Summary
Des techniques de microscopie et de traitement d’image de time-lapse ont été employées pour observer et analyser le compactage fibroblaste-négocié de gel et le réalignement de fibre de fibrine dans un bioréacteur commandé par l’environnement sur une période de 48 heures.
Abstract
Les cellules incorporées dans les gels de collagène et de fibrine se fixent et exercent des forces de traction sur les fibres du gel. Ces forces peuvent conduire à une réorganisation locale et mondiale et à un réalignement de la microstructure du gel. Ce processus se déroule d’une manière complexe qui dépend en partie de l’interaction entre l’emplacement des cellules, la géométrie du gel et les contraintes mécaniques sur le gel. Pour mieux comprendre comment ces variables produisent des modèles globaux d’alignement des fibres, nous utilisons la microscopie de contraste différentiel d’interférence (DIC) time-lapse couplée à un bioréacteur contrôlé par l’environnement pour observer le processus de compactage entre les explants géométriquement espacés (amas de fibroblastes). Les images sont ensuite analysées avec un algorithme de traitement d’image personnalisé pour obtenir des cartes de la souche. Les informations obtenues à partir de cette technique peuvent être utilisées pour sonder la mécanobiologie de diverses interactions cellule-matrice, ce qui a des implications importantes pour comprendre les processus de cicatrisation des plaies, le développement de maladies et les applications d’ingénierie tissulaire.
Introduction
Un outil important pour étudier les interactions cellule-matrice est le gel de collagène peuplé de cellules1,2. Le gel fournit un environnement 3D plus proche du caractère in vivo du tissu et mieux adapté à la compréhension du comportement cellulaire que ne le proposent les cultures 2D traditionnelles3. Les premières études dans lesquelles les fibroblastes ont été distribués de manière homogène dans un gel de collagène ont révélé que les cellules consolident rapidement les fibres de collagène et compactent le gel4,5. Les fibroblastes contractiles en gels flottants passent alors à un état de repos peu après que le gel a complètement atteint le compactage1,6,7. Les fibroblastes en gels qui sont contraints aux limites restent dans un état actif et synthétique8 et ils génèrent un alignement des fibres d’une manière dépendante de la géométrie du gel et des contraintes externes5,9. Les différences dans l’activité cellulaire semblent être le résultat de la tension interne (ou de l’absence de tension interne) qui se développe à mesure que les cellules exercent des forces de traction via des intégrines sur les fibres de collagène dans le gel.
Une variante de cette technique consiste à placer des explants de fibroblastes(c’est-à-dire des amas de cellules) à une distance l’un de l’autre au sein d’un gel de collagène et à observer les interactions cellule-matrice et le développement progressif de l’alignement des fibres entre les explants (parfois appelés sangles en forme de ligament)10-12. Le principal avantage du système explant est qu’il permet d’organiser les cellules en motifs géométriques simples, ce qui facilite la visualisation et le sondage des mécanismes sous-jacents au réalignement cellulaire des fibres. Ces modèles d’alignement — qui dépendent principalement de l’interaction entre les forces de traction cellulaire, la distribution spatiale cellulaire, la géométrie du gel et les contraintes mécaniques sur le gel — sont importants à comprendre car ils jouent un rôle central dans l’organisation tissulaire globale, la fonction mécanique et l’environnement mécanique local13.
Dans le domaine de l’ingénierie tissulaire, une stratégie pour produire des tissus mécaniquement fonctionnels et modifiés consiste à contrôler le modèle d’alignement des fibres qui se développe à partir du compactage cellulaire afin que le tissu modifié possède un alignement des fibres qui imite celui du tissu natif14,15. Un tel alignement est considéré nécessaire pour que les tissus modifiés reproduisent le comportement mécanique complexe des tissus natifs. Une modification de cette stratégie consiste à remplacer le gel de collagène par un gel de fibrine16. Le gel de fibrine développe un modèle d’alignement similaire à celui d’un gel de collagène pendant le compactage. Au fil du temps la fibrine est dégradée et remplacée par l’ECM cellule-synthétisé qui suit le modèle initial d’alignement de fibre de fibrine. La construction d’ingénierie résultante a considérablement amélioré les propriétés mécaniques par rapport aux constructions dérivées de gel de collagène17.
Le processus d’alignement et les événements de remodelage ultérieurs dans les gels de fibrine se déroulent d’une manière compliquée et mal comprise. Pour mieux caractériser ces interactions et leur effet sur le comportement cellulaire et le remodelage ECM, nous avons développé une procédure basée sur la méthode explant. Dans cette méthode, les explants de fibroblastes sont positionnés sur un gel de fibrine dans différents motifs géométriques. Les gels sont maintenus dans un bioréacteur18contrôlé par l’environnement et monté au microscope, et le processus de compactage et de réalignement des fibres est surveillé avec une microscopie à contraste d’interférence différentiel (DIC) en accéléré. Les champs de déplacement sont quantifiés à l’avec des algorithmes personnalisés. Les données obtenues à partir de ces expériences ont des implications variées pour un certain nombre de processus, y compris l’optimisation des stratégies d’ingénierie tissulaire, l’amélioration de la cicatrisation des plaies et le traitement du remodelage pathologique des tissus.
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Protocol
1. Préparation du pochoir
Préparer un pochoir sur Parafilm pour mettre en page l’emplacement de chaque explant, en suivant la géométrie souhaitée(figures 1A et 1B). Espace chaque explant à environ 1-2 mm l’un de l’autre. Cette distance correspond à un espacement idéal pour générer l’alignement des fibres entre les explants. Fixez le pochoir sous la zone du verre de couverture où l’échantillon sera préparé avec du ruban adhésif.
2. Stérilisation
Nettoyez soigneusement tous les composants du bioréacteur à l’aide d’éthanol à 70% et stérilisez pendant 2-3 heures sous lumière UV avant l’expérimentation. Si un récipient alternatif est utilisé à la place d’un bioréacteur, des techniques de stérilisation appropriées doivent être utilisées. Voir l’étape 4.12 pour des commentaires sur l’utilisation d’une boîte de Pétri à fond de verre.
3. Préparation de gel de fibrine
Une fois que les composants du bioréacteur ont été stérilisés, jetez une fine couche de gel de fibrine sur la surface du verre de couverture. Les détails pour la préparation de solutions de stock de fibrinogène et de thrombine pour la fabrication de gels de fibrine de 6,6 mg /ml sont décrits dans Sander et al. 13 Un protocole similaire par Ye et al. 19 pour la fabrication de gels de fibrine de 3,3 mg / ml peuvent également être consultés sur le site Web de JoVE.
- Préparer une solution de microbilles fluorescentes dans du DMEM à une concentration de 10 millions de billes/ml. Les perles seront utilisées pour aider à suivre les déplacements de gel. Pour atteindre cette concentration, combiner 0,017 ml de solution mère de microbilles et 0,149 ml de DMEM dans un tube de microcentrifugation.
- Soniquez cette suspension pendant 10 min pour disperser les perles et homogénéiser la solution.
- Solution de fibrine — Dans un tube en C de 15 ml, mélanger 0,22 ml de solution mère de fibrinogène avec 0,44 ml de tampon HEPES de 20 mM. Ajouter les 0,1667 ml de DMEM avec les microbilles créées à l’étape 3.1.
- Solution de thrombine — Dans un tube c séparé de 15 ml, mélanger ensemble 0,0328 ml de solution mère de thrombine, 0,131 ml de tampon HEPES de 20 mM et 0,00246 ml de 2 MCaCl2.
- Mélanger soigneusement la solution de thrombine (étape 3.4) avec la solution de fibrinogène (étape 3.3) en piper de haut en bas 5-10x jusqu’à ce que la solution soit uniformément distribuée. Évitez d’introduire des bulles autant que possible. Pour réduire la quantité de bulles produites, veillez à ne pas décharger complètement la pipette pendant le mélange.
- L’ajout de thrombine entraînera le gel rapide de la solution (~ 30 sec). Pipeter la solution mélangée sur le verre de couverture dès que possible. Laisser le gel polymériser à TA.
- Scellez le bioréacteur, insérez les blocs chauffants et connectez les thermocouples au régulateur de température. Incuber le gel à 37 °C pendant 15-30 min.
4. Préparation de l’explantation cellulaire
- Retirer le milieu du ballon T-75 contenant les cellules fibroblastiques dermiques humaines.
- Rincez soigneusement la surface avec environ 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les protéines sériques. Ajouter 1 ml de trypsine-EDTA et incuber pendant 3 min, ou jusqu’à ce que les cellules se soient levées.
- Une fois les cellules levées, faites tourner la suspension dans une centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et ressusciter le culot dans un volume de DMEM qui permettra une concentration finale de 20 millions de cellules/ml.
- Pendant que les cellules tournent dans la centrifugeuse, déconnectez le bioréacteur des blocs chauffants et des thermocouples. Transférer le bioréacteur dans une armoire de biosécurité et retirer soigneusement le couvercle en suivant les techniques asceptiques.
- Créez des explants en pipeté 0,3 μl de la suspension cellulaire sur le gel de fibrine polymérisé, en suivant le motif sur le pochoir. Chaque explant doit contenir environ 6 000 cellules. Assurez-vous que des pointes de micropipette à faible volume sont utilisées (0,1 à 10 μl).
- Laisser les cellules se déposer et se fixer à la matrice de fibrine pendant 1 h à 37 °C.
- Avec le bioréacteur encore ouvert, ajoutez approximativement 5 ml de DMEM complété avec 10% de sérum bovin foetal (FBS), 1% de pénicilline-streptomycine, 0,1% d’amphotéricine B, et 10 mg/ml d’aprotinin directement dans la chambre de bioréacteur. Le DMEM est tamponné au bicarbonate et nécessite 5% de CO2 pour maintenir un pH neutre. Étant donné que le bioréacteur n’est pas alimenté enCO2,conditionner le milieu dans un incubateur avec 5% deCO2 pendant 2-3 heures avant utilisation. L’aprotinine est un inhibiteur de la sérine protéase qui est largement utilisé pour réduire le taux de dégradation de la fibrine20.
- Refermez le bioréacteur. Utilisez une seringue pour administrer 5 ml supplémentaires de milieu conditionné auCO2 par l’intermédiaire de l’ajustement barbelé sur l’orifice d’entrée. Distribuez le milieu lentement et assurez-vous que tout le volume de la chambre du bioréacteur est rempli. Retirez soigneusement les bulles qui se forment dans le bioréacteur.
- Fournir un milieu frais conditionné à 5 % de CO2 au bioréacteur tout au long de l’expérience afin de maintenir le pH, de fournir des nutriments et d’éliminer les déchets. Installer une pompe à seringue avec une seringue de 10 ml ou 30 ml remplie de milieu conditionné à 5% deCO2. Connectez la seringue directement à l’orifice d’entrée sur le couvercle du bioréacteur avec un tube stérile équipé de Luer-lock. Retirez le raccord mâle et fixez le tube au raccord barbelé du bioréacteur (voir la figure 1C).
- Réglez le taux de perfusion à 0,01 ml/min. Connectez des morceaux de tubes modifiés aux deux orifices de sortie et placez les extrémités dans un bécher de 100 ml pour collecter les déchets.
- Utilisez un cric de laboratoire pour régler les hauteurs des alimentations d’entrée et de sortie afin qu’une différence de pression ne se développe pas dans le bioréacteur (consulter la figure 1D pour référence).
- Si un bioréacteur n’est pas disponible, préparez les échantillons dans des boîtes de Petri à fond de verre de 35 mm avec des plateaux en verre. Utilisez-en un avec une taille de lamelle de couverture optimisée pour l’ensemble spécifique d’objectifs à utiliser. Les échantillons préparés dans des boîtes de Pétri doivent être conservés dans un incubateur à 37 °C et 5 % deCO2.
Remarque : Le polystyrène dépolarise la lumière et interfère avec l’imagerie DIC, de sorte que des plateaux en verre doivent être utilisés si l’imagerie DIC est effectuée. Le contraste de phase est une modalité alternative appropriée d’imagerie. Le transfert de plats entre l’incubateur et le microscope rendra l’enregistrement des images difficile. Si les images ne sont pas correctement enregistrées, la souche calculée à la section 6 ne sera pas exacte.
5. Imagerie time-lapse
- Une fois l’échantillon préparé, refermer le bioréacteur, reconnecter les blocs chauffants et les thermocouples et régler la température du bioréacteur à 37 °C.
- Réglez le bioréacteur sur l’étage motorisé monté au microscope. Placez l’objectif DIC 20X sous le view-port. Un objectif de grossissement inférieur est acceptable, en particulier si un étage motorisé de précision n’est pas disponible. Assurez-vous que le polariseur, l’analyseur et le prisme sont tous en place. Alternativement, les échantillons peuvent également être es imageés à l’aide du contraste de phase.
- Ouvrez le logiciel d’imagerie.
- Concentrez l’objectif sur la zone entre les trois explants.
- Enregistrez les coordonnées (x, y et z) de cet emplacement dans le logiciel d’imagerie.
- Afin d’imager toute la zone entre et autour des explants, sélectionnez l’option d’acquérir une grande image et spécifiez la taille de la zone. Cela permettra l’acquisition de plusieurs images autour de la zone spécifiée et créera une image en mosaïque qui représente une plus grande région de l’exemple.
- Réglez le temps d’exposition et l’intensité lumineuse sur les valeurs les plus basses possibles pour éviter la mort cellulaire causée par la phototoxicité, tout en fournissant une résolution suffisante pour distinguer les cellules, les microbilles et les fibres de fibrine.
6. Suivi des souches
Pour plus de détails et d’instructions sur le logiciel de suivi des souches(figure 2),voir Raghupathy et coll. 21 L’algorithme est un code MATLAB personnalisé qui peut être téléchargé à partir de http://www.license.umn.edu/default.aspx. Notez que les images DIC ont souvent suffisamment de texture pour le suivi des déformations. Les microbilles sont incluses pour servir de contrôle sur les champs de déformation calculés. Si le suivi des souches est effectué, il est essentiel que les images obtenues soient prises exactement au même endroit afin que les images soient enregistrées. Les images non enregistrées promemeront de fausses souches.
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Representative Results
Le remodelage tissulaire est un processus complexe qui est entraîné en partie par des interactions physiques réciproques entre les cellules et la matrice environnante. Les cellules réorganisent les fibres environnantes et génèrent une tension dans le réseau de fibres. L’alignement des fibres et de l’environnement mécanique contrôle à son tour le comportement des cellules, de sorte que les cellules et la matrice se réorganisent globalement pour produire des tissus remodelés. Dans cette expérience, les cellules des explants, initialement rondes dans la morphologie, ont commencé à s’étendre dans le gel et à adhérer aux fibres de fibrine (Figure 3). Les cellules ont exercé les forces de traction qui se sont propagées par le gel et ont induit l’alignement de fibre parallèlement à l’axe entre les explants. En quelques heures, les « sangles » sont devenues visibles(figure 3A). Les mesures de déformation ont également indiqué que les plus grandes souches sont transversales à l’axe entre les explants(figures 3D et 3E). Les déformations sont les plus élevées dans cette région car les fibres de cette région sont libres de se traduire vers l’axe.
Ce protocole fournit un modèle simple pour l’étude du remodelage de matrice induit par les cellules et des effets de l’alignement des fibres sur le comportement des cellules. L’utilisation d’explants cellulaires permet de contrôler facilement la distribution spatiale des amas de cellules(c’est-à-dire d’explants). Les explants concentrent également les forces générées par les cellules afin que l’alignement des fibres soit rapidement généré dans une petite zone qui peut être facilement enténéfiée. Des images carrelées à haute résolution des explants et de la zone environnante sont ensuite utilisées pour quantifier la réorganisation de la matrice(figures 3B et 3C)en réponse aux variations des conditions expérimentales.
Figure 1. (A) Schéma d’une configuration triangulaire d’explant sur un gel de fibrine. (B) Un pochoir parafilm collé à la face inférieure du port de vue du bioréacteur peut être utilisé pour guider le placement explant. (C) Le bioréacteur assemblé est(D) placé sur l’étage motorisé de précision pour l’imagerie en accéléré. Une pompe à seringue fournit un milieu conditionné à un rythme constant. Un bécher recueille le milieu de sortie. Il est positionné à une hauteur appropriée pour minimiser les différences de pression dans le bioréacteur.
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Figure 2. Interface graphique de suivi des souches. Gauche: Une grille est créée sur la surface de l’image DIC qui sera analysée. Droite: L’algorithme, qui est basé sur la corrélation spatiale, recherche les déplacements de pixels entre les images qui entraînent la corrélation la plus élevée(c’est-à-dire le pic).
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Figure 3. Microscopie time-lapse et suivi de contrainte de la réorganisation de fibrine entre explants. (A) Le réalignement de fibre a été observé entre les explants en capturant des images carrelées utilisant un objectif 20X DIC. Des trames individuelles ont été extraites de l’image carrelée à (B) t = 0 heure et (C) t = 24 heures pour analyser la réorganisation de fibre dans le secteur entre les explants de cellules. D)Les courbes de niveau montrent la répartition de la déformation principale maximale dans la zone correspondant à la « sangle ».
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Discussion
Ce protocole a été développé dans le but d’observer et de quantifier la mécanique impliquée dans le remodelage de l’ECM à médiation cellulaire. De tels processus sous-tendent un certain nombre de phénomènes biologiques et ont des implications importantes pour l’ingénierie des tissus2,22, la réduction de la cicatrice1,23, et la compréhension du remodelage tissulaire pathologique12,24. L’utilisation de la microscopie DIC time-lapse permet de résoudre et de quantifier le déplacement et l’alignement des fibres de fibrine qui se produit à la suite des forces de traction cellulaire. La réorganisation observée ici est la première étape du processus de remodelage, et elle suit les modèles organisationnels observés dans le collagène11. La réorganisation est suivie d’une combinaison de dégradation de la fibrine et de synthèse d’ECM. Alors que la phase de réorganisation du remodelage se déroule sur quelques heures à quelques jours, l’étape de synthèse du processus de remodelage prend des semaines pour se dérouler13. Le système décrit ici est capable de fonctionner pendant des semaines, et il peut donc être adapté pour surveiller ces événements à un stade ultérieur.
Les modifications possibles de cette technique peuvent impliquer de varier l’emplacement, le nombre et la taille des explants pour créer différentes géométries et observer les différences dans les modèles d’alignement. Les explants peuvent également être incorporés dans le gel plutôt qu’à la surface en plaçant les explants entre les couches de fibrine. D’autres modifications peuvent impliquer l’utilisation d’autres gels formant des fibres au lieu de la fibrine, tels que le collagène, ou l’ajout d’autres protéines de matrice extracellulaire, telles que la fibronectine ou l’acide hyaluronique.
Quel que soit l’ensemble de variables expérimentales choisi, le succès de l’expérience dépend de manière critique de l’attachement cellulaire. Par conséquent, il est important que l’on utilise le microscope pour vérifier que les explants se sont attachés à la surface du gel avant d’ajouter du milieu de culture, car le cisaillement liquide peut éliminer les explants du gel de fibrine. Un autre défi que l’on pourrait rencontrer est de garder les cellules de l’explant ensemble lors de leur pipetage sur le gel. Si cela devient un problème, on peut modifier l’étape 4.4 de sorte que le culot cellulaire soit réintétré en quantités égales de DMEM et fraîchement mélangé 0,5 mg /ml de collagène reconstitué de type I. L’ajout d’une quantité diluée de collagène peut aider à garder les cellules de l’explant ensemble. Cette procédure peut être comparée à la méthode des matrices de collagène imbriquées développée par Grinnell et al.,où la migration cellulaire et les changements dans la microstructure du collagène peuvent également être étudiés en plaçant des gels de collagène peuplés de cellules dans des gels de collagène acellulaire25,26. L’obtention d’images ciblées tout au long de l’expérience est également très importante. Maintenir la mise au point peut être difficile parce que les explants se déplacent vers le bas que le gel compacte et diminue en épaisseur. En conséquence, un recentrage sera nécessaire tant que le gel se compactera. Enfin, les explants peuvent se détacher du gel au cours de l’expérience en raison d’une tension mécanique excessive27,d’une dégradation de la fibrine, ou d’une combinaison des deux. Si les fibres se déchirent en raison d’une tension mécanique, on peut essayer de réduire le nombre de cellules dans une explantation et d’augmenter la concentration de fibrine dans le gel. Nous avons observé des problèmes de détachement dus à la dégradation de la fibrine autour de l’explant qui disparaissent lorsque des inhibiteurs de la plasmine tels que l’aprotinine (comme utilisé ici) ou l’acide epsilon-aminocaproïque (ACA) sont inclus dans le milieu.
Nous avons choisi d’utiliser DIC comme modalité d’imagerie pour ces expériences parce que DIC permet d’imager les fibres et le processus d’alignement des fibres sur de longues périodes de temps d’une manière qui minimise les dommages cellulaires de l’exposition à la lumière(c’est-à-dire la phototoxicité). L’imagerie par contraste de phase peut également être utilisée, mais la résolution des fibres individuelles est inférieure à celle de la CID. Aucune de ces modalités de formation image, cependant, ne fournit des informations sur le réalignement de fibre se produisant hors du plan(c.-à-d. par l’épaisseur de l’échantillon) et ainsi l’interprétation des données devrait garder cette limitation à l’esprit. Ces informations peuvent être obtenues avec la microscopie confocale, à condition que les problèmes potentiels de phototoxicité soient résolus lors de la mise en place de l’expérience. Enfin, les images DIC contiennent un dégradé de contraste(c’est-à-dire un axe de cisaillement) qui affecte la visibilité des fibres d’une manière dépendante de l’angle. Par conséquent, certaines directions de fibre seront plus faciles à visualiser que d’autres.
Les applications futures de cette technique peuvent impliquer l’observation de l’effet des conditions aux limites, de la distance explant-à-explant, et de la géométrie du gel sur la réorganisation de fibre. Les techniques d’analyse d’image telles que l’algorithme de suivi des souches utilisé ici peuvent être utilisées pour quantifier comment chacun de ces facteurs contribue à la réorganisation du gel et au processus de remodelage. Par exemple, nous avons trouvé des différences quantifiables dans le champ de déformation des explants triangulaires avec des limites fixes et libres dans le plan28. Cette technique peut également aider à disséquer les voies mécanobiologiques impliquées dans la migration cellulaire et le remodelage des tissus, ainsi que la façon dont ces processus peuvent être modulés par divers produits biochimiques. Ces données peuvent également être utilisées comme intrants précieux pour le développement de modèles de calcul et pour l’évaluation de leurs capacités prédictives29.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions George Giudice et Steven Eliason d’avoir fait don de fibroblastes cutanés humains et Ramesh Raghupathy pour l’aide avec l’algorithme de suivi des souches. Le soutien à ce travail a été fourni par une bourse d’aide aux diplômés du département de l’Éducation des États-Unis dans les domaines de besoin national (GAANN P200A120071).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Molecular Probes | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Biotense Bioreactor | ADMET | ||
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | ||
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
References
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