Introduction
דג הזברה (Danio rerio) הוא בעלי חוליות קטנים שמקורו בהודו שהוא אורגניזם מודל שימושי עבור 2,3 מחקר התנהגותי 1 והרפואי. דג הזברה גם משמש בבדיקות של חומרים תרופתיים שונים על מנת לאפיין את השפעתן על התנהגות. מינונים ולוחות זמנים של מתן תרופה שונים שימשו כדי לחקור את ההתנהגות של דג הזברה לאחר מתן תרכובות הכימי כגון חומרים ממריצים 4, anxiolytics 5 ואתנול 6-8.
המעבדה שלנו חקרה את ההשפעות של שונה לוחות זמנים של ממשל אתנול על חרדה ותנועת דג הזברה באור / חושך assay תוקף היטב 9, 20, גם המכונה גם assay scototaxic. שיטה חדשה של ממשל אתנול פותחה כדי להגביר את היעילות עבור ממשל חוזר ונשנה, מדי יום במשך תקופה ארוכה של זמן (21 ימים) 6 10-12. למרות ששיטה זו היא מקובלת מאוד, רשתות דג הזברה עשויה להגדיל את השונות בזמן שנדרש כדי להציג ולהסיר את הדגים מהפתרון התרופתי. לכן, החשיפה המדויקת למתחם של עניין עשויה להשתנות במהלך ניסוי מעורב מינון חוזר ונשנה. שיטה שמפחיתה מקורות שגיאה הנובעת מהשתנות בזמני תחבורה לכן רצויה. בשיטה שלנו אנו מסוגלים להעביר את כל הדגים בו זמנית, וכתוצאה מכך זמן מינון זהה בכל דגים. בעקבות חשיפת אתנול (שתוארה כאן), דג הזברה יכולה להיבדק בכל number של מבחני התנהגות, כוללים אלה שלהעריך חרדה. יש מינון קבוצות של דגים בשיטה החדשה שימושים מעשיים מעבר ליכולת לשכפל במדויק ולתקן מינון בין נושאים ובין קבוצות של דגים. כניסתו של תוכנה חדשה המאפשרת למעקב של דגים מרובים בבת אחת יכול לראות חוקרים להשתמש בשיטות שלנו כדי להבטיח replicability ודיוק בניסויים שלהם. בהתחשב בשימוש הנרחב בדג הזברה כאורגניזם מודל למדעי מוח ההתנהגותיים, שיטה זו תגביר את היעילות ומעשיות במחקרים פרמקולוגיים עתיד.
בפרדיגמה הנוכחית, לוח הזמנים של מינון חוזר ונשנה הועסקו כי כ משקף לוחות זמנים שתיית אדם. דגים חולקו באופן אקראי לאחת משלוש קבוצות: שליטה, יומי-מתונה, או שבועי בולמוס. לוח הזמנים של המינון היה 21 ימים בזמן, נבחר משום שהוא חרג באופן משמעותי זמני חשיפה במחקרים קודמים 7. דגי בקרה קיבלו אפס Alcoחול, דגים מדי יום-מתונים קיבלו 0.2% אלכוהול פעם ביום, ודגים שבועי בולמוס קיבלו 1.4% אלכוהול פעם בשבוע. משימת האור / החושך שימשה להערכת חרדה אחרי 2 ימים של נסיגה. זוהי בדיקה פשוטה יחסית לניהול המשתמש בזירה מלבנית שבה הקירות בצד אחד הם לבנים ובצד האחר הם 9 כהים. דג הזברה מבוגרת וחסונה מעדיפה את הצד האפל של הזירה בתנאי שליטה 6,9,13. חרדה מוגברת מוגדרת מבצעית כמו יותר זמן באופן משמעותי בילה באזור החשוך, וירידה בחרדה ניתן להניח כאשר הדגים מבלה את הזמן יחסית יותר בילה באזור האור. עם תוכנת תנועת מעקב, יכולים להיות גם לכמת משתנים אינפורמטיבי אחרים, כולל מהירות ממוצעת, חוסר תנועה, מתפתל, ואזור מעברים 14.
שיטת המינון שפותחה במעבדה שלנו יכולה לחול על כל מחקר שבו תרכובות מסיסים במים מנוהלות לzebrafi אחד או יותרsh. סוכנים תרופתיים רבים אחרים אשר עשוי להפיק תועלת ממתודולוגיה זו כרגע נבחנו בדג זברה. תרכובות שנבדקו בדרך כלל כוללות ניקוטין, chlordiazepoxide, buspirone, וscopolamine, אשר מומס באופן דומה לאתנול; על ידי ערבוב את הכמות המתאימה של החומר הכימי לתוך מים. לכן, ההיקף הכללי של הליך זה הוא הרבה יותר רחב ולא מוגבל לאתנול. יתר על כן, לאחר מינון עם תרופות למספר ימים, משימת האור / חושך היא רק אחד ממבחנים התנהגותיים רבים שיכולים להיות מועסק. לאחר מתן תרופה או במהלך נסיגה, מבחני פופולריים אחרים שניתן לנצלם יכללו את בדיקת טנק רומן צלילת 15 ובדיקות של התנהגות חברתית כגון shoaling 16. ההליך הבא מתאר שיטה יעילה להעברה שוב ושוב קבוצות של דגים או דגים בודדים לפתרונות המכילים תרכובת תרופתית של עניין. בנוסף, התהליך של חרדת בדיקה במבחן האור / החושךבקבוצות של דגים שנמצאים בנסיגה לאחר שנחשף ללוחות זמנים של ממשל אלכוהול ארוכים יתואר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים והבדיקות התנהגותיות אושרו על ידי בעלי החיים מחקר האתיקה מועצת המנהלים של אוניברסיטת MacEwan תחת מספר פרוטוקול 06-11-12, אשר עומד במועצה הקנדית להנחיות של הטיפול בבעלי חיים לטיפול ולשימוש בחיות ניסוי.
1. הכינו טנקים מינון, פתרונות, ולוח זמני מנהל
- הכן לוח זמנים של נטילה כך שבעלי החיים במינון באותה הסביבה ובאותה השעה ביום, כדי למנוע כל בלבול של זמן או הטיית לגירויים חזותיים.
- להשיג כמה שיותר, 1.5 ליטר, מיכלי ברור זהה השרצה פוליפרופילן כפי שיידרש למספר גדלי קבוצה. קבוצות שימוש של 8 דגים במכל, המאפשר לקבוצות של 2 דגים להיבדק ליום מאוחר יותר בהליך (ראה שלב 3). השתמש בטנק מחזיק אחד וטנק אחד מינון לכל קבוצה (2x מספר כולל של קבוצות).
- הנח 400 מיקרומטר מוסיף השרצה בכל הטנקים מחזיקים. Fחולה הטנקים עם מים בסביבה או להפוך מים אוסמוזה בטמפרטורה הנכונה (לדג זברה, 25-28 ° C) שעולה בקנה אחד עם דגי הטמפרטורה בדרך כלל שוכנים ב.
הערה: לא יכולה להיות אינטראקציות כימיות לא רצויות בין תרופות מסוימות והמרכיבים הכימיים של מים בסביבה שנאגרו. במצב זה, להשתמש במי אוסמוזה הפוכים שנאגרו עם מלחי האקווריום מינימאליים או ללא למתן תרופה, כמו גם לקבוצות ביקורת. - ודא שהטנקים הם בסביבה ניטראלית, כדי למנוע דגי אוויר לגירויים חזותיים חיצוניים במהלך מינון.
- הנח 400 מיקרומטר מוסיף השרצה בכל הטנקים מחזיקים. Fחולה הטנקים עם מים בסביבה או להפוך מים אוסמוזה בטמפרטורה הנכונה (לדג זברה, 25-28 ° C) שעולה בקנה אחד עם דגי הטמפרטורה בדרך כלל שוכנים ב.
- הכן את פתרון הסמים. מערבבים את הכמות המתאימה של התרופה עם מים בסביבה בטנקי ההשרצה. הכן את פתרון אתנול 0.2% על ידי שילוב של 3 מיליליטר של אתנול בדרגה גבוהה (95% אתנול שאינו מפוגל) עם 1,497 מיליליטר מים. הכן את פתרון אתנול 1.4% על ידי שילוב של 21 מיליליטר של אתנול עם 1,479 מיליליטר של מים.
2. בנוטינג דגים וEthanol מנהל סדר דין
- דגים נקי בזהירות ממיכלי הגידול שלהם והעברה למכל האחזקה המתאים המכיל את תוסף ההשרצה. באופן אידיאלי, בית הדגים בכנס ההשרצה לחסל קיזוז לגמרי.
- עם כל הדגים במכלי האחסון שלהם, בעדינות להרים את ההשרצה להכניס מתוך הטנק מחזיק ולמקם אותו לתוך מיכל המתאים הפתרון תרופתי (איור 1 א).
- רשום את זמן המינון כנדרש. השתמש 30 דקות בתמיסת אתנול להליך המתוארים כאן.
- במידת האפשר, יש עוזרים לעזור עם ההעברה של כל קבוצות הניסוי לפתרון התרופה בו זמנית כדי להבטיח זמן מינון מדויק. לחלופין, להעביר את הקבוצה אחת בכל פעם ולעקוב אחר הזמנים (איור 1 א) המינון של קבוצות בודדות.
- בתום תקופת המינון הנדרשת, להסיר את הדגים מפתרון אתנול על ידי ההרמה להכניס השרצה בזהירותמתוך פתרון הסמים והצבה בעדינות בחזרה לתוך הטנק מחזיק.
- בעדינות הנקי הדגים במכלי האחסון ומניח אותם בחזרה לבתי הגידול שלהם עד לפעם הבאה שנקבעה למינון, או הנח את ההשרצה להכניס בחזרה לתוך טנק ההחזקה לחסל רשת.
- כאמור, במידת האפשר במסגרת הפרמטרים של ציוד לבעלי חיים דיור, בית החיות באותו הטנק ולהוסיף השרצה המשמשת כמכל האחזקה. זה יהיה לבטל קיזוז לגמרי במהלך הליך הממשל.
3. בדיקות התנהגותיות
- להשיג אור / חושך זירה רחבה 9.5 סנטימטר על סנטימטר 55 ארוך ו9.5 סנטימטר עמוק עם רצפה עמיד למים לבן (איור 1). להדביק נייר שאינו רעיוני עמיד למים לבנים ושחור לקירות הפנימיים של הזירה באמצעות ולקרו, עם מחצית מהזירה מכוסה בלבן וחצי מכוסה בשחור. מלא את הזירה עד לעומק של 5 סנטימטרים עם מים בסביבה בטמפרטורה של 25-28 מעלות צלזיוס. שימורעין טמפרטורה זו בכל בדיקה.
- פחות על גירויים חזותיים חיצוניים על ידי בניית מתחם שלושה-צדדי לבן לזירה כדי להיות ממוקמת ב. ודא אזור הבדיקות יש לפזר תאורה עילית שאינו גורמת להשתקפויות על פני המים, עדיין הוא מספיק בהיר לתוכנת מעקב תנועה, או פוסט כימות מדריך ל-hoc מתמונות וידאו.
- הנח את הזירה במתחם ולהגדיר את הפרמטרים הקלטה וניתוח תנועה של תוכנת מעקב התנהגות. הגדר את משך זמן המשפט ל5-15 דקות, בהתאם לשאלת המחקר.
הערה: כאן, היינו 5 דקות. - הובלת הקבוצה של דגים להיבדק לאזור המחקר במכל הגידול ולמקם אותם מחוץ למתחם הזירה. להסתגל הדגים למשך 10 דקות.
- בעדינות נטו דגים מהקבוצה המתאימה והמקום במרכז האור / הזירה החשוכה, להיות בטוח כדי לשחרר את הדגים כשהוא ממוקם במקביל לצייר של הזירה הארוך לAVOid הטיית הדגים לאור או האזור חשוך.
- בגין התנהגות הקלטה מייד לאחר החיה הוא שוחרר. צפו לבעיות בתוכנה כל עם מעקב הדגים או לקפיצת דגים או הקפאה. סובב את הזירה 180 מעלות אחרי חצי מהנבדקים נבדקו כדי למנוע כל בלבול כתוצאה מהטיות הנובעות מאשר בסופו של הזירה מכוון לקראת הסוף הפתוח של המתחם.
- לאחר המשפט הסתיים, בעדינות נטו ולהסיר את הדגים מהזירה לתא מעצר או טנק בית גידול.
4. ניתוח
- לבחון את משך זמן באור לעומת אזורים כהים. לכל קבוצה וכל דגים, להשיג את הזמן היחסי בילה באזורים הבהיר וכהים ולנתח באמצעות דגימה אחת -test t (או המבחן Wilcoxon rank test לנתונים פרמטרית; הבדל מ( מחצית מכלל זמן המשפט) 150 שניות) כדי לקבוע אם קבוצות מעדיפות תחום אחד על פנים השני באופן משמעותי.
- כדי להשוות את העדפות, לחשב prefeמדד לורנס על ידי הפחתת המשך הזמן באזור האור מהזמן בילה באזור החשוך ולהשוות הבדלים בין קבוצות. בדיקות טריקו ניתן להשתמש כדי להשוות בין שתי קבוצות. השוואה בין קבוצות מרובות עם ניתוח חד-כיווני של שונות ניצול מבחן פוסט הוק HSD של Tukey שם (מבחן או קרוסקל-וואליס בהשוואה של דאן מרובה מבחן פוסט הוק לנתונים פרמטרית) הכרחי.
- שקלו את המהירות, מספר מעברי אזור, מתפתלים, וחוסר תנועה על פני קבוצות. משתמש בניתוח חד-כיווני של שונות ניצול מבחן פוסט הוק HSD של Tukey שם (מבחן או קרוסקל-וואליס בהשוואה של דאן מרובה מבחן פוסט הוק לנתונים פרמטרית) הכרחי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לשמור על דיוק ושליטה במחקרים פרמקולוגיים עם דג הזברה חשוב לעת את משך הזמן של ממשל אתנול באופן עקבי ומדויק כפי שתוארו לעיל. ההליך שלנו יכול להגדיל את קלות ותפוקה של הליך המינון. הממשל של אתנול על לוח זמנים או שבועי בולמוס או יומי-מתון הביא לרמות חרדה השתנו, שנמדדו באמצעות האור / בדיקה כהה, בהשוואה לקבוצת ביקורת. כאשר נבדקו יומיים לאחר המינון האחרון, דג הזברה בקבוצת הביקורת (שלא קיבלה כל אלכוהול, אך עדיין הועברו למכלי מינון) מוצג הדפוס הצפוי של התנהגות, עם ההוצאות של דגי שליטה באופן משמעותי יותר זמן בצד האפל של הזירה ( איור 2 א) דומה לדג זברה נאיבית במחקרים אחרים 6,9,13. דגים בקבוצת ההילולה השבועית לא הראו העדפה לאזורים או הבהיר או הכהים במשימה כאשר נבדקו יומיים לאחר מתן אתנול האחרון שלהם (איור 2 (איור 2 ג); בניגוד לקבוצת הביקורת. מדד ההעדפה הצביע הבדל משמעותי בין שליטה וקבוצות יומיות-מתונות (איור 2). לא היו הבדלים משמעותיים במהירות שחייה, או חוסר תנועה על פני קבוצות (טבלה 1), ולכן, השפעה זו לא הייתה בשל גירעון מוטורי בדגים.
איור 1:. העברת נוהל ו/ זירה החשוכה אור תמונות אלו ממחישות את הליך ההעברה (א) ראשית, הדגים נמצאים במכל ההעברה (משמאל).. מינון טנק המכיל אתנול הוא בתמונה (מימין). (BC) העברת הדגים ממכל ההעברה לפתרון אתנול דורש researcher להרים את המכסה של ההשרצה מחוץ למכל ההעברה ולתוך טנק פתרון אתנול. האור / זירה הכהה (ד) כפי שמודגמים נמדד רחב 9.5 סנטימטר על 9.5 סנטימטר עמוק וסנטימטר 55 ארוך. משמש לריצוף לבן, יחד עם קירות שחורים על מחצית מהזירה (משמאל) וקירות לבנים על החצי השני, יצירת אור ואזור כהה.
איור 2: תוצאות נציגים וtrackplots של הליך מינון אתנול על שלוש קבוצות של דג הזברה לאחר נסיגת 2 ימים. Trackplot נציג של נתיב תנועת דג הזברה שליטה יחיד המלווה את 5 דקות האור / המשפט הכהה (). להלן אותו trackplot דג הזברה מיוצגת כמו Heatmap, שהוא ייצוג צבעוני של תנועת דג הזברה לכל אורך המשפט, המבוסס על זמן הדגים שהו במיקום המיוצג על ידי כל פיקסל. Repres (B)trackplot entative של דג הזברה אחד מהקבוצה השבועית הבולמוס לאורך 5 דקות האור / המשימה כהה. להלן המפה החמה מאותו דג הזברה. (ג) trackplot נציג של תנועת דג הזברה יומית-מתונה יחידה המלווה את 5 דקות האור / המשפט הכהה. להלן המפה החמה מאותו דג הזברה. (ד ') מדד ההעדפה מחושב לכל הקבוצות על ידי הפחתת המשך זמן באזור האור מהזמן בילה באזור החשוך. מספרים שליליים מצביעים על העדפה לאזור החשוך. מספרים חיוביים מצביעים על העדפה לאזור האור. תוצאות מצביעות על הבדל משמעותי בהעדפה בין שליטה ויומית-מתונות קבוצות ב -2 ימים p * נסיגה <0.05 (בכיוון אחד ANOVA). שים לב שיש גם העדפה משמעותית לכהה בקבוצת הביקורת, p <0.05 (דגימה אחת -test t, הבדל בין 0), והעדפה משמעותית לאור בקבוצת הטיפול היומי-מתון, עמ 'מדגם <0.05 (אחד <em> לא -test, הבדל בין 0). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מהירות | אִי נַיָדוּת | |
| (סנטימטר / sec) | (שניות) | |
| 2 ימים WD | 2 ימים WD | |
| ביקורת (n = 13) | 9.1 ± 0.6 | 1.9 ± 0.6 |
| מוגזמת (n = 14) | 9.8 ± 0.5 | 0.8 ± 0.2 |
| כרוני (n = 15) | 10.3 ± 0.5 | 2.5 ± 1.0 |
טבלת 1: מהירות ממוצעת וחוסר תנועה במהלך בדיקת האור / חושך. מהירות הממוצעת לשחות (סנטימטר / sec) וחוסר התנועה (שניות) של קבוצה מייצגת של דג הזברה אחרי 2 ימים של נסיגה (ממוצע ± SEM). כאן, לא נמצא הבדלים משמעותיים בשתי מהירות או חוסר תנועה נמצאו. שימוש באישור מאל Holcombe et., (2013).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים קודמים הכוללים מתן תרופה בדג זברה פשוט הסתמכו על קיזוז דגים להעביר אותם מהטנק בביתם לפתרון התרופתי 12,16. בנוטינג לא תמיד עולה בקנה אחד ולעתים לוקח יותר זמן מהצפוי עקב תגובת הבריחה של דג הזברה, שבו יש השתנות אישית משמעותית. שיטות העברה מסורתיות, בעוד שימושי, ניתן לשפר על ידי הפחתת כמות הזמן כולל הדגים לבלות מחוץ למים, כמו גם להקטין את הכמות של השתנות בזמן העברה בין בעלי החיים. בנוסף לשיפור מעשיות, שיטה זו מאפשרת לחוקרים למינון קבוצות גדולות של דגים בו זמנית בפתרון לסכום מדויק של זמן. שיטות קודמות דורשות גם מינון דג בודד, או בניסיון לרווח הנקי של כל קבוצות של דגים בו זמנית. לשעבר הוא איטי ומפחית את התפוקה, ואילו השני הוא משימה מסורבלת וקשה. יתר על כן, כי ג מערכות מעקב תנועהלהעריך את התנהגותם של דגים מרובים בבת אחת יכול ליהנות מהדיוק של שיטה זו. דגים יכולים להיות מועברים ישירות מכנס ההשרצה לזירת shoaling, שיבטיח ליד חשיפה בו זמנית לזירה לכל הדגים.
ניצול שיטה חדשה זו הניבה תוצאות משמעותיות כאשר הוא מיושם בשלוש קבוצות של דג הזברה על פני תקופה של 21 יום. דגי בקרה לא קיבלו שום אלכוהול, דגים מדי יום-מתונים קיבלו כמות קטנה של אלכוהול פעם ביום, ודגים שבועי בולמוס קיבלו מנה גדולה של אלכוהול פעם בשבוע על פני התקופה של 21 היום. במשימת האור / חושך, הליך המינון לא שינה את ההעדפה הנורמלית של דג הזברה לאזור החשוך בתנאי שליטה. עם זאת, אחרי 2 ימים של נסיגת אתנול, דג הזברה בקבוצת הטיפול היומי-המתונה העדיפה אזור האור של הזירה, היפוך של העדפה. ניתוח סטטיסטי מאשר שינוי משמעותי בהעדפת אזור. יתכן כי מינון proceduמחדש הביא אתנול מחפש התנהגות בשל העדפה מותנית מקום (CPP), עם אתנול הדגים מחפשים (גירוי תיאבון), ומעדיף את האזור הלבן בשל דמיונה היחסי לאזור המינון הבהיר. מחקר שנערך לאחרונה מגלה כי CPP יכול להתרחש בדג זברה ובאזורים שבם דג הזברה הוא במינון עם אתנול 17,18. בולמוס-דגים שבועיים לא הראו העדפה 2 ימי הודעה אתנול, ולמרות שהראיות לגבי מנגנונים עצביים המהווים ממצא זה חסרה, ייתכן כי מינונים נדירים אך גדולים של אלכוהול עלולים לגרום נזק למוח, ואולי להשאיר דגים מסוגלים להבחין בין האזורים.
יתרון נוסף שהליך מינון זה מקנה לחוקרים הוא הכללתה. כפי שתואר, ההליך מייצר תוצאות ברורות ושימושיות בדג זברה. עם זאת, ההליך אינו מוגבל אך ורק לדג זברה. המגבלות על ההליך קשורות לגודל והגבולות של טנקים, בעלי החיים וטסטי מינוןמנגנון ng, כמו גם יכולת לנתח נתונים. עם השימוש בתוכנות מעקב תנועה, מחקרים שנעשו לאחרונה חקרו רבים משתנים נוספים ברחבי משפט. התרגלות לבנה הימנעות, ריבועים חצו, התרגלות תנועה, חביון לאזור הלבן, שחיה לא יציב, thigmotaxis (משך זמן סמוך לחומות הזירה), והערכת סיכונים ניתן לכמת 14. זה מתקבל על הדעת להשתמש בהליך זה באורגניזמים אחרים מודל, כגון דגי זהב, אשר היה בשימוש בעבר כדי לחקור את התפקיד של סובלנות ונסיגה 19. חוקרים מקווים שתחקורנה את ההשפעות של סוכנים תרופתיים אחרים או רעלנים סביבתיים, שימוש במבחנים אחרים התנהגות, או בעלי חיים ימיים או מים מתוקים אחרים, יכול גם לנצל המתודולוגיה בסיסית זו.
שימוש בפרוטוקול זה הוא פשוט ויעיל. עם זאת, אם תוצאות אינן כמצופה, לשקול פתרון בעיות מערכת מעקב התנועה כדי להבטיח איסוף נתונים מתאים. Trackinז צריך להיות חלק ומדויק על פני הניסויים. מערכת המעקב צריכה להיות הקלטת התנועה של הגוף-מרכז הדגים בכל העת. כל קפיצה או תנועה לא יציבה של המעקב dot בשל חפצים חזותיים, כגון השתקפויות אור על אדוות מים, או הגדרות מעקב נאותות עלולים לבלבל את התוצאות. פערים מסוימים בתוצאות עשויים לנבוע מהבדלים קטנים בעיצוב זירה או סביבות מינון. כדי להיות בטוח שכפול, הזירה צריכה להיות כפי שתוארה, במיוחד ביחס לשימוש ברצפה לבנה כדי למקסם את יעילות מעקב בדג זברה. עם דגים אחרים כי הם בהירים יותר בצבע, יש להשתמש ברצפה כהה כדי לסייע במעקב תנועה. בדומה לכך, מינון הדגים בסביבה כי הוא חופשי מכל גירויים חזותיים שיכול להטות את הדגים הוא מאוד חשוב. כל מובחן בצבע, דפוס או גוון שהוא perceivable לדגים יכול לבלבל את התוצאות. רקע דומה לזה במערכת הדיור ניטראלי, בהיר מומלץ. </ P>
אמנם זה אפשרי על מנת לשנות שיטה זו כפי שתידרש למינים אחרים של דגים, תוצאות עשויות להשתנות במונחים של אור המולדים / העדפה כהה 20-21. כמו כן, חשוב לשים לב גם ההליך המתואר כאן עדיין גורם לקצת מתח. למרות שהרשת קטנה באופן משמעותי, ההליך עדיין כרוך תקופה קצרה מאוד של זמן שבו הדג חייב להיות מחוץ למים, ואולי גרימת תגובת לחץ. רמזי ועמיתים 22 מצאו שדג זברה מרושתת כפול לפחות את הרמות הקורטיזול בגוף שלהם בהשוואה לאלו שלא מרושתים. מאז קורטיזול הוא הורמון קשור למתח 11 זה עשוי לשנות את התגובה התנהגותית שנמדדה. למרות שהשיטה שלנו מפחיתה את הרשת, הוא אינו מבטל אותו. עם זאת, הוא מאפשר לחוקרים ההזדמנות לחסל את השכיחות של רשת אם הם רוצים על ידי דג הזברה דיור במוסיף ההשרצה. מחקרים עתידיים צריכים לבדוק האם השימוש בinser ההשרצהלא להעברה של דגים יכול להפחית את תגובת לחץ יחסית לרשת. בנוסף, הוא מכריע בחשיבותו לשמירה פעמים מינון מדויקות ולהעביר את הזמנים בין קבוצות. שינויים במינון פעמים או הבדלים גדולים בזמן שבילו מחוץ למים יכולים לשנות את תוצאות. כדי להפחית את ההשפעות ביולוגי אפשריות, היא גם קריטית למינון הדגים בזמנים דומים של היום. בדגי הניסוי הנוכחיים היו במינון ונבדק 10:00-14:00. שכפול מדויק ואמין של הליך זה מסתמך על חזרה על הפרוטוקול עם דיוק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מודים יהושע גאלופ עבור שימוש בציוד הצילום שלו משמש לאיור 1. עבודה זו נתמכה על ידי מועצה למחקר הנדסת מענק גילוי קנדה (NSERC) מדעים וטבעיים (לTJH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Three shelf benchtop housing system |  Aquatic Habitats |
N/A | |
| 1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle | Aquatic Habitats |
N/A | |
| Pure Grain Ethanol | Luxco, INC |
N/A | |
| Ethovision XT Motion tracking software | Noldus Information Technology |
||
| Pipette | Eppendorf Canada |
||
| Light/Dark Arena | Custom | Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long. |
References
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews. 83 (1), 13-34 (2008).
- Langheinrich, U. Zebrafish: A new model on the pharmaceutical catwalk. BioEssays. 25 (9), 904-912 (2003).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Miller, N., Greene, K., Dydinski, A., Gerlai, R. Effects of nicotine and alcohol on zebrafish ( Danio rerio) shoaling. Behavioural brain research. , (2012).
- Bencan, Z., Sledge, D., Levin, E. D. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 94 (1), 75-80 (2009).
- Holcombe, A., Howorko, A., Powell, R. A., Schalomon, M., Hamilton, T. J. Reversed Scototaxis during Withdrawal after Daily-Moderate, but Not Weekly-Binge Administration of Ethanol in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (5), (2013).
- Mathur, P., Guo, S. Differences of acute versus chronic ethanol exposure on anxiety-like behavioral responses in zebrafish. Behavioural Brain Research. 219 (2), 234-239 (2011).
- Dlugos, C., Rabin, R. Ethanol effects on three strains of zebrafish: model system for genetic investigations. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2003).
- Maximino, C., et al. Scototaxis as anxiety-like behavior in fish. Nature Protocols. 5 (2), 209-216 (2010).
- Gerlai, R., Lee, V., Blaser, R. Effects of acute and chronic ethanol exposure on the behavior of adult zebrafish (Danio rerio). Pharmacology Biochemistry and Behavior. 85 (4), 752-761 (2006).
- Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural brain research. 205 (1), 38-44 (2009).
- Gebauer, D. L., et al. Effects of anxiolytics in zebrafish: Similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and ethanol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 99 (3), 480-486 (2011).
- Serra, M. C., Mattioli, R. Natural preference of zebrafish (Danio rerio) for a dark environment. Braz J Med Biol Res. 32 (12), 1551-1553 (1999).
- Maximino, C., et al. Behavioral and neurochemical changes in the zebrafish leopard strain. Genes Brain Behav. 12 (5), 576-582 (2013).
- Levin, E. D., Bencan, Z., Cerutti, D. T.
- Gerlai, R., Chatterjee, D., Pereira, T., Sawashima, T., Krishnannair, R. Acute and chronic alcohol dose: population differences in behavior and neurochemistry of zebrafish. Genes, Brain and Behavior. 8 (6), 586-599 (2009).
- Mathur, P., Berberoglu, M. A., Guo, S. Preference for ethanol in zebrafish following a single exposure. Behavioural Brain Research. 217 (1), 128-133 (2011).
- Renninger, S. L., et al. Investigating the genetics of visual processing, function and behaviour in zebrafish. Neurogenetics. 12, 97-116 (2011).
- Crawshaw, L. I., et al. Tolerance and withdrawal in goldfish exposed to ethanol. Physiology & Behaviour. 87 (3), 460-468 (2006).
- Hamilton, T. J., Holcombe, A. Tresguerres, M.CO2-induced ocean acidification increases anxiety in rockfish via alteration of GABAA receptor functioning. Proceedings of the Royal Society B. , (2014).
- Ramsay, J. M., Feist, G. W., Varga, Z. M., Westerfield, M., Kent, M. L., Schreck, C. B. Whole-body cortisol response of zebrafish to acute net handling stress. Aquaculture. 297 (1-4), 157-164 (2009).
- Hamilton, T. J., Paz-Yepes, J., Morrison, R. A., Palenik, B., Tresguerres, M. Exposure to bloom-like concentrations of two marine Synechococcus cyanobacteria (strains CC9311 and CC9902) differentially alters fish behaviour. Conservation Physiology. 2 (1), (2014).
