Introduction
斑马鱼（ 斑马鱼）是一个小的硬骨鱼类物种原产于印度是一个有用的模式生物行为1和医学研究2,3。斑马鱼也常用于各种药理物质的检测，以表征其对行为的影响。不同剂量和给药时间表已经被用于研究斑马鱼的，如兴奋剂4，抗焦虑药5和乙醇6-8化合物给药后的行为。
我们的实验室已调查的充分验证的光/暗检测9,20，通常也被称为scototaxic测定不同乙醇给药时间表对斑马鱼焦虑和运动的影响。开发乙醇给药的新方法，以提高效率为重复，日常管理过的很长一段时间（21天）6 10-12相应的混合物。虽然这种方法是被广泛接受的，扣除斑马鱼可能增加的可变性中引入和从药液去除鱼所需要的时间。因此，精确的曝光于所关注的化合物可能会发生变化对涉及重复给药的实验过程。一种方法是减少错误的变性运输时间所产生的来源是这样希望的。用我们的方法，我们能够同时移动所有的鱼，导致鱼的每一个相同的给药时间。以下乙醇曝光（此处描述的），斑马鱼可以在任何numbe被测试- [R行为测定法，包括那些评估焦虑。使用新的方法给药鱼群体已经超越精确复制和学科之间和整个鱼类群体规范计量能力的实际用途。新软件的出现，允许多个鱼的跟踪立刻可以看到研究人员利用我们的方法，以确保在他们的实验中可复制性和准确性。考虑到广泛使用斑马鱼作为模式生物进行行为神经科学，这种方法会提高效率和实用性于未来的药理研究。
在本范例中，重复给药方案被采用，大约有反映人类饮用的时间表。鱼被随机分成3组：对照组，每天中度或每周-狂欢。给药方案是在持续21天，选择，因为它显著在以前的研究中超过7曝光时间。控制鱼获得零ALCOHOL，每天中度鱼获得0.2％的酒精每天一次，以及每周 - 狂欢的鱼，每周收到1.4％的酒精一次。亮/暗任务，使用后第2天停药的评估焦虑。这是一个相对简单的测试来管理其使用的矩形舞台，其中在一侧的壁是白色并且在另一侧是暗9。成年斑马鱼更喜欢稳健的控制条件6,9,13下舞台的黑暗的一面。增加焦虑操作性定义为显著更多的时间在黑暗中度过区，降低焦虑可以当鱼花比较多的时间在光区花假设。随着运动追踪软件，其他的信息变量也可以量化，包括平均速度，不动，蜿蜒和过渡区的14。
在我们实验室开发的给药方法可以应用到其中的水溶性化合物被施用到一个或多个zebrafi任何研究SH。许多其他药剂可从该方法中受益，目前正在斑马鱼试验。常用的测试化合物包括尼古丁，利眠宁，丁螺环酮，和东莨菪碱，它们溶解在一种类似的方式，以乙醇;通过混合化学适量的水中。因此，该过程的一般范围更广，而不是仅限于乙醇。另外，用药物为多天的给药后，光/暗任务只有一个的许多行为测试，可以被采用。给药后或抽出时，可使用的其他流行的测定包括新颖槽潜水试验15和社会行为的测试，例如变浅16。下面的过程将概述的重复传送的鱼或鱼个体的群体到含有目标化合物的药理学方案的有效方法。此外，测试焦虑与光照/黑暗试验过程在鱼谁在戒断暴露于醇施用长时间表后组进行说明。
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Protocol
所有的程序和行为测试正在协议号12年6月11日，这是符合加拿大理事会的管理和使用实验动物的动物护理的指导方针批准MacEwan大学的动物研究伦理委员会。
1.准备配料罐，解决方案和管理计划
- 得到给药时间表，使得给予动物在相同的环境，并在一天的同一时间，以避免时间或偏压任何的困惑视觉刺激。
- 获得尽可能多的相同的，1.5L的，清晰的聚丙烯产卵所必需的组尺寸的数量的坦克。使用基团的每罐8鱼，其允许2组鱼的要每天稍后在过程中进行测试（参见步骤3）。使用1保持槽和每组一个配料罐（组2×总数）。
- 将400微米产卵插入所有保温水箱。 ˚F患病与生境的水或反渗透水在适当的温度坦克（斑马鱼，25-28°C），它与温度一致鱼通常安置在。
注意：可以有一些药物和缓冲栖息地水的化学组分之间不希望的化学相互作用。在这种情况下，使用缓冲的最小或没有水族馆的盐用于药物给药反渗透水，以及用于对照组。 - 确保坦克处于中立的环境，以避免给药过程中调节鱼的外部视觉刺激。
- 将400微米产卵插入所有保温水箱。 ˚F患病与生境的水或反渗透水在适当的温度坦克（斑马鱼，25-28°C），它与温度一致鱼通常安置在。
- 制备药液。混在产卵箱的药物与人居水适量。通过组合3毫升的高品位的乙醇（95％非变性乙醇）与1497毫升的水制备的0.2％的乙醇溶液。通过组合21毫升乙醇与1479毫升的水制备的1.4％的乙醇溶液。
2.组网鱼和EThanol行政程序
- 从它们的栖息地仔细坦克净鱼转移到含有产卵插入适当的储存罐。理想的情况是，房子在插入产卵鱼，以消除扣除干脆。
- 所有的鱼在各自的储水槽，轻轻抬起产卵插入了贮水箱，并将其放入相应的药液罐（ 图1A）。
- 根据需要记录的给药时间。用30分钟，在此处描述的过程的乙醇溶液。
- 如果可能的话，有助理协助各实验组的传输同步进行的药液，以确保精确的计量时间。另外，转移一组的时间和跟踪个别群体的计量时间（ 图1A）。
- 在必要的给药期结束时，从乙醇溶液小心地提起产卵刀片去掉鱼出的药液，并把轻轻回贮水箱。
- 轻轻地网鱼在暂养箱，把它们放回它们的栖息地，直到下一个预定的时间给药，或将产卵插回储存罐，消除网。
- 作为动物壳体设备，房屋，用作贮水箱在同一水箱和产卵插入动物的参数范围内以前，如果可能的提及。这将消除管理过程中完全扣除。
3.行为测试
- 55厘米长9.5厘米深的有白色防水地板（ 图1B）获得光/暗的舞台宽9.5厘米。贴上白色和黑色防水不反光的纸张使用魔术贴竞技场的内壁，其中一半盖在白色的半盖在黑色的舞台上。填写竞技场5厘米的栖息地水的深度在25-28℃的温度。 MAINT艾因在整个测试这个温度。
- 通过构造一个白色的三面外壳为竞技场可以位于Minimalize外部视觉刺激。确保在测试区域具有扩散顶灯灯光不会导致在水面上的反射，但是足够亮的运动跟踪软件，或交-hoc手册量化从视频图像。
- 将舞台上的外壳，并设置行为跟踪软件的记录和运动分析参数。将测试时间为5-15分钟，这取决于所研究的问题。
注意：在这里，我们用了5分钟。 - 运输组鱼进行测试，以研究区的生境坦克，并放置在舞台上外壳的外面。适应的鱼10分钟。
- 轻轻净一个从在光/暗竞技场的中心相应的组和地方鱼，一定要松开鱼，当它被定位成平行于所述舞台的长轴AVOID偏置鱼光或暗区。
- 开始的动物被释放后立即记录的行为。观看任何软件问题跟踪鱼或鱼跳跃或冻结。旋转舞台上的180°后一半的受试者进行了测试，以防止任何的困惑，由于导致从竞技场的一端朝向机箱的开口端的偏见。
- 经过庭审已经结束了，轻轻地网，从舞台上拆下来的鱼保持罐或栖息地的坦克。
4.分析
- 检查时间花在光与暗区。对于每个组，每个鱼，得到在光与暗区所花费的相对时间，并使用一个样本t检验进行分析（;从总试验时间（分）150秒差或Wilcoxon符号秩检验对非参数数据）的以确定群体显著喜欢一个区域比其他。
- 为了比较偏好，计算prefe减去花费在从在黑暗区中花费的时间的光带和比较各组之间的差异的时间伦斯索引。 叔测试可以用来比较两个组。比较多组同方差的利用Tukey的HSD post hoc检验的单向分析在必要时（或Kruskal-Wallis检验与唐恩的多重比较事后检验用于非参数数据）。
- 比较速度，区转换，曲折的数目，以及各组不动。使用方差利用Tukey的HSD post hoc检验单向分析在必要时（或Kruskal-Wallis检验与唐恩的多重比较事后检验用于非参数数据）。
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Representative Results
为了保持精度和控制在药理研究与斑马鱼是很重要的时候乙醇给药的持续时间一致和准确，如上所述。我们的过程可以增加给药过程的便利性和吞吐量。对任一每周-狂欢或每日中度时间表乙醇的给药导致改变的焦虑程度，与光照/黑暗试验测定，与对照组相比。当最后一次给药后两天测试，斑马鱼，对照组（谁没有收到任何酒精，但还是被转移到配料罐）中显示的行为预期的模式，与对照鱼的消费显著更多的时间在舞台上的阴暗面（ 图2A）在其他研究中6,9,13类似天真斑马鱼。鱼每周狂欢组比较无偏好无论是浅色或深色区域中的任务时，他们最后的乙醇处理后测试了两种天（ 图2B 图2C）的光明面;相反，对照组。优先索引指示控制和日常中度组（ 图2D）之间的显著差异。有跨组（ 表1）中的游泳速度没有显著差异，或不动的，因此，这种作用并不是由于马达赤字在鱼。
图1：传送程序和光明/黑暗竞技场 ，这些照片说明了过户手续（一）首先，鱼都坐落在转移罐（左）。配料含有乙醇罐被描绘（右）。（BC）从转印槽的乙醇溶液移动的鱼需要researcher解除产卵卡壳从转移箱，进入乙醇溶液罐。（D）光/暗的舞台如图所示测量宽9.5厘米9.5厘米深，55厘米长。白色地板的情况下，伴随着上半竞技场（左）和在其另一半白墙的黑色壁，产生明暗区域。
图2：代表性的结果和乙醇给药过程对三组斑马鱼的2天后停药trackplots。 （A）在整个5分钟亮/暗审单控制斑马鱼的运动路径的代表trackplot。下面是表示为热图，它是斑马鱼的运动的整个试验的着色表示的基础上，在鱼的每个像素表示的位置所花费的时间相同的斑马鱼trackplot。（B）的甲repres从周线，狂欢组单斑马鱼在整个5分钟光/暗任务entative trackplot。下面是来自同一斑马鱼的热图（C）的一个单一的每日中度斑马鱼的运动的整个5分钟光照/黑暗试验的代表性trackplot。下面是来自同一斑马鱼的热图。（D）中的优先级索引，计算各组中减去时间中的光带从时间中暗区工作的时间。负数表示偏爱的暗区。正数表示偏爱浅色区域。结果表明，在对照和日常中度组2天停药* P <0.05（单向ANOVA）之间的偏好一个显著差异。请注意，还有为暗一个显著偏好于对照组，P <0.05（1样本t检验 ，从0差），并在日常中度组为光的显著偏好，磷<0.05（1样品<EM> t检验，从0差）。 请点击这里查看该图的放大版本。
| 速度 | 动 | |
| （厘米/秒）的 | （秒） | |
| 2天WD | 2天WD | |
| 对照组（n = 13） | 9.1±0.6 | 1.9±0.6 |
| 狂欢（N = 14） | 9.8±0.5 | 0.8±0.2 |
| 慢性（N = 15） | 10.3±0.5 | 2.5±1.0 |
表1：亮/暗测试期间的平均流速和固定性 。平均游泳速度（厘米/秒），并在2天后停药的代表性组斑马鱼的固定性（秒）（平均值±SEM）。在这里，被发现在任何速度或不动无显著差异。使用与贺尔康等人的许可。，（2013）。
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Discussion
涉及药品监督管理局在斑马鱼以往的研究仅仅依靠扣除鱼从家里罐运送他们向药液12,16。网并不总是一致的，往往需要较长的时间比由于斑马鱼，其具有显著个体差异的逃避反应预期。传统的转印方法虽然有用，但也能够在通过减少总时间的鱼花的水以外的量，以及减少在动物之间的传输时间的变化量的改善。除了提高实用性，该方法为研究人员剂量大组鱼的同时在对于时间的精确量的解决方案的能力。先前的方法需要两种给药单个的鱼，或试图同时净整鱼的基团。前者是缓慢和降低吞吐量，而后者是一种笨拙和困难的任务。此外，运动追踪系统将c一个评估的多个鱼的行为一次可以从该方法的精确度中受益。鱼可以直接从产卵插入到浅水舞台，这将确保几乎同时暴露在舞台上所有的鱼被转移。
利用这种新方法生产的显著效果上三组斑马鱼超过21天的时间来实现时。控制鱼没有收到任何酒精，每天中度鱼，每天收到一次少量的酒精，以及每周 - 狂欢的鱼，每周接受了大剂量的酒精，一旦超过21天的期限。在光/暗任务，给药过程没有改变斑马鱼的正常偏爱对照条件下的暗区。然而，2天后酒精戒断的，斑马鱼在日常中度组优选的光区的舞台，逆转偏好。统计分析证实了在区域偏好一个显著的变化。这是可能的计量程序，可以重新产生了乙醇寻求行为由于条件性位置偏爱（CPP），用鱼求乙醇（一种食欲刺激物），并更喜欢白色区域，由于其相对相似性的明亮的给药区域。最近的研究显示，斑马鱼的地方都服用乙醇17,18 CPP可发生在斑马鱼和地区。每周狂欢鱼没有表现出偏爱后2天乙醇，尽管大约占该发现的神经机制证据不足，则可能是不频繁的，但大剂量的酒精可损伤大脑，从而尽可能地把鱼无法区段之间进行区分。
这个计量过程赋予研究者的另一个优点是它的普遍性。如所描述的，该过程产生清晰的和有用的结果，在斑马鱼。但是，该过程并不限于仅用于斑马鱼。关于该过程的约束条件相关的大小和定量给料罐，动物和TESTI的限制纳克装置，以及对数据进行分析的能力。随着使用移动跟踪软件，最近的研究已经在整个审讯调查许多额外的变量。白避免习惯，越过广场，运动习惯，延迟到白区，不稳定游动，thigmotaxis（靠近舞台的墙壁所花费的时间），以及风险评估也可以量化14。也可以考虑使用此过程在其他模式生物，如金鱼，先前已经被用于研究耐受和戒断19的作用。研究人员希望能调查的其它药理学试剂或环境毒素的影响，使用其它的行为测定法，或其他海洋或淡水动物，也可以利用这个基本方法。
使用这个协议是简单而有效的。但是，如果结果并不如预期，考虑故障排除的运动跟踪系统，以确保正确的数据集合。 Trackin克应该是整个审判顺利和准确。跟踪系统应当记录鱼的身体中心的运动在所有时间。跟踪任何跳跃或不稳定的运动点，由于视觉假象，如光线反射的水波纹，或不当的跟踪设置，可能混淆的结果。在结果有些差异可能来自于赛场上的设计还是环境剂量小的差异。可以肯定的是复制的，竞技场应描述，特别是对于使用白色地板最大化在斑马鱼中的跟踪效率。与其他鱼类，颜色较淡，深色地板应使用运动跟踪，以帮助。类似地，在一种环境，而不受任何视觉刺激可能可能偏压鱼给药的鱼是非常重要的。任何不同的颜色，图案或色调是感知到的鱼可能会混淆的结果。中性，浅色的背景相似，在住房制度的建议。</ P>
尽管这是可行的，以根据需要修改为其它种类的鱼的该方法中，结果可能会在固有的光/暗偏好20-21而言会有所不同。同样重要的是要注意，即使这里描述的方法仍导致一些应力。虽然网是显著降低，该过程仍然涉及的时间，其中的鱼必须是选自水，可能诱发的应激反应在很短的时间。拉姆齐和他的同事22发现，斑马鱼网纹皮质醇了至少两倍于自己的身体的水平比那些没有被捕。因为皮质醇是连接于应力11的一种激素，这可能改变被测量的行为反应。而我们的方法减少了网，它并不能完全消除。但是，它为研究人员提供了机会，以消除电网的发病率，如果他们通过住房斑马鱼在产卵插入的渴望。未来的研究应调查是否使用产卵inser的吨鱼的传输可以降低相对于网应激反应。此外，这是极为重要的，以保持精确的给药次数与组之间传送倍。改变给药时间或较大的差异时花出去的水可能会改变结果。为了减少可能的生理作用，这也是关键性白天的类似倍剂量的鱼。在目前的实验鱼配料和上午10点至下午2点进行测试。此过程的准确，可靠的复制依赖于重复精度的协议。
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Disclosures
作者承认约书亚盖洛普对使用其用于图1的拍摄设备。这项工作是由自然科学和工程研究理事会（NSERC），加拿大发现金（以TJH）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Three shelf benchtop housing system |  Aquatic Habitats |
N/A | |
| 1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle | Aquatic Habitats |
N/A | |
| Pure Grain Ethanol | Luxco, INC |
N/A | |
| Ethovision XT Motion tracking software | Noldus Information Technology |
||
| Pipette | Eppendorf Canada |
||
| Light/Dark Arena | Custom | Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long. |
References
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews. 83 (1), 13-34 (2008).
- Langheinrich, U. Zebrafish: A new model on the pharmaceutical catwalk. BioEssays. 25 (9), 904-912 (2003).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Miller, N., Greene, K., Dydinski, A., Gerlai, R. Effects of nicotine and alcohol on zebrafish ( Danio rerio) shoaling. Behavioural brain research. , (2012).
- Bencan, Z., Sledge, D., Levin, E. D. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 94 (1), 75-80 (2009).
- Holcombe, A., Howorko, A., Powell, R. A., Schalomon, M., Hamilton, T. J. Reversed Scototaxis during Withdrawal after Daily-Moderate, but Not Weekly-Binge Administration of Ethanol in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (5), (2013).
- Mathur, P., Guo, S. Differences of acute versus chronic ethanol exposure on anxiety-like behavioral responses in zebrafish. Behavioural Brain Research. 219 (2), 234-239 (2011).
- Dlugos, C., Rabin, R. Ethanol effects on three strains of zebrafish: model system for genetic investigations. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2003).
- Maximino, C., et al. Scototaxis as anxiety-like behavior in fish. Nature Protocols. 5 (2), 209-216 (2010).
- Gerlai, R., Lee, V., Blaser, R. Effects of acute and chronic ethanol exposure on the behavior of adult zebrafish (Danio rerio). Pharmacology Biochemistry and Behavior. 85 (4), 752-761 (2006).
- Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural brain research. 205 (1), 38-44 (2009).
- Gebauer, D. L., et al. Effects of anxiolytics in zebrafish: Similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and ethanol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 99 (3), 480-486 (2011).
- Serra, M. C., Mattioli, R. Natural preference of zebrafish (Danio rerio) for a dark environment. Braz J Med Biol Res. 32 (12), 1551-1553 (1999).
- Maximino, C., et al. Behavioral and neurochemical changes in the zebrafish leopard strain. Genes Brain Behav. 12 (5), 576-582 (2013).
- Levin, E. D., Bencan, Z., Cerutti, D. T.
- Gerlai, R., Chatterjee, D., Pereira, T., Sawashima, T., Krishnannair, R. Acute and chronic alcohol dose: population differences in behavior and neurochemistry of zebrafish. Genes, Brain and Behavior. 8 (6), 586-599 (2009).
- Mathur, P., Berberoglu, M. A., Guo, S. Preference for ethanol in zebrafish following a single exposure. Behavioural Brain Research. 217 (1), 128-133 (2011).
- Renninger, S. L., et al. Investigating the genetics of visual processing, function and behaviour in zebrafish. Neurogenetics. 12, 97-116 (2011).
- Crawshaw, L. I., et al. Tolerance and withdrawal in goldfish exposed to ethanol. Physiology & Behaviour. 87 (3), 460-468 (2006).
- Hamilton, T. J., Holcombe, A. Tresguerres, M.CO2-induced ocean acidification increases anxiety in rockfish via alteration of GABAA receptor functioning. Proceedings of the Royal Society B. , (2014).
- Ramsay, J. M., Feist, G. W., Varga, Z. M., Westerfield, M., Kent, M. L., Schreck, C. B. Whole-body cortisol response of zebrafish to acute net handling stress. Aquaculture. 297 (1-4), 157-164 (2009).
- Hamilton, T. J., Paz-Yepes, J., Morrison, R. A., Palenik, B., Tresguerres, M. Exposure to bloom-like concentrations of two marine Synechococcus cyanobacteria (strains CC9311 and CC9902) differentially alters fish behaviour. Conservation Physiology. 2 (1), (2014).
