Introduction
Der Zebrafisch (Danio rerio) ist ein kleines Knochenfisch-Arten mit Ursprung in Indien, die eine sinnvolle Modellorganismus für Verhaltens 1 und medizinischen Forschung 2,3 ist. Zebrafische sind auch häufig bei der Prüfung von verschiedenen pharmakologischen Substanzen eingesetzt, um deren Auswirkungen auf das Verhalten zu charakterisieren. Verschiedenen Dosierungen und Zeitpläne der Arzneimittelverabreichung verwendet worden, um das Verhalten der Zebrafisch nach der Verabreichung von Verbindungen, wie Stimulanzien 4, Anxiolytika 5 und Ethanol 6-8 zu untersuchen.
Unser Labor hat die Auswirkungen der unterschiedlichen Zeitpläne der Ethanol-Administration an Zebrafischen Angst und Fortbewegung in der gut validierten Hell / Dunkel-Assay 9, 20, auch gemeinhin als scototaxic Assay bezeichnet sucht. Eine neue Methode der Ethanol-Verabreichung wurden entwickelt, um die Effizienz für wiederholte tägliche Verabreichung über einen langen Zeitraum (21 Tage) 6 zu erhöhen 10-12 übertragen. Während diese Methode ist weitgehend akzeptiert, kann Netting Zebrafisch die Variabilität in der Zeit, die die Einführung und entfernen Sie den Fisch aus der Wirkstofflösung zu erhöhen. Daher kann die genaue Exposition gegenüber der Verbindung von Interesse im Verlauf eines Experiments mit wiederholter Dosierung variieren. Eine Methode, die Fehlerquellen die sich aus Schwankungen der Transportzeiten reduziert ist daher wünschenswert. Mit unserer Methode können wir alle Fische gleichzeitig zu bewegen, was zu identischen Dosierung Zeit in jedem Fisch. Nach Ethanolexposition (hier beschrieben), können Zebrafisch in jeder numbe getestet werdenr von Verhaltenstests, einschließlich derjenigen, die Angst zu bewerten. Dosierungsgruppen von Fischen mit der neuen Methode hat praktische Anwendungen jenseits der Fähigkeit, genau zu replizieren und zu standardisieren Dosierung zwischen Subjekten und zwischen Gruppen von Fischen. Das Aufkommen der neuen Software, die für die Verfolgung mehrerer Fisch ermöglicht auf einmal sehen können Forscher nutzen unsere Methoden, um Reproduzierbarkeit und Genauigkeit in ihren Experimenten zu gewährleisten. Angesichts der weit verbreiteten Einsatz von Zebrafisch als Modellorganismus für Behavioral Neuroscience, wird diese Methode Effizienz und Praktikabilität in Zukunft pharmakologische Studien zu erhöhen.
Im vorliegenden Paradigma wurde eine wiederholte Dosierungsschema verwendet, dass etwa spiegelt menschliche Trinkpläne. Anlage, täglicher-mäßig oder Wochen-Binge: Die Fische wurden randomisiert einer von drei Gruppen zugeordnet. Das Dosierungsschema war 21 Tage in der Dauer, gewählt, weil es deutlich Belichtungszeiten in früheren Studien 7 überschritten. Kontrollfische erhielten Null alcohol, erhielten täglich mäßiger Fisch 0,2% Alkohol einmal pro Tag, und Wochen-binge Fische erhielten 1,4% Alkohol einmal pro Woche. Der Hell / Dunkel Aufgabe wurde verwendet, um Angst nach 2 Tagen Widerrufs beurteilen. Dies ist ein relativ einfacher Test, um zu verwalten, welche einen rechteckigen Arena, in der die Wände auf einer Seite weiß und auf der anderen Seite sind dunkel 9 verwendet. Erwachsenen Zebrafisch lieber robust die dunkle Seite der Arena unter Kontrollbedingungen 6,9,13. Erhöhte Angst operational als deutlich mehr Zeit in der dunklen Zone verbracht definiert und verminderte Angst kann davon ausgegangen, wenn die Fische relativ mehr Zeit in der Lichtzone verbracht verbringt werden. Mit bewegungs Tracking-Software können auch andere informative Variablen auch quantifiziert werden, einschließlich Durchschnittsgeschwindigkeit, Immobilität, mäandernden und Zonenübergänge 14.
Die in unserem Labor entwickelt Dosierverfahren kann zu jeder Forschungs in denen wasserlösliche Verbindungen sind, eine oder mehrere zebrafi verabreicht geltensh. Viele andere pharmakologische Mittel, die von dieser Methode profitieren können, sind derzeit im Zebrafisch getestet. Häufigsten getesteten Verbindungen umfassen Nikotin, Chlordiazepoxid, Buspiron und Scopolamin, die in ähnlicher Weise wie in Ethanol gelöst; durch Vermischen der geeigneten Menge der Chemikalie in Wasser. Deshalb ist die allgemeine Aufgabe der vorliegenden Verfahren viel breiter und nicht beschränkt auf Ethanol. Außerdem nach der Gabe von Medikamenten für mehrere Tage, ist die Hell / Dunkel-Aufgabe nur eine von vielen Verhaltenstests, die eingesetzt werden könnten. Nach Verabreichung des Arzneimittels oder bei der Entnahme, anderen beliebten Assays, die verwendet werden können, gehören die neuartigen Tank Tauchtest 15 und Tests des Sozialverhaltens wie shoaling 16. Das folgende Verfahren wird ein effizientes Verfahren zum wiederholten Übertragung Fischgruppen oder einzelne Fische in Lösungen, die eine pharmakologische Verbindung von Interesse zu skizzieren. Zusätzlich wird der Prozess der Prüfung Angst mit der Hell / Dunkel-Testin Gruppen von Fischen, die, nachdem sie lange Listen der Alkoholverwaltung ausgesetzt, der zur Rücknahme sind, beschrieben.
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Protocol
Alle Verfahren und Verhaltenstests wurden von MacEwan University Animal Research Ethics Board unter Protokollnummer 06-11-12, die nicht im Einklang mit dem kanadischen Rat für Richtlinien Animal Care ist für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren ist genehmigt.
1. Bereiten Dosierbehälter, Lösungen und Applikationsplan
- Bereiten Sie eine Verabreichungsschema, so dass die Tiere in der gleichen Umgebung und während der gleichen Zeit des Tages, um alle verwechselt der Zeit oder Vorspann auf visuelle Reize zu vermeiden dosiert.
- Zu erhalten, wie viele identische, 1,5 L, klare Polypropylen Laichbehältern für die Anzahl der Gruppengrößen wie nötig. Verwenden Sie Gruppen von 8 Fischen pro Behälter, die für 2 Gruppen von Fischen erlaubt, pro Tag später im Verfahren geprüft werden (siehe Schritt 3). Verwenden Sie eine Haltetank und ein Dosierbehälter pro Gruppe (2x Gesamtzahl der Gruppen).
- Zeigen 400 um Laich Einsätze in allen Haltetanks. Fill die Tanks mit Lebensraum Wasser oder Umkehrosmosewasser bei der richtigen Temperatur (für Zebrafisch, 25-28 ° C), die im Einklang mit der Temperatur Fisch ist in der Regel bei untergebracht.
HINWEIS: Es können unerwünschte chemische Wechselwirkungen zwischen einigen Drogen und die chemischen Komponenten der gepufferten Lebensraum Wasser sein. In dieser Situation verwenden Umkehrosmose mit minimalen oder keinen Aquarium Salze zur Verabreichung des Arzneimittels gepuffert, als auch für die Kontrollgruppen. - Sicherzustellen, daß die Behälter in einer neutralen Umgebung Anlage Fisch externe visuelle Reize bei der Dosierung zu vermeiden.
- Zeigen 400 um Laich Einsätze in allen Haltetanks. Fill die Tanks mit Lebensraum Wasser oder Umkehrosmosewasser bei der richtigen Temperatur (für Zebrafisch, 25-28 ° C), die im Einklang mit der Temperatur Fisch ist in der Regel bei untergebracht.
- Bereiten Sie die Medikamentenlösung. Mischen Sie die entsprechende Menge des Arzneimittels mit Lebensraum Wasser in den Laichbehältern. Bereiten Sie die 0,2% ige Ethanollösung durch die Kombination von 3 ml einer hochgradigen Ethanol (95% nicht denaturierten Ethanol) mit 1497 ml Wasser. Vorbereitung der 1,4% igen Ethanollösung durch Kombinieren von 21 ml Ethanol mit 1,479 ml Wasser.
2. Netting Fische und Ethanol Verwaltungsordnung
- Sorgfältig Netto Fische aus ihrem Lebensraum Tanks und Überführung in die entsprechenden Vorratstank, der die Laicheinsatz. Idealerweise beherbergen die Fische in der Laich Einlage zusammen beseitigen Netting.
- Mit aller Fische in ihren jeweiligen Haltetanks, heben die Laicheinsatz aus dem Auffangbehälter und legen Sie sie in den entsprechenden Tank Wirkstofflösung (Abbildung 1A).
- Notieren Sie die Dosierzeit nach Bedarf. Verwenden 30 min in der Ethanol-Lösung für das hier beschriebene Verfahren.
- Wenn möglich, haben Assistenten helfen bei der Übertragung aller Versuchsgruppen auf die Arzneimittellösung gleichzeitig auf eine genaue Dosierung zu gewährleisten. Alternativ übertragen eine Gruppe zu einem Zeitpunkt und zu verfolgen, einzelne Gruppen 'Dosierzeiten (Abbildung 1A).
- Am Ende der erforderlichen Dosierungsperiode, entfernen Sie den Fisch aus der Ethanollösung durch vorsichtiges Anheben des Laicheinsatzaus der Wirkstofflösung und Platzierung sanft zurück in den Vorratsbehälter.
- Sanft Netto die Fische in den Haltetanks und legen Sie sie zurück in ihren Lebensräumen bis zum nächsten geplanten Dosierung Zeit, oder legen Sie das Laich einfügen zurück in den Vorratsbehälter zu Netting beseitigen.
- Wie vorher, wenn möglich innerhalb der Parameter der Tierhaltungsgeräte, Haus die Tiere in demselben Tank und Laicheinsatz, der als Haltetank verwendet wird erwähnt. Dies wird zusammen beseitigen während der Verwaltungsverfahren Netting.
3. Behavioral Testing
- Besorgen Sie sich eine hell / dunkel-Arena 9,5 cm breit und 55 cm lang und 9,5 cm tief mit einem weißen wasserdichten Boden (Abbildung 1B). Bringen weiß und schwarz wasserdicht entspiegeltes Papier an den Innenwänden der Arena mit Klettverschluss, mit der Hälfte der Arena abgedeckt in weiß und halb in schwarz abgedeckt. Füllen Sie die Arena zu einer Tiefe von 5 cm mit Lebensraum Wasser mit einer Temperatur von 25-28 ° C. Maintain diese Temperatur während des Tests.
- Minimalize externe visuelle Reize, indem er eine weiße dreiseitigen Gehäuse für die Arena in entfernt werden. Stellen Sie sicher, das Testgebiet hat diffundieren Deckenbeleuchtung, die nicht Reflexionen auf der Wasseroberfläche hervorruft, noch ausreichend hell für die Bewegung Tracking-Software, oder senden -hoc manuelle Quantifizierung von Videobildern.
- Legen Sie die Arena in das Gehäuse und setzen Sie die Aufzeichnung und Bewegungsanalyseparameter des Verhaltens-Tracking-Software. Legen Sie die Testdauer auf 5-15 min, je nach Fragestellung.
HINWEIS: Hier verwendeten wir 5 min. - Transportieren Sie die Gruppe der Fische auf den Forschungsbereich in den Lebensraum Tank getestet werden und legen Sie sie außerhalb der Arena Gehäuse. Akklimatisieren Sie den Fisch für 10 min.
- Sanft Netto ein Fisch aus der entsprechenden Gruppe und in der Mitte der Hell / Dunkel-Arena, wobei Sie auf den Fisch zu lösen, wenn sie parallel zu der langen Achse der Arena positioniert, um AVOid Vorspannen der Fisch auf den hellen oder dunklen Zone.
- Starten Sie die Aufnahme Verhalten sofort nachdem das Tier losgelassen wird. Achten Sie auf jegliche Softwareprobleme bei der Verfolgung der Fisch oder für Fische springen oder Gefrieren. Drehen der Arena 180 ° nach der Hälfte der Probanden wurden getestet, alle verwechselt zu verhindern wegen Verzerrungen, die sich aus dem Ende der Arena wird zum offenen Ende des Gehäuses ausgerichtet ist.
- Nach Ablauf der Test hat, sanft net beendet und entfernen Sie den Fisch aus der Arena in einen Vorratstank oder Lebensraum Tank.
4. Analyse
- Untersuchen Zeit in Licht verbrachte gegen Dunkelzonen. Für jede Gruppe und jeden Fisch, erhalten die relative Zeit in den hellen und dunklen Zonen verbracht und zu analysieren, mit einem eine Probe t-Test (oder Wilcoxon-Test für nicht-parametrische Daten; Unterschied (die Hälfte der gesamten Probezeit) 150 sec) zu ermitteln, ob Gruppen ein Bereich über den anderen deutlich bevorzugen.
- Um Einstellungen zu vergleichen, berechnen preferenzIndex durch Subtrahieren der Zeit entsprechend der Zone von der Zeit, in der dunklen Zone aufgewendet und vergleichen Unterschiede zwischen den Gruppen. t- Tests können verwendet werden, um zwei Gruppen zu vergleichen. Vergleichen Sie mehrere Gruppen mit einer Einwegvarianzanalyse unter Verwendung von Tukey HSD post hoc Test, wo notwendig (oder Kruskal-Wallis-Test mit Dunn-Mehrfachvergleichs post hoc Test für nicht-parametrische Daten).
- Vergleichen Geschwindigkeit, Anzahl der Zonenübergänge, mäandernden, und Unbeweglichkeit in Gruppen. Verwenden Sie Einwegvarianzanalyse unter Verwendung von Tukey HSD post hoc Test, wo notwendig (oder Kruskal-Wallis-Test mit Dunn-Mehrfachvergleichs post hoc Test für nicht-parametrische Daten).
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Representative Results
Um die Genauigkeit und die Steuerung in pharmakologischen Studien mit Zebrafisch ist es wichtig, wenn die Dauer der Verabreichung Ethanol konsequent und genau wie oben beschrieben erhalten. Unsere Vorgehensweise kann die Leichtigkeit und den Durchsatz des Dosierungsverfahren zu erhöhen. Die Verabreichung von Ethanol auf entweder eine wöchentliche-binge oder täglich mäßiger Plan führte zu veränderten Angst Ebenen, mit der Hell / Dunkel-Test gemessen, im Vergleich zur Kontrollgruppe. Wenn zwei Tage nach der letzten Dosierung getestet, Zebrafisch in der Kontrollgruppe (wer keinen Alkohol erhalten, waren aber noch zu Dosieren Tanks bewegt) angezeigt das erwartete Muster des Verhaltens, mit Kontrollfische Ausgaben deutlich mehr Zeit auf der dunklen Seite der Arena ( 2A) ähnlich naive Zebrafisch in anderen Studien 6,9,13. Fisch in der Wochen Binge-Gruppe zeigte keine Präferenz für entweder die helle oder dunkle Zonen in der Aufgabe bei der Prüfung zwei Tage nach ihrem letzten Ethanol Verwaltung (2B (2C); im Gegensatz zu der Kontrollgruppe. Die Präferenz-Index zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen den Kontroll- und tägliche moderate Gruppen (Figur 2D). Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Schwimmgeschwindigkeit oder Unbeweglichkeit in Gruppen (Tabelle 1), und daher war dieser Effekt nicht auf eine motorische Defizite in den Fisch.
Abb. 1: Übertragungsverfahren und die Hell / Dunkel-Arena Diese Fotos zeigen die Übertragungsverfahren (A) Zuerst werden die Fische in der Transferbehälter (links) entfernt.. Dosierbehälter Ethanol enthält, wird im Bild (rechts). (BC) Verschieben Sie den Fisch aus der Übertragung Tank zur Ethanollösung erfordert die researcher um die Laich Einsatz aus dem Transferbehälter und in den Tank der Ethanollösung zu heben. (d) der Hell / Dunkel-Arena, wie dargestellt, 9,5 cm breit und 9,5 cm tief und 55 cm lang gemessen. Weiß Böden verwendet wird, zusammen mit schwarzen Wänden auf der Hälfte der Arena (links) und weiße Wände auf der anderen Hälfte, die Schaffung eines hellen und dunklen Zone.
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse und trackplots Ethanol Dosierungsverfahren auf drei Gruppen von Zebrafisch nach 2 Tage Widerrufsrecht. (A) Ein Vertreter trackplot eines einzigen Steuerzebrafisch Bewegungsbahn im ganzen 5 Minuten Licht / Dunkel-Studie. Unten ist der gleiche Zebrafisch trackplot als Heatmap, die eine farbige Darstellung der Zebrafisch Bewegung in der ganzen Studie ist, bezogen auf die Zeit in der Lage von jedem Pixel dargestellt der Fisch verbrachte vertreten. (B) A Representative trackplot eines einzigen Zebrafisch von der Wochen-Binge-Gruppe in der gesamten 5 Minuten Licht / Dunkel Aufgabe. Unten ist die Heatmap aus demselben Zebrafisch. (C) Ein Vertreter trackplot einer einzigen täglichen moderaten Zebrafisch Bewegung in der ganzen 5 Minuten Licht / Dunkel-Studie. Unten ist die Heatmap aus demselben Zebrafisch. (D) Die Präferenz-Index wurde für alle Gruppen durch Subtraktion der Zeit angesichts Zone von Zeit in der dunklen Zone verbracht verbracht berechnet. Negative Zahlen zeigen Vorliebe für die dunkle Zone. Positive Zahlen zeigen Vorliebe für die Lichtzone. Die Ergebnisse zeigen einen signifikanten Unterschied in Präferenz zwischen Kontrolle und tägliche moderate Gruppen bei 2 Tage Widerrufsrecht * p <0,05 (one-way ANOVA). Hinweis: Es gibt auch eine signifikante Präferenz für dunkle in der Kontrollgruppe, p <0,05 (eine Probe t-Test, differenz von 0) und eine signifikante Präferenz für Licht im täglichen moderate Gruppe, p <0,05 (eine Probe <em> t-Test, Differenz 0). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Geschwindigkeit | Immobilität | |
| (Cm / sec) | (Sec) | |
| 2-Tage Wd | 2-Tage Wd | |
| Kontrolle (n = 13) | 9,1 ± 0,6 | 1,9 ± 0,6 |
| Binge (n = 14) | 9,8 ± 0,5 | 0,8 ± 0,2 |
| Chronische (n = 15) | 10,3 ± 0,5 | 2,5 ± 1,0 |
Tabelle 1: Durchschnittliche Geschwindigkeit und Unbeweglichkeit während der Hell / Dunkel-Test. Die durchschnittliche Schwimmgeschwindigkeit (cm / s) und Unbeweglichkeit (sec) einer repräsentativen Gruppe von Zebrafisch nach 2 Tagen Widerrufs (Mittelwert ± SEM). Hier keine signifikanten Unterschiede in beiden Geschwindigkeit oder Unbeweglichkeit gefunden. Verwendet mit Erlaubnis von Holcombe et al., (2013).
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Discussion
Vorherige Studien mit Medikamentenverabreichung im Zebrafisch haben einfach auf Netting Fische, um sie aus ihrer Heimat Tank in der Arzneimittellösung 12,16 transportieren verlassen. Netting ist nicht immer konsistent und dauert oft länger als aufgrund der Fluchtreaktion der Zebrafisch, die erhebliche individuelle Variabilität hat erwartet. Traditionelle Methoden der Übertragung, während nützlich, können auf durch Verringern der Menge der Gesamtzeit der Fisch außerhalb des Wassers zu verbringen, als auch die Verringerung der Menge der Veränderlichkeit der Übertragungszeit zwischen den Tieren verbessert werden. Zusätzlich zur Verbesserung der Funktionalität, gibt diese Methode Forscher die Fähigkeit, große Fischgruppen gleichzeitig in einer Lösung für eine präzise Zeitmenge zu dosieren. Bisherige Verfahren erfordern entweder Dosierung einer einzigen Fisch, oder der Versuch, Fischgruppen gleichzeitig net Ganzes. Ersteres ist langsam und verringert den Durchsatz, während das letztere ist eine unangenehme und schwierige Aufgabe. Weiterhin bewegungs Tracking-Systeme, ceine Beurteilung des Verhaltens mehrerer Fische auf einmal von der Genauigkeit dieses Verfahrens profitieren. Fisch könnte direkt aus dem Laich Einsatzes in den Schwarm Arena, die in der Nähe von gleichzeitiger Einwirkung der Arena für alle Fische sicherstellen würde übertragen werden.
Mit Hilfe dieser neuen Methode signifikante Ergebnisse, wenn sie auf drei Gruppen von Zebrafisch über einen Zeitraum von 21 Tagen durchgeführt. Kontrollfische erhielten kein Alkohol, täglich moderate Fisch erhielt eine kleine Menge Alkohol einmal pro Tag, und Wochen-binge Fisch erhielt eine große Dosis Alkohol einmal pro Woche über den Zeitraum von 21 Tagen. In der Hell / Dunkel-Aufgabe, die Dosierung Verfahren nicht den normalen Präferenz des Zebrafisch für die dunkle Zone unter Kontrollbedingungen zu ändern. , Nach 2 Tagen Ethanolentzug, Zebrafisch in der täglichen moderaten Gruppe bevorzugt jedoch die Lichtzone der Arena, eine Umkehr der Präferenz. Die statistische Analyse bestätigt eine signifikante Veränderung der Zonenpräferenz. Es ist möglich, dass die Dosierung proceduRe in Ethanol sucht Verhalten aufgrund einer konditionierten Platzpräferenz (CPP), mit dem Fisch sucht Ethanol (ein appetitive Reiz), und lieber die weiße Zone aufgrund seiner relativen Ähnlichkeit mit dem hellen Dosierung Bereich geführt. Jüngste Forschungsergebnisse zeigen, dass CPP kann im Zebrafisch und in Gebieten auftreten, wo Zebrafisch werden mit Ethanol 17,18 dosiert. Wöchentliche Binge-Fische zeigten keine Präferenz 2 Tage nach Ethanol, und obwohl Beweise über neuronale Mechanismen Bilanzierung von dieser Erkenntnis fehlt, ist es möglich, dass selten, aber hohe Dosen von Alkohol kann das Gehirn schädigen, möglicherweise verlassen Fische nicht zwischen den Zonen zu unterscheiden.
Ein weiterer Vorteil, dass diese Dosierungsverfahren verleiht Forscher ist ihre Verallgemeinerbarkeit. Wie beschrieben, erzeugt das Verfahren klar und nützliche Ergebnisse im Zebrafisch. Jedoch ist das Verfahren nicht nur auf Zebrafisch beschränkt. Die Einschränkungen über das Verfahren sind für die Größe und Grenzen der Dosierungsbehälter, Tiere und Testi bezogenenng Vorrichtung, sowie die Fähigkeit, Daten zu analysieren. Mit der Verwendung von Motion-Tracking-Software, haben neuere Studien viele zusätzliche Variablen während eines Probesucht. Weiß Vermeidung Gewöhnung, Plätze gekreuzt, Fortbewegung Gewöhnung, Latenz auf die weiße Zone, erratische Schwimmen, Thigmotaxis (Zeit in der Nähe der Arena Mauern verbracht) und Risikobewertung kann auch quantifiziert 14 werden. Es ist denkbar, dieses Verfahren in anderen Modellorganismen wie Goldfischen, die bisher verwendet wurden, um die Rolle von Toleranz und Entzugs 19 untersuchen zu verwenden. Forscher hoffen, die Auswirkungen von anderen pharmakologischen Mitteln oder Umweltgifte zu untersuchen, die Verwendung von anderen Verhaltenstests oder andere Meeres- oder Süßwassertiere, könnte auch nutzen diese grundlegende Methodik.
Mit diesem Protokoll ist einfach und effektiv. Allerdings, wenn die Ergebnisse nicht wie erwartet, sollten Problembehandlung der Bewegungsverfolgungssystem, um eine ordnungsgemäße Datenerfassung zu gewährleisten. Tracking sollte glatt und präzise über die Studien sein. Das Tracking-System sollte die Aufzeichnung der Bewegung des Körpermitte des Fisches zu allen Zeiten. Alle Springen oder erratische Bewegung der Spur dot aufgrund visuelle Artefakte wie Lichtreflexe auf dem Wasser Wellen, oder unsachgemäße Tracking-Einstellungen können die Ergebnisse zu verwechseln. Einige Unstimmigkeiten in Ergebnisse können von kleinen Unterschieden in der Arena Design oder Dosierung Umgebungen entstehen. Um sicher zu der Replikation sein, sollte die Arena als beschrieben werden, insbesondere im Hinblick auf Verwendung eines weißen Boden, um Tracking Effizienz im Zebrafisch zu maximieren. Bei anderen Fischen, die in der Farbe heller sind, sollte ein dunkler Boden verwendet werden, um in Motion-Tracking zu unterstützen. In ähnlicher Weise ist die Dosierung der Fische in einer Umgebung, die frei von visuellen Reizen, die möglicherweise vorspannen kann der Fisch ist extrem wichtig. Jede unterschiedliche Farbe, Muster oder Farbe, die wahrnehmbar ist, um den Fisch könnte Ergebnisse zu verwechseln. Eine neutrale, helle Hintergrund ähnlich wie in dem Gehäusesystem empfohlen. </ P>
Während es möglich ist, diese Methode für andere Fischarten nach Bedarf zu ändern, können die Ergebnisse in Bezug auf die angeborenen Hell / Dunkel-Präferenz 20-21 variieren. Es ist auch wichtig zu beachten, auch die hier beschriebene Vorgehensweise immer noch verursacht einigen Stress. Obwohl Netting wird deutlich reduziert, das Verfahren immer noch mit einem sehr kurzen Zeitraum, wo die Fische müssen aus dem Wasser zu sein, möglicherweise eine Stressantwort induziert wird. Ramsay und Kollegen festgestellt, dass 22 saldierten Zebrafisch im Vergleich zu denen, die nicht verrechnet wurden, hatten mindestens das Doppelte der Cortisolspiegel in ihrem Körper. Da Cortisol ist ein Hormon, um Stress 11 verknüpft dies die Verhaltensreaktion, die gemessen wird, zu ändern. Während unsere Methode reduziert Netting, bedeutet es nicht beseitigen. , Gibt es aber Forschern die Möglichkeit, die Häufigkeit von Netting zu beseitigen, wenn sie wünschen, durch Gehäusezebrafisch in den Laich Einsätze. Zukünftige Studien sollten untersuchen, ob die Nutzung des Laich Insert für den Transfer von Fischen können die Stress-Reaktion in Bezug auf Netting verringern. Darüber hinaus ist es von entscheidender Bedeutung, um eine genaue Dosierung Zeiten zu erhalten und Transferzeiten zwischen den Gruppen. Änderungen der Dosierung Zeiten oder große Unterschiede in der Zeit aus dem Wasser verbracht könnten Ergebnisse verändern. Mögliche zirkadianen Wirkung zu reduzieren, ist es auch wichtig, den Fisch während ähnliche Tageszeiten dosieren. Im aktuellen Experiment Fische wurden dosiert und von 10.00 bis 14.00 Uhr getestet. Genaue und zuverlässige Replikation dieses Verfahrens beruht auf Wiederholung des Protokolls mit Präzision.
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Disclosures
Die Autoren danken Joshua Gallup für die Verwendung seiner Fotoausrüstung 1 verwendet wird. Diese Arbeit wurde von einem Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council (NSERC) Kanada Entdeckung Zuschuss (bis TJH) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Three shelf benchtop housing system |  Aquatic Habitats |
N/A | |
| 1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle | Aquatic Habitats |
N/A | |
| Pure Grain Ethanol | Luxco, INC |
N/A | |
| Ethovision XT Motion tracking software | Noldus Information Technology |
||
| Pipette | Eppendorf Canada |
||
| Light/Dark Arena | Custom | Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long. |
References
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