodellen, muizen en niet-menselijke primaten, worden het meest gebruikt voor de ziekte van Lyme studies met tik geeft. We tonen de methoden waarmee deze teken kan worden gevoerd op en hersteld van dieren voor zowel infectie of xenodiagnosis.
Introduction
In 2011, de ziekte van Lyme was de 6 meest voorkomende Nationaal Aangifteplichtige ziekte in Noord-Amerika ( http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ). B. burgdorferi is een veelzijdige microbe, zowel genetisch en antigeen (beoordeeld in 1). Zijn genetische constitutie bevat een grote (> 900 kB) chromosoom en maximaal 21 plasmiden (12 lineaire, circulaire 9), met plasmide inhoud variërend tussen isolaten. Veel wordt geleerd over deze spirocheet, als meer dan 90% van het plasmide open reading frames zijn verwant is aan enige bacteriële sequenties 2,3. B. burgdorferi biedt uiteenlopende antigenen als mogelijke doelwitten van gastheer immuniteit. Echter, een onbehandelde infectie vaak blijft. De interactie van spirocheten met de teek milieu en de gewervelde gastheer milieu moeten aanpassen door B. burgdorferi tijdens het infectieproces. Verschillende plasmide gecodeerdegenen is bekend dat verschillend tot expressie als reactie op veranderingen in temperatuur, pH, celdichtheid en zelfs fase van de teek levenscyclus 4-8.
De studie van B. burgdorferi aanpassing gehele enzoötische cyclus en gastheer responsen na infectie door de natuurlijke route is gebaseerd op het vermogen om teken voeden geschikte diermodellen. Dergelijke studies zijn ontmoeting met de technische uitdagingen van het genereren van teken die B. haven burgdorferi, en zorgen voor een efficiënte transmissie en / of het voeren van teken van het model host. Bovendien, de insluiting en terugwinning van geïnfecteerde teken essentieel. Onder de gebruikte modellen zijn muizen en niet-menselijke primaten, die elk fungeert als een waardevol instrument Lyme onderzoek. Zoals met de witte-betaalde muis, dat is een natuurlijke reservoir gastheer voor B. burgdorferi, het laboratorium muis is een zeer gevoelig host die persisterende infectie ondersteunt door B. burgdorferi 9. Folgende infectie van ziekte vatbare muizen, zoals C3H stam, de spirocheten verspreiden meerdere weefsels, waaronder de huid, blaas, spieren, gewrichten en het hart. Inflammatoire reacties op de infectie leiden tot zieke hart en gewrichtsweefsel. Terwijl de spirocheten volharden in deze gastheer en besmettelijke blijven, kan ontstekingshaarden onderbroken worden, niet in tegenstelling tot het proces bij de mens. Het muismodel heeft aldus verstrekte veel informatie over B. burgdorferi-geïnduceerde pathologie, met inbegrip van artritis en carditis en gastheer immuunreacties 10-12. Vanuit het perspectief van de ziekteverwekker, hebben bepaalde genen differentieel tot expressie in zoogdiercellen infectie gekenmerkt, zo hebben sommige nodig zijn voor de transmissie van de teek vector 13-21.
Hoewel verscheidene diersoorten zijn gebruikt om de ziekte van Lyme 22 bestuderen, rhesus makaken nauwst multi-orgaan karakter van menselijke ziekte na te bootsen 23. In tegenstelling tot anderediermodellen, de breedte van ziekteverschijnselen zoals erythema migrans, carditis, artritis en neuropathie van het perifere en centrale zenuwstelsel waargenomen bij makaken. Bij muizen, het reservoir gastheer voor B. burgdorferi, de ziekte verschilt per muizenstam en leeftijd 24, terwijl de vroege en late-verspreid manifestaties zijn ongewoon 9. Bovendien, andere knaagdieren, haasachtigen, en hoektanden allemaal niet aan neurologische ziekte vertonen van B. burgdorferi infectie 25. Belangrijk, makaken vertonen tekenen die kenmerkend zijn voor alle drie de fasen van Lyme-borreliose, namelijk vroeg-gelokaliseerde, vroeg-verspreid, en een laat stadium de ziekte van Lyme 26-28 zijn. Erythema migrans (EM) wordt verondersteld voor bij 70-80% van de menselijke gevallen 29 en wordt ook gezien bij rhesus makaken 28,30. Na infectie, de spirocheten verspreiden van de plaats van inoculatie meerdere organen. Spirochetal DNA is in het skelet mu gedetecteerdscles, hart, blaas, perifere zenuw en plexus, en in het centrale zenuwstelsel (hersenen, hersenstam en cerebellum, het ruggenmerg en de dura mater) 31.
Vink voeden met muizen is gebruikt door ons en andere onderzoeksteams voor vermeerdering van teek kolonies, in het reservoir competentie studies 32-36 en in studies van B. burgdorferi pathogenese 37-40. Deze techniek is ook gebruikt voor xenodiagnosis en testen van werkzaamheid van het vaccin in muizen 41-44. We hebben gevoed Ixodes teken op niet-menselijke primaten voor modelontwikkeling 28, een studie van de werkzaamheid van het vaccin 45, en voor xenodiagnosis bij de beoordeling van persistentie post-antibiotische behandeling 46. Teken die haven B. burgdorferi kan in een natuurlijke endemische cyclus worden gehandhaafd door voeden larven op besmette muizen en met behulp van de nimfen voor studies, zoals de spirocheten worden overgedragen via de levensfasen. In dit verslag, Instrueren we over hoe teken besmet met wild-type of mutant B. genereren burgdorferi, met behulp van capillaire sondevoeding. Dit kan ook worden bereikt door microinjectie 47 en door onderdompeling 48. Het doel van kunstmatige introductie van B. burgdorferi in teken kunnen zijn om mutante stammen die overdraagbaarheid onbekend bestuderen, een groep teken met een hoge infectie genereren en om de mogelijkheid op fouten bij het handhaven van een schoon en anderszins geïnfecteerde teek kolonie. Daarnaast tonen we teek voeden met muizen en niet-menselijke primaten, om zo de insluiting en terugwinning van vol teken te verzekeren. Het gebruik van teek voeding is essentieel voor toekomstige studies van immune reacties op B. burgdorferi infectie, potentiële Lyme werkzaamheid van het vaccin, en xenodiagnosis voor de detectie van occulte infecties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Een experimentele overzicht van teken inoculatie en voeding bij dieren Lyme onderzoek wordt weergegeven in figuur 1.
1. Inoculating nymphal Ixodes onbijt met B. burgdorferi Met behulp van capillaire sondevoeding
Bij het uitvoeren van manipulaties met teken, zijn witte laboratorium jassen met elastische mouwen, handschoenen en wegwerp bouffant caps gedragen.
- Onze techniek is een gemodificeerde versie van die beschreven door Broadwater et al.. 49. Bereid capillairen door verhitting en trekken Pasteur pipetten te breken dunheid met behulp van een pipet trekker. Met behulp van een tang en ontleden scope, breken de tips om de optimale diameter (ongeveer 0,2 mm). Een buis gestandaardiseerd om de teek mouthpart formaat wordt gebruikt als een dimensionering gids. Een gezichtsmasker moeten gedragen worden bij het opstellen van de pipetten.
- Grow B. burgdorferi tot tussen 2-8 x 10 7 / ml (mid-log fase) in BSK-H medium (Sigma) conbevattende 6% konijn serum.
- Gebruik nymphal teken die zijn opgeslagen bij 23 ° C gedurende 4-6 weken na larvale vervellen. Plaats teken op een kleine 60 x 15 mm petrischaal met dubbelzijdig tape op de buitenste onderkant van de schotel. Plaats de teken-ventrale zijde naar boven.
- Dompel de capillair tip in de B. burgdorferi kweekbuis na het mengen. Plaats de capillaire buis over de hypostoom van de teek monddelen met behulp van een dissectie scope. Gebruik molding klei aan de buis vast te zetten, zoals getoond in figuur 2A.
- Plaats de petrischaaltjes met aangebrachte teken in een grote doorzichtige plastic bad voor een extra niveau van insluiting. Natte papieren handdoeken worden toegevoegd om vocht te voorzien. Plaats de teken in een 37 ° C incubator thermische 30 min-2 uur tot ontlasting blijkt. Dit geeft aan dat het medium dat spirocheten passeren van de teek.
- Plaats het teken gedurende 2-4 weken bij 23 ° C tot aanpassing aan de teek ruimte biedt voor het voedendeze dieren.
2. Infecteren Muizen met B. burgdorferi door Tick
- Verdun ketamine voorraad 1:10 in steriel water. Verdoven elke muis 100 mg / kg ketamine door intraperitoneale injectie met een tuberculine spuit
- Zodra de muis volledig verdoofd, scheren de muis van de oren naar het midden terug met een fijn (Remington glad & zijdezacht) elektrische trimmer.
- In een witte pan zonder andere objecten buurt, breng de nymphal teken (dat haven B. burgdorferi) door een vochtige penseel de haarloze gebied van de muis. Als alternatief kunnen niet-geïnfecteerde teken op muizen worden geplaatst voor xenodiagnosis van muizen met verdachte infectie. Het gebruik van een schone, witte oppervlak teek plaatsing zorgt ervoor dat eventuele losse teken gemakkelijk kan worden gezien.
- Plaats de muis in gespecialiseerde kooien (Allentown Opsluiten in een kooi, Allentown, PA). De kooien bestaat uit een roestvrij stalen rooster verhoogd van de bodem van de kooi. Thij kooi top werd gewijzigd door onze in-house werkplaats om de fles water houder genoeg om vrije beweging van de muis aan de onderzijde zorgen verheffen. De pan wordt gevuld met ongeveer ½ cm water te vangen elk teken die vallen muizen (figuur 3A). Om het risico van onderkoeling te minimaliseren, herbruikbare verwarming pads, opgewarmd in de magnetron voor gebruik, worden onder de kooien geplaatst tot muizen wakker volledig uit narcose. Dieren zijn vaak ataxic als ze herstellen van anesthesie en wrijven tegen voedsel en water trays, dus deze moeten worden verwijderd. Het waterpeil laag genoeg is om ledematen van muizen voorkomen onderdompeling.
- Plaats de kooi in een lade die is bekleed met Tangle val plakken (Contech, Victoria, BC, Canada) en tape om de beknelling van geleedpotigen verzekeren. Muizen worden afzonderlijk gekooid en continu waargenomen tijdens de periode van de anesthesie.
- Binnen 2 uur, wanneer de muizen volledig wakker uit de narcose, het eten dienblad en fles water worden vervangen om de kooi. Na 24 uur, wordt de behuizing verrijking bestaat uit een plastic hut en Nylabone vervangen.
- Na 3, 4, en 5 dagen, controleert de muis, kooi en kooi water gevoede teken. De kooi water wordt gezeefd door een wit metalen pan (dwz "panning voor goud"). Spoel gevoede teken in schoon water en bewaar in plastic potten (Figuur 3B). Op dag 3 en 4, vervang water in kooi met schoon water. Op dag 5, controleert niet alleen de kooi, maar de muis grondig op teken. Meestal door dit punt alle teken hebben gevoed en de muizen kunnen worden teruggebracht naar normale kooien.
- Plaats alle afval van de muis kooien, met inbegrip van vloeistoffen, in biohazard containers voor autoclaaf en verwijdering. Houd een logboek bij van het aantal teken geplaatst op muizen en die hersteld te allen tijde.
3. Teken voeden op niet-humane primaten voor Infectie met B. burgdorferi of xenodiagnosis
- Bereid de teek insluiting apparaat: Snijd een ¾ inch cirkel 1 diameter in het 3 inch x3 inch LeFlap (flap) met een schone scalpel en de meting gids. Gebruik de cut-out als een sjabloon om cirkels van gelijke grootte snijden in de Biatane schuim en Duoderm. Het schuim wordt gebruikt flap verheffen boven het oppervlak van de huid en om mogelijke neerslaan van teek. De Duoderm voegt een andere laag van demping en overlays de randen van het opvangsysteem voor extra beveiliging van teek ontsnappen. Een diagram van het opvangsysteem is weergegeven in figuur 4.
- Veterinaire personeel zal het dier verdoven met 5-8 mg / kg Telazol door intramusculaire injectie.
- Knip de haren van het dier met behulp van een elektrische trimmer (Oster) uitgerust met maat 40 messen. Alle gebieden die zullen worden gedekt door de jas zijn geknipt: rug, voorzijde, bovenarmen. Met behulp van scheerschuim en dual-blade wegwerpscheerapparaten, nauw scheren een oppervlakte van ongeveer 25 cm x 20 cm verticaal horizontaal. Maak schoon met vochtig keukenpapier en föhnen met een lage warmte aan de huid uitdrogen.
- Plaats de klep op tHij dier dorsum, net onder het schouderblad aan weerszijden van de wervelkolom. Gebruik een markering aan om de cirkel op die plek op te sporen. Bereid de oppervlakte van de huid rond de cirkel schoon met SkinPrep. Dit verwijdert olie in de huid die de hechting van de lijm en de insluiting apparaten kunnen beïnvloeden. Waardoor ongeveer een 1 cm omtrek van de ruimte rond de cirkel, breng dan een laag van de huid lijm (SkinBond) met een breedte van ca. 4 cm.
- Verwijder de zelfklevende achterzijde van de Biatane schuim en aan te brengen op de huid op de juiste plek. Dieren worden opnieuw verdoofd door veterinaire personeel met 5 mg / kg Telazol. Dicht de randen met lijm huid en Hypafix tape. Verwijder de zelfklevende achterzijde van de flap op en brengen op de top van de Biatane. Plaats Hypafix tape rond de randen van de LeFlap, dan tape langs de maas flap van de klep en plaats de jas op het dier. Tape en Tangle Trap pasta wordt op de vloer in een perimeter rond de niet-menselijke primaat kooien voor extra veiligheid.
- Om de effecten van chemie te minimaliserenALS gebruikt in stap 3.4 op de pof voeden, worden de teken toegevoegd 24 uur na de insluiting apparaat is op zijn plaats. Op dit punt wordt de veiligheid van de inrichting ook gecontroleerd en, zo nodig. Typisch, 20 unfed nimfen (4-8 weken post-larvale molt) worden toegevoegd om de huid binnen het apparaat met behulp van een penseel.
- Verwijder de zelfklevende achterzijde van de mazen van de klep en sluit deze op zijn plaats. Ten slotte verwijdert u de Duoderm steun aan lijm bloot te leggen, en boven op de insluiting apparaat. Voeg een stuk Hypafix tape over de open mesh cirkel, en vervang de jas. De voltooide opvangsysteem is weergegeven in figuur 5A.
- Na 5 dagen, verdoven dieren zoals hierboven en de mantels verwijderd. Verwijder de tape eerste teek voeding inspecteren door de mazen (Figuur 5B). Schil de Duoderm voorzichtig van de flap.
- Trek het gaas gedeelte aan de randen om de toegang tot de teken verschaffen. Fed teken worden vaak gevonden in de buurt of onderhet schuim cirkel (figuur 5C) en worden verwijderd en in schoon water met een penseel. Verwijder het apparaat een keer alle zichtbare gevoede teken zijn verzameld (Figuur 5D).
Opmerking: Vaak, de insluiting apparaat kan eenvoudig worden verwijderd van de huid geschild. Als hechting is sterk en kan mogelijk schade aan de huid, wordt Unisolve oplosmiddel toegepast op het gebied van zachte verwijdering. De huid wordt afgeveegd met isopropanol en teken opgeslagen bij 23 ° C. Indien gebruikt voor infectie, kan het teken worden verpletterd om het nummer dat B. bevatte bevestigen burgdorferi. Indien gebruikt voor xenodiagnosis, worden de teken voor 1-3 weken bewaard vóór de analyse van de inhoud middendarm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na de voltooiing van capillaire voeden, worden de teken meestal rusten bij 23 ° C gedurende 2-3 weken voordat ze worden gevoed dieren transmissie. Met behulp van de capillaire geeft techniek, hebben we ontdekt dat meer dan 90% van de gevoede teken haven B. burgdorferi. Het percentage positieve teken wordt bepaald door wassen teken in peroxide en ethanol, dan breken ze in steriele PBS met een microfugebuis-vormige stamper. De inhoud midgut weglekt in PBS zijn bevestigd op objectglaasjes en gekleurd met een anti-Borrelia species antilichaam dat FITC-geconjugeerd. Vertegenwoordiger teek middendarm uitstrijkjes bekeken door fluorescentie microscopie zijn afgebeeld in figuur 2B-C
Muis infecties met lage doorgang stam B31 wild type B. burgdorferi zijn bijna 100%. Een combinatie van serologie en de cultuur van B. burgdorferi van muizen weefsels wordt bepaald of elke muis geïnfecteerd is geworden. Een western blot showing serumantistofresponsen van muizen geïnfecteerd met B. burgdorferi door teek in figuur 3C. Deze techniek is gebruikt om de overdraagbaarheid en infectiviteit van B. onderzocht burgdorferi mutante stammen 37-39.
We hebben teek voeden gebruikt op niet-menselijke primaten voor infectie en voor xenodiagnosis. Er zijn inspanningen gedaan om teek voeding en herstel van volledig gevoed teken verbeteren door het implementeren van de flap insluiting apparaat. De flap product wordt gebruikt voor de toepassing van medicinale maden in mensen, maar we hebben het voor teek voeden op primaten gewijzigd. In eerdere studies hebben we gebruik gemaakt van een harde capsule voor teek insluiting 27,28,45,46 en behaalde een gemiddelde voeding tarief (# gevoed teken / # tikken toegevoegd aan capsules) van 35,2%, variërend van 23,5-52,5%. In infectie studies, de tarieven van de transmissie (# besmette dieren / # aangevreten) gemiddeld 86.5%. In meer recente experimenten, hebben de voeding tarieven gebruik LeFlap tussen geweest 50-90%. In zeldzame gevallen, met behulp van de vorige methode, teken hebben kroop onder de capsule en in het plakband, waar ze uitdrogen en sterven. Met behulp van de flap de verbeterde voeding en meerdere lagen van de lijm de teken bevatte gehouden.
Naast directe fluorescente kleuring van teken midgut preparaat (figuur 2B-C), kunnen gevoeliger methoden worden gebruikt voor het detecteren B. burgdorferi binnen tikken. Moleculaire detectie kan, en is gebruikt voor het detecteren B. burgdorferi-specifieke DNA 42,50,51 met standaard of kwantitatieve PCR. Gemeenschappelijke doelstellingen voor detectie zijn de flab 46,50, OspC 46 en OspA 42,51 genen. De levensvatbaarheid van teruggewonnen spirocheten heeft ook door de cultuur van middendarm voorbereidingen zijn onderzocht en voeden xenodiagnostic teken op naïeve muizen 42.
iles/ftp_upload/50617/50617fig1.jpg "/>
Figuur 1. Voeren teken on Animals voor de overdracht van Borrelia burgdorferi. Algemeen schema van de bij voedertechnieken teken op dieren voor de ziekte van Lyme studies. Teken zijn capillaire gevoed culturen van B. burgdorferi en kan worden gevoed bij diermodellen van de ziekte van Lyme, zoals muizen en niet-menselijke primaten (resusapen). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. De capillaire sondevoeding methode en resultaten. A) Het apparaat wordt gebruikt om teken te voeden in getoond, met een vergrote weergave van de teek en capillaire buisje aan de rechterkant. BC) representatieve beelden van de midguts van teken gevoed B. burgdorferi. De middendarm smears werden gekleurd met anti-Borrelia species-FITC polyklonale antilichamen (Kirkegaard & Perry Labs) en bekeken onder fluorescentiemicroscoop.
Figuur 3. Ixodes scapularis teek voeden op laboratorium muizen. A) De gespecialiseerde kooien voor muizen wanneer gebruikt voor teek voeding. De draad verdieping is boven een pan met water verheven tot teken te verzamelen. Een verdoofde muis wordt weergegeven in de afbeelding aan de rechterkant. B) De opslag containers gebruikt voor teken. C) Vertegenwoordiger immunoblots van tick-geïnfecteerde muizen. Serum van dag 21 na de infectie werd gebruikt om vlekken met B. sonde burgdorferi OspC lysaten en recombinant eiwit, een immunodominant antigeen.
Figuur 4. Schematische weergave van de teek insluiting apparaat dat wordt gebruikt om voer op teken resusapen. De eerste laag bestaat uit Biatane schuim. De klep is bovenaan de pakking geplaatst en Duoderm is de derde laag. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 5. Ixodes scapularis tik-voeding op resusapen. A) De volledige insluiting apparaat. B, C) Views van teken voeden door het apparaat, en na verwijdering van de flap. D) De site van de teek voeden na volledige verwijdering van de apparaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor het verkrijgen teken die haven B. burgdorferi voor downstream studies, kan het teken zijn: (1) gevoed geïnfecteerde muizen op het larvale stadium; (2) ondergedompeld in B. burgdorferi culturen op een van beide het larvale of nimfenstadium 48, (3) gemicroinjecteerd met B. burgdorferi 47, of (4) capillair-gevoed B. burgdorferi 49. Hoewel elk van deze werkwijzen heeft zijn doel te garanderen dat een groot deel van het teken moet worden gebruikt voor infectie haven B. burgdorferi, geven wij de voorkeur capillaire sondevoeding. Wanneer inoculatie met bekende hoeveelheden spirocheten niet vereist is, kan de capillaire voedingswijze minder gemakkelijk tot de teken schade. Dit is van belang indien zij worden gevoed dieren. Deze methode kan ook worden aangewezen als de onderzoekers testen mutanten voor overdraagbaarheid / infectiviteit. Het is belangrijk dat de groei in kweek herkennen kan resulteren in plasmide verliezen 52, zodat het gebruik vanlage passage B. burgdorferi essentieel. Ook, het medium en de dichtheid van spirocheten is kunstmatig bij introductie, zodat de teken mag niet onmiddellijk worden gebruikt post-capillaire voeden. In plaats daarvan wordt een periode van niet minder dan 2 weken toegestaan voor de spirocheten aan te passen aan de teek micromilieu voor gebruik in experimenten.
Bij het voederen teken op muizen, is het niet nodig de muizen vooraf scheren. In een eerdere studie (ongepubliceerd) waarin we geprobeerd de effecten van teek speeksel op de huid onderzocht, scheren noodzakelijk. Daarbij, en contra intuïtief, ontdekten we dat de teken: a) gemakkelijk hechten aan haarloze huid, b) hebben een hoge voeding tarief, en c) zijn goed zichtbaar. De voeding variëren afhankelijk van of larven of nimfen worden gebruikt, maar zijn consistent boven de 50% bij nimfen worden gebruikt. Als zodanig, vóór het voeren scheren muizen is gemeengoed geworden in ons laboratorium, niet alleen voor experimenten, maar ook voor de voortplanting van de kolonie. Eerder, in onze afdeling op de Tulane National Primate Research Center, 34 apen zijn op door 770 Ixodes nimfen gevoed in 5 verschillende studies. Tick voeding tarieven (# fed / # toegevoegd aan capsules) gemiddeld 35,2%, variërend van 23,5-52,5%. In infectie studies, de tarieven van de transmissie gemiddeld 86.5%. In een recente pilot studie (niet gepubliceerd), vink voeden varieerde 5-75% en geen weerstand tegen verdere feeding was duidelijk. Echter, de slagingspercentages tussen de pogingen 2 en 3 aanzienlijk gevarieerd, waar het voederen prijzen waren veel hoger voor de 3 e poging dan voor de 2 e. De "poging 2" teken werden ondergebracht bij omgevingstemperatuur langer dan de "poging 3" ticks. De belangrijkste factor die we hebben gevonden dat teek voeding van invloed is de teek leeftijd en milieu pre-experiment. Die bij 4 ° C na de vervelling bewaard tot kort voor het algemeen gebruik te voeden beter. Als zodanig, raden we voortdurend uitdragen van teken, ze op te slaan OVERWEGENDy en met twee afzonderlijke percelen van teken beschikbaar bij het uitvoeren van het voeden op dieren.
In onze meest recente studie (niet gepubliceerd) vergeleken we voeden teken op makaken met behulp van de harde capsule te voeden met de klep apparaat. Tien apen werden gevoed na een keer met capsules en tweemaal met LeFlap. In deze reeks experimenten, we geobserveerd en gemiddelde voeding van 17% (range 5-25%) met capsules en een gemiddeld tarief van 54,75% (range 35-90%) met de klep. We vermoeden dat de ruimere oppervlakte voor teek voeding en het verminderde gebruik van agressieve lijmen verbetert voeding. Gebruik van de klep insluiting kan ook de onderzoekers om ofwel laat teken langer voeden of voeg meer teken, omdat de teek kan worden verwijderd zonder verwijdering van de gehele inrichting. Ten slotte, hoewel de lijm lichte huidirritatie veroorzaken bij sommige dieren (die een invloed op of cutane immuunresponsen induceren) de flap apparaat zelf kan beperkte of geen ongemak voor de dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen Nicole Hasenkampf en Amanda Tardo bedanken voor de technische ondersteuning. We danken ook Drs. Linden Hu en Adriana Marques voor aanbeveling van de LeFlap insluiting apparaat, en Dr Lise Gern voor instructie op de capillaire voedingswijze. Dit werk werd ondersteund door NIH / NCRR Grant 8 P20 GM103458-09 (MEE) en door het National Center for Research Resources en het Office of Research Infrastructure Programs (OriP) van de National Institutes of Health door subsidie P51OD011104/P51RR000164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| BSK-H | Sigma | B-8291 | |
| Ketamine HCl | |||
| Tangle Trap coating Paste | Ladd research | T-131 | |
| SkinPrep | Allegro Medical Supplies | 177364 | |
| LeFlap, 3" x 3" | Monarch Labs | ||
| Hypafix tape | Allegro Medical Supplies | 191523 | |
| SkinBond | Allegro Medical Supplies | 554536 | |
| UniSolve | Allegro Medical Supplies | 176640 | |
| Biatane Foam, adhesive 4"x4" | Coloplast | 3420 | |
| DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border | Convatec | 187971 | |
| Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom | Lomir Biomedical Inc. | ||
| EQUIPMENT | |||
| Pipet puller | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Dark field microscope | Leitz Wetzlar | Dialux | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom 2000 | |
| Mouse caging | Allentown caging | ||
References
- Porcella, S. F., Schwan, T. G. Borrelia burgdorferi and Treponema pallidum: a comparison of functional genomics, environmental adaptations, and pathogenic mechanisms. Journal of Clinical Investigation. 107, 651-656 (2001).
- Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390, 580-586 (1997).
- Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: the twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35, 490-516 (2000).
- Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection & Immunity. 67, 3181-3187 (1999).
- Gilmore, R. D., Mbow, M. L., Stevenson, B. Analysis of Borrelia burgdorferi gene expression during life cycle phases of the tick vector Ixodes scapularis. Microbes & Infection. 3, 799-808 (2001).
- Ramamoorthy, R., Philipp, M. T. Differential expression of Borrelia burgdorferi proteins during growth in vitro. Infection & Immunity. 66, 5119-5124 (1998).
- Ramamoorthy, R., Scholl-Meeker, D. Borrelia burgdorferi proteins whose expression is similarly affected by culture temperature and pH. Infection & Immunity. 69, 2739-2742 (2001).
- Schwan, T. G., Piesman, J. Temporal Changes in Outer Surface Proteins A and C of the Lyme Disease-Associated Spirochete, Borrelia burgdorferi, during the Chain of Infection in Ticks and Mice. J. Clin. Microbiol. 38, 382-388 (2000).
- Barthold, S. W., de Souza, M. S., Janotka, J. L., Smith, A. L., Persing, D. H. Chronic Lyme borreliosis in the laboratory mouse. Am. J. Pathol. 143, 959-971 (1993).
- Barthold, S. W., de Souza, M. Exacerbation of Lyme arthritis in beige mice. Journal of Infectious Diseases. 172, 778-784 (1995).
- Barthold, S. W., Feng, S., Bockenstedt, L. K., Fikrig, E., Feen, K. Protective and arthritis-resolving activity in sera of mice infected with Borrelia burgdorferi. Clin. Infect. Dis. 25, Suppl 1. S9-S17 (1997).
- Miller, J. C., Ma, Y., Crandall, H., Wang, X., Weis, J. J. Gene expression profiling provides insights into the pathways involved in inflammatory arthritis development: Murine model of Lyme disease. Experimental and Molecular Pathology. 85, 20-27 (2008).
- Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13865-13870 (2000).
- Grimm, D., et al. Outer-surface protein C of the Lyme disease spirochete: a protein induced in ticks for infection of mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 3142-3147 (2004).
- Zhang, J. R., Norris, S. J. Kinetics and in vivo induction of genetic variation of vlsE in Borrelia burgdorferi. Infection & Immunity. 66 (1), 3689-3697 (1999).
- Hodzic, E., Feng, S., Freet, K. J., Borjesson, D. L., Barthold, S. W. Borrelia burgdorferi population kinetics and selected gene expression at the host-vector interface. Infection & Immunity. 70, 3382-3388 (2002).
- Hodzic, E., Feng, S., Freet, K. J., Barthold, S. W. Borrelia burgdorferi population dynamics and prototype gene expression during infection of immunocompetent and immunodeficient mice. Infection & Immunity. 71, 5042-5055 (2003).
- Liang, F. T., Nelson, F. K., Fikrig, E. Molecular adaptation of Borrelia burgdorferi in the murine host. Journal of Experimental Medicine. 196, 275-280 (2002).
- Samuels, D. S.
- Gilmore, R. D., et al. The bba64 gene of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease agent, is critical for mammalian infection via tick bite transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 7515-7520 (2010).
- Fisher, M. A., et al. Borrelia burgdorferi σ54 is required for mammalian infection and vector transmission but not for tick colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5162-5167 (2005).
- Barthold, S. W. Animal models for Lyme disease. Laboratory Investigation. 72, 127-130 (1995).
- Pachner, A. R. Early disseminated Lyme disease: Lyme meningitis. American Journal of Medicine. 98, 30S-37S (1995).
- Barthold, S. W., Beck, D. S., Hansen, G. M., Terwilliger, G. A., Moody, K. D. Lyme Borreliosis in Selected Strains and Ages of Laboratory Mice. Journal of Infectious Diseases. 162, 133-138 (1990).
- Philipp, M. T., Johnson, B. J. Animal models of Lyme disease: pathogenesis and immunoprophylaxis. Trends in Microbiology. 2, 431-437 (1994).
- Roberts, E. D., et al. Pathogenesis of Lyme neuroborreliosis in the rhesus monkey: the early disseminated and chronic phases of disease in the peripheral nervous system. Journal of Infectious Diseases. 178, 722-732 (1998).
- Roberts, E. D., et al. Chronic lyme disease in the rhesus monkey. Laboratory Investigation. 72, 146-160 (1995).
- Philipp, M. T., et al. Early and early disseminated phases of Lyme disease in the rhesus monkey: a model for infection in humans. Infection & Immunity. 61, 3047-3059 (1993).
- Steere, A. C., Sikand, V. K. The Presenting Manifestations of Lyme Disease and the Outcomes of Treatment. N. Engl. J. Med. 348, T. reatment.N. .E. ngl.J. .M. ed. 348, 2472-2474 (2003).
- Pachner, A. R., Delaney, E., O'Neill, T., Major, E. Inoculation of nonhuman primates with the N40 strain of Borrelia burgdorferi leads to a model of Lyme neuroborreliosis faithful to the human disease. Neurology. 45, 165-172 (1995).
- Cadavid, D., O'Neill, T., Schaefer, H., Pachner, A. R. Localization of Borrelia burgdorferi in the nervous system and other organs in a nonhuman primate model of lyme disease. Laboratory Investigation. 80, 1043-1054 (2000).
- Mather, T. N., Wilson, M. L., Moore, S. I., Ribiero, J. M. C., Spielman, A. Comparing the Relative Potential of Rodents as Reservoirs of the Lyme Disease Spirochete (Borrelia Burgdorferi). American Journal of Epidemiology. 130, 143-150 (1989).
- Mather, T. N., Telford, S. R. Iii, Moore, S. I., Spielman, A. Borrelia burgdorferi and Babesia microti: Efficiency of transmission from reservoirs to vector ticks (Ixodes dammini). Experimental Parasitology. 70 (90), 55-61 (1990).
- Telford, S. R., Mather, T. N. 3rd, Adler, G. H., Spielman, A. Short-tailed shrews as reservoirs of the agents of Lyme disease and human babesiosis. Journal of Parasitology. 76, 681-683 (1990).
- Mather, T. N., Fish, D., Coughlin, R. T. Competence of dogs as reservoirs for Lyme disease spirochetes (Borrelia burgdorferi). J. Am. Vet. Med. Assoc. 205, 186-188 (1994).
- Telford, S. R., Mather, T. N. 3rd, Moore, S. I., Wilson, M. L., Spielman, A. Incompetence of deer as reservoirs of the Lyme disease spirochete. Am. J. Trop. Med. Hyg. 39, 105-109 (1988).
- Lin, T., et al. Analysis of an Ordered, Comprehensive STM Mutant Library in Infectious Borrelia burgdorferi: Insights into the Genes Required for Mouse Infectivity. PLoS ONE. 7, e47532 (2012).
- Lin, T., et al. Central Role of the Holliday Junction Helicase RuvAB in vlsE Recombination and Infectivity of Borrelia burgdorferi. PLoS Pathog. 5, e1000679 (2009).
- Jacobs, M. B., Norris, S. J., Phillippi-Falkenstein, K. M., Philipp, M. T. Infectivity of the Highly Transformable BBE02- lp56- Mutant of Borrelia burgdorferi, the Lyme Disease Spirochete, via Ticks. Infection and Immunity. 74, 3678-3681 (2006).
- Jacobs, M. B., Purcell, J. E., Philipp, M. T. Ixodes scapularis ticks (Acari: Ixodidae) from Louisiana are competent to transmit Borrelia burgdorferi, the agent of Lyme borreliosis. J. Med. Entomol. 40, 964-967 (2003).
- Bockenstedt, L., Mao, J., Hodzic, E., Barthold, S., Fish, D. Detection of Attenuated, Noninfectious Spirochetes in Borrelia burgdorferi-Infected Mice after Antibiotic Treatment. The Journal of Infectious Diseases. 186, 1430-1437 (2002).
- Barthold, S. W., et al. Ineffectiveness of tigecycline against persistent Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 54, 643-651 (2010).
- de Silva, A. M., Telford, S. R., Brunet, L. R. 3rd, Barthold, S. W., Fikrig, E. Borrelia burgdorferi OspA is an arthropod-specific transmission-blocking Lyme disease vaccine. Journal of Experimental Medicine. 183, 271-275 (1996).
- Fikrig, E., et al. Vaccination against Lyme disease caused by diverse Borrelia burgdorferi. Journal of Experimental Medicine. 181, 215-221 (1995).
- Philipp, M. T., et al. The outer surface protein A (OspA) vaccine against Lyme disease: efficacy in the rhesus monkey. Vaccine. 15, 1872-1887 (1997).
- Embers, M. E., et al. Persistence of Borrelia burgdorferi in Rhesus Macaques following Antibiotic Treatment of Disseminated Infection. PLoS ONE. 7, e29914 (2012).
- Kariu, T., Coleman, A. S., Anderson, J. F., Pal, U. Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut. J. Vis. Exp. , e2544 (2011).
- Policastro, P. F., Schwan, T. G. Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi. J. Med. Entomol. 40, 364-370 (2003).
- Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., de Silva, A. M. Glass Capillary Tube Feeding: A Method for Infecting Nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with The Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Medical Entomology. 39, 285-292 (2002).
- Hodzic, E., Feng, S., Holden, K., Freet, K. J., Barthold, S. W. Persistence of Borrelia burgdorferi following antibiotic treatment in mice. Antimicrob Agents Chemother. 52, 1728-1736 (2008).
- Bockenstedt, L. K., Mao, J., Hodzic, E., Barthold, S. W., Fish, D. Detection of attenuated, noninfectious spirochetes in Borrelia burgdorferi-infected mice after antibiotic treatment. Journal of Infectious Diseases. 186, 1430-1437 (2002).
- Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56, 1831-1836 (1988).
