Introduction
Sebrafisk (Danio rerio) er en liten teleost arter med opprinnelse i India som er en nyttig modellorganisme for atferds 1 og medisinsk forskning 2,3. Sebrafisk er også ofte brukt i testing av forskjellige farmakologiske stoffer for å karakterisere deres innvirkning på virkemåten. Ulike doser og tidsplaner av Drug Administration har blitt brukt til å undersøke oppførselen til sebrafisk etter administrering av forbindelser som sentralstimulerende midler 4, anxiolytika 5 og etanol 6-8.
Vår lab har undersøkt effekten av ulike tidsplaner av etanol administrasjon på sebrafisk angst og locomotion i godt validert lys / mørk assay 9, 20, også ofte referert til som den scototaxic analysen. En ny fremgangsmåte for administrering etanol ble utviklet for å øke effektiviteten for repeterende, daglig administrering over en lengre tidsperiode (21 dager) 6 10-12. Selv om denne metoden er allment akseptert, kan netting sebrafisk øke variasjonen i den tid det tar for å innføre og fjerne fisken fra medikamentløsning. Derfor kan den nøyaktige eksponering for forbindelsen av interesse variere i løpet av et eksperiment som involverer gjentatt dosering. En fremgangsmåte som reduserer feilkilder som stammer fra variasjoner i transporttider er således ønskelig. Med vår metode er vi i stand til å flytte all fisk samtidig, noe som resulterer i samme dosering tid på hver fisk. Etter etanol eksponering (beskrevet her), kan sebrafisk bli testet i noen number av atferdsanalyser, inkludert de som vurdere angst. Doserings grupper av fisk ved hjelp av den nye fremgangsmåten har praktiske anvendelser utover evnen til å replikere og standardisere nøyaktig dosering mellom forsøksgruppene og på tvers av fisken. Ankomsten av ny programvare som gjør det mulig for sporing av flere fisk på en gang kan se forskerne utnytte våre metoder for å sikre replikerbarhet og nøyaktighet i sine eksperimenter. Tatt i betraktning den utbredte bruken av sebrafisk som modellorganisme for Biologisk psykologi, vil denne metoden øke effektiviteten og funksjonalitet i fremtidige farmakologiske studier.
I den nåværende paradigme, ble en gjentatt dosering tidsplan ansatt at ca speiler menneskelige drikking tidsplaner. Fisk ble randomisert til en av tre grupper: kontroll, daglig moderat eller ukentlig-binge. Doseringsplan var 21 dager i varighet, valgt fordi det betydelig overskredet eksponeringstider i tidligere studier 7. Kontrollfisken fikk null Alcohol, fikk daglig moderat fisk 0,2% alkohol en gang per dag, og ukentlig-binge fisk fikk 1,4% alkohol en gang per uke. Den lys / mørke oppgaven ble brukt til å vurdere angst etter 2 dager med tilbaketrekning. Dette er en relativt enkel test for å administrere som bruker en rektangulær arena hvor veggene på den ene siden er hvite og på den andre siden er mørk 9. Voksen sebrafisk robust foretrekker den mørke siden av arenaen etter kontrollforhold 6,9,13. Økt angst er operasjonelt definert som betydelig mer tid tilbrakt i den mørke sonen, og redusert angst kan antas når fisken tilbringer relativt mer tid tilbrakt i lys sone. Med motion-sporing av programvare, kan andre informative variabler også kvantifiseres, inkludert gjennomsnittlig hastighet, immobilitet, meandrerende, og sone overganger 14.
Doserings metode utviklet i vårt laboratorium kan gjelde for en hvilken som helst undersøkelser hvori vannoppløselige forbindelser blir administrert til et eller flere zebrafish. Mange andre farmakologiske midler som kan dra nytte av denne metoden blir nå testet i sebrafisk. Vanligvis testede forbindelser innbefatter nikotin, klordiazepoksid, buspiron, og skopolamin, som oppløses i en lignende måte som etanol; ved å blande den passende mengde av den kjemiske i vann. Derfor er det generelle omfanget av denne fremgangsmåten mye bredere og ikke begrenset til etanol. Videre etter dosering med narkotika for flere dager, er det lys / mørk oppgave bare ett av mange atferdsmessige tester som kan anvendes. Etter Drug Administration eller ved seponering, andre populære analyser som kan benyttes inkluderer romanen tank dykking test 15 og tester av sosial atferd som stiming 16. Følgende prosedyre vil skissere en effektiv metode for gjentatte ganger å overføre grupper av fisk eller enkeltfisk i løsninger som inneholder en farmakologisk forbindelse av interesse. I tillegg har prosessen med testing angst med lys / mørk testi grupper av fisk som er i tilbaketrekning etter å ha blitt utsatt for lange tidsplaner for administrering alkohol vil bli beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer og atferds testing ble godkjent av MacEwan universitetets Animal forskningsetikk skapet iht protokoll nummer 06-11-12, som er i overensstemmelse med Canadian Council for Animal Care retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr.
1. Forbered Doserings Tanks, løsninger og Administrasjon Schedule
- Forbered en administrasjon tidsplan slik at dyrene doseres i det samme miljøet og i løpet av samme tid på dagen for å unngå eventuelle confounds tid eller forspenning på visuelle stimuli.
- Få så mange identiske, 1.5 L, klare polypropylen gytetanker som er nødvendige for antall gruppestørrelser. Bruk grupper av 8 fisk per tank, noe som gir mulighet for to grupper av fisk som skal testes pr dag senere i fremgangsmåten (se trinn 3). Bruk en oppsamlingstank og en doseringstank per gruppe (2x totalt antall grupper).
- Plasser 400 mikrometer gyte innstikk i alle septiktanker. Fill tankene med vann habitat eller revers osmose vann med riktig temperatur (for sebrafisk, 25-28 ° C) som ikke er i overensstemmelse med den temperatur fisken blir normalt plassert på.
MERK: Det kan være uønskede kjemiske interaksjoner mellom noen stoffer og de kjemiske komponentene i bufret habitat vann. I denne situasjonen, kan du bruke omvendt osmose vann bufret med minimale eller ingen akvarium salter for Drug Administration, samt for kontrollgruppene. - Sikre at tankene er i et nøytralt miljø for å unngå condition fisk til eksterne visuelle stimuli under dosering.
- Plasser 400 mikrometer gyte innstikk i alle septiktanker. Fill tankene med vann habitat eller revers osmose vann med riktig temperatur (for sebrafisk, 25-28 ° C) som ikke er i overensstemmelse med den temperatur fisken blir normalt plassert på.
- Forbered stoffet løsning. Blande den passende mengde av legemidlet med habitat vann i gytetankene. Klargjør 0,2% etanolløsning ved å kombinere 3 ml av en høy grad av etanol (95% ikke-denaturert ethanol) med 1497 ml vann. Klargjør 1,4% etanolløsning ved å kombinere 21 ml etanol med 1479 ml vann.
2. Netting Fish og EtMetanol Administration Prosedyre
- Nøye netto fisk fra deres habitat stridsvogner og overføring inn i riktig septiktanken som inneholder gyte innsatsen. Ideelt huse fisk i gyteinnsats for å eliminere netting helt.
- Med all fisk i sine respektive holdingtanker, forsiktig løfte gyte sette ut av septiktanken og sett den inn i riktig legemiddel tanken (figur 1A).
- Ta opp doserings tid som kreves. Bruk 30 min i etanol-løsning for fremgangsmåten beskrevet her.
- Hvis det er mulig, har assistenter hjelpe med overføring av alle eksperimentelle gruppene til stoffet løsningen samtidig for å sikre nøyaktig dosering tid. Alternativt overføre en gruppe om gangen og holde oversikt over enkeltgrupper 'dosering ganger (figur 1A).
- Ved slutten av den nødvendige doseringsperioden, fjernes fisken fra etanol-løsning ved forsiktig å løfte gyteinnsatsenut av medikamentløsning og plassere forsiktig tilbake inn i holdetanken.
- Forsiktig netto fisken i å holde tankene og plassere dem tilbake i deres leveområder til neste planlagte dosering gang, eller plasser gyte sette tilbake i septiktanken for å eliminere netting.
- Som nevnt tidligere, hvis det er mulig innenfor rammene av animalsk boliger utstyr, house dyrene i samme tank og gyting innsats som brukes som septiktanken. Dette vil eliminere netting helt i løpet av administrasjonsmåten.
3. Behavioral Testing
- Skaff en lys / mørk arena 9,5 cm bred og 55 cm lang og 9,5 cm dype med en hvit vanntett gulv (figur 1B). Fest hvit og svart vanntett ikke-reflekterende papir til innsiden av veggene i arenaen ved hjelp av borrelås, med halvparten av arenaen dekket i hvit og halvt dekket i svart. Fyll arenaen til en dybde på 5 cm med habitat vann ved en temperatur på 25-28 ° C. Maintain denne temperaturen gjennom testing.
- Minimal eksterne visuelle stimuli ved å konstruere en hvit tre-sided kabinett for arenaen å være plassert i. Sørg for at testing området har diffuse overhead belysning som ikke forårsaker refleksjoner på vannoverflaten, men likevel er tilstrekkelig lys for bevegelsen sporing av programvare, eller post -hoc manuell kvantifisering av videobilder.
- Plasser arena i boksen og sett opptaket og bevegelse analyseparametere av oppførselen sporing av programvare. Sett rettssaken varighet til 5-15 min, avhengig av problemstillingen.
MERK: Her har vi brukt 5 min. - Transportere gruppen av fisk som skal testes til forskningsområdet i habitat tank og plassere dem utenfor arenaen kabinett. Akklimatisere fisken i 10 min.
- Forsiktig net en fisk fra den aktuelle gruppen, og plasser i sentrum av lys / mørk arena, være sikker på å slippe fisken når den er plassert parallelt med den lange aksen av arenaen til avoid forspenning av fisken for lys eller mørk sone.
- Starte innspillingen atferd umiddelbart etter at dyret er utgitt. Se etter eventuelle programvare problemer med å spore fisk eller for fisk hopping eller frysing. Roter arenaen 180 ° etter halvparten av fagene har blitt testet for å forhindre eventuelle confounds grunn av skjevheter som følge av hvilken ende av arenaen er orientert mot den åpne enden av kabinettet.
- Etter rettssaken er avsluttet, forsiktig net og fjerne fisken fra arena til en oppsamlingstank eller habitat tank.
4. Analyse
- Undersøke tidsbruk i lys kontra mørke soner. For hver gruppe og hver fisk, få den relative tid i de lyse og mørke soner og analysere ved hjelp av en sample t-test (eller Wilcoxon signert rank test for nonparametric data, forskjellen fra (halvparten av den totale prøvetiden) 150 sek) for å bestemme om gruppene signifikant foretrekker et område over det andre.
- Å sammenligne preferanser, beregne en preferanseindeksen ved å trekke fra tid brukt i lys sonen fra tiden i den mørke sonen og sammenligne forskjeller mellom gruppene. t- tester kan brukes til å sammenligne to grupper. Sammenligne flere grupper med en enveis variansanalyse utnytte Tukey HSD post hoc test der det er nødvendig (eller Kruskal-Wallis test med Dunn multiple sammenlignings post hoc test for nonparametric data).
- Sammenligne hastighet, antall sone overganger, meandrerende, og immobilitet på tvers av grupper. Bruk enveis variansanalyse utnytte Tukey HSD post hoc test der det er nødvendig (eller Kruskal-Wallis test med Dunn multiple sammenlignings post hoc test for nonparametric data).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å opprettholde nøyaktighet og kontroll i farmakologiske studier med sebrafisk er det viktig å tid varigheten av etanol administrering konsekvent og nøyaktig som beskrevet ovenfor. Vår prosedyre kan øke den enkle og gjennomstrømning av doserings prosedyren. Administrasjonen av etanol på enten en ukentlig-binge eller daglig moderat timeplanen resulterte i endrede angst nivåer, målt med lys / mørk test, sammenlignet med kontroller. Når testet to dager etter siste dosering, sebrafisk i kontrollgruppen (som fikk ingen alkohol, men ble likevel flyttet til doseringstanker) vises den forventede atferdsmønster, med kontrollfisken tilbringe betydelig mer tid på den mørke siden av arenaen ( Figur 2A) ligner naive sebrafisk i andre studier 6,9,13. Fisk i den ukentlige binge gruppen viste ingen preferanse for enten lyse eller mørke soner i oppgave når testet to dager etter sin siste etanol administrasjon (figur 2B (figur 2C); i motsetning til kontrollgruppen. Preferansen indeksen indikerte en signifikant forskjell mellom kontroll og daglig moderate grupper (figur 2D). Det var ingen signifikante forskjeller i svømmehastighet, eller immobilitet tvers grupper (Tabell 1), og derfor var denne effekten ikke skyldes en motor underskudd i fisken.
Figur 1:. Transfer Prosedyre og lys / mørk arena Disse bildene illustrerer overføring prosedyre (A) Først blir fisken ligger i overføringstank (til venstre).. Doserings tank som inneholder etanol er avbildet (høyre). (BC) Ved å flytte fisk fra overføringstank til etanolløsning krever researcher å løfte gytetikket ut av overføringstanken og inn i etanol tanken. (D) lys / mørk arena som illustrert målt 9,5 cm bred og 9,5 cm dyp og 55 cm lange. Hvitt gulv er brukt, sammen med sorte vegger på halvparten av arenaen (til venstre) og hvite vegger på den andre halvdelen, og skaper en lys og mørk sone.
Figur 2: Representative resultater og trackplots etanol doseringsmåten på tre grupper av sebrafisk etter 2 dager tilbaketrekking. (A) En representant trackplot av en enkelt kontroll sebrafisk bevegelsesbanen i hele 5 min lys / mørk rettssaken. Nedenfor er det samme sebrafisk trackplot representert som en heatmap, som er en farget representasjon av sebrafisk bevegelse i hele prøveperioden, basert på den tiden fisken brukt i stedet representert ved hver piksel. (B) en Representative trackplot av en enkelt sebrafisk fra den ukentlige-binge gruppen hele 5 min lys / mørk oppgave. Nedenfor er heatmap fra samme sebrafisk. (C) En representant trackplot av en enkelt daglig moderat sebrafisk bevegelse i hele 5 min lys / mørk rettssaken. Nedenfor er heatmap fra samme sebrafisk. (D) Preferanseindeksen ble beregnet for alle grupper ved å trekke tidsbruk i lys sone fra tid tilbrakt i den mørke sonen. Negative tall indikerer preferanse for den mørke sonen. Positive tall indikerer preferanse for lys sone. Resultatene indikerer en signifikant forskjell i innstillingen mellom kontroll og daglig-grupper ved moderate 2 dager tilbaketrekking * p <0,05 (én-veis ANOVA). Legg merke til det er også en betydelig preferanse for mørke i kontrollgruppen, p <0,05 (én prøve t-test, forskjellen mellom 0), og en signifikant preferanse for lyset i den daglige-moderat gruppe, p <0,05 (én prøve <em> t-test, forskjellen fra 0). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Velocity | Immobilitet | |
| (Cm / sek) | (Sek) | |
| 2-dagers Wd | 2-dagers Wd | |
| Kontroll (n = 13) | 9.1 ± 0.6 | 1.9 ± 0.6 |
| Binge (n = 14) | 9.8 ± 0.5 | 0,8 ± 0,2 |
| Kronisk (n = 15) | 10.3 ± 0.5 | 2.5 ± 1.0 |
Tabell 1: Gjennomsnittlig hastighet og immobilitet løpet av lys / mørke test. Den gjennomsnittlige svømme hastighet (cm / sek) og immobilitet (sek) av en representativ gruppe av sebrafisk etter 2 dager med tilbaketrekking (gjennomsnitt ± SEM). Her ble ingen signifikante forskjeller i enten hastighet eller immobilitet funnet. Brukt med tillatelse fra Holcombe et al., (2013).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere studier som involverer narkotika administrasjonen i sebrafisk har bare stolt på netting fisk å transportere dem fra sine hjem tanken inn i stoffet løsningen 12,16. Netting er ikke alltid konsekvent og ofte tar lengre tid enn forventet på grunn av fluktrespons av sebrafisk, som har betydelig individuell variasjon. Tradisjonelle overføringsmetoder, mens nyttig, kan forbedres ved å redusere mengden av total tid fisken bruker utsiden av vann, så vel som å redusere mengden av variasjon i overføringstiden mellom dyr. I tillegg til å forbedre praktiske, gir denne metoden forskere evnen til å dosere store grupper av fisk samtidig i en løsning for en nøyaktig mengde av tid. Tidligere metoder krever enten dosering en eneste fisk, eller forsøker å netto hele grupper av fisk samtidig. Den førstnevnte er langsom og minsker gjennomstrømningen, mens den sistnevnte er en upraktisk og vanskelig oppgave. Videre bevegelsessporingssystemer som cen vurdere oppførselen til flere fisk samtidig kan dra nytte av presisjonen av denne metoden. Fisk kunne overføres direkte fra gyte innsatsen i stiming arena, noe som ville sikre nær samtidig eksponering for arenaen for all fisk.
Ved hjelp av denne nye fremgangsmåte produserte signifikante resultater når implementert på tre grupper av sebrafisk i løpet av en 21 dagers periode. Kontroll fisk mottok ingen alkohol, daglig moderat fisk fått en liten mengde alkohol en gang per dag, og ukentlig-binge fisk mottok en stor dose av alkohol en gang per uke i løpet av den 21 dagers periode. I lys / mørk oppgave, gjorde doseringsprosedyren ikke endre normal preferanse for sebrafisk for den mørke sone under kontroll forhold. Men etter to dager med etanol tilbaketrekking, sebrafisk i det daglige moderat gruppe foretrukne lys sone på arenaen, en reversering av preferanse. Statistisk analyse bekrefter en betydelig endring i sone preferanse. Det er mulig at doserings procedure resulterte i etanol søker oppførsel på grunn av en betinget sted preferanse (CPP), med fisken søker etanol (appetitive en stimulus), og foretrakk den hvite sone på grunn av sin relative likheten til den lyse doseringsområdet. Nyere forskning viser at CPP kan oppstå i sebrafisk og i områder der sebrafisk doseres med etanol 17,18. Ukentlig binge-fisk viste ingen preferanse to dager etter etanol, og selv om bevis om nevrale mekanismer utgjør dette funnet er mangler, er det mulig at sjeldne, men store doser av alkohol kan skade hjernen, muligens forlater fisk ute av stand til å diskriminere mellom sonene.
En annen fordel at dette doserings prosedyren skjenker forskere er dens generalizability. Som beskrevet, produserer prosedyren klare og nyttige resultater i sebrafisk. Imidlertid er fremgangsmåten ikke begrenset utelukkende til sebrafisk. Begrensninger på prosedyren er knyttet til størrelsen og grenser for doserings tanker, dyr og testing apparat, så vel som evnen til å analysere data. Med bruk av bevegelsessporing programvare, har nyere studier undersøkt mange flere variabler gjennom en rettssak. Hvit unngåelse tilvenning, firkanter krysset, locomotion tilvenning, ventetid til den hvite sonen, uberegnelig svømming, thigmotaxis (tidsbruk nær arenaen vegger), og risikovurdering kan også kvantifiseres 14. Det er tenkelig å bruke denne fremgangsmåten i andre modellorganismer, slik som gullfisk, som har vært anvendt tidligere for å undersøke rollen til toleranse og fjerning 19. Forskere håper å undersøke effekten av andre farmakologiske midler eller miljøgifter, bruk av andre atferdsanalyser, eller andre dyr marine eller ferskvann, kan også benytte denne grunnleggende metodikk.
Ved hjelp av denne protokollen er enkel og effektiv. Men hvis resultatene ikke blir som forventet, bør du vurdere feilsøking av motion-tracking system for å sikre riktig datainnsamling. Tracking skal være jevn og nøyaktig på tvers av forsøkene. Sporingssystemet bør opptak av bevegelse av kroppen-sentrum av fisken til alle tider. Enhver hopping eller uberegnelige bevegelse av sporing prikk på grunn av visuelle gjenstander, som for eksempel lysreflekser på vann krusninger, eller uriktig sporing innstillinger kan skamme resultater. Noen avvik i resultater kan oppstå fra små forskjeller i arena design eller doserings miljøer. For å være sikker på replikasjon, bør arenaen være som beskrevet, spesielt med hensyn til å bruke et hvitt gulv for å maksimere relativ effektivitet i sebrafisk. Med andre fisk som er lysere i fargen, bør et mørkt gulv brukes til hjelp i bevegelsessporing. Tilsvarende doserings fisken i et miljø som er fritt for eventuelle visuelle stimuli som kan tenkes å forspenne fisken er ekstremt viktig. Enhver distinkt farge, mønster eller fargetone som er lesbar for fisken kan forvirre resultater. En nøytral, lys farget bakgrunn lik som i boligsystem. </ P>
Mens det er mulig å endre denne metoden som er nødvendig for andre fiskearter, kan resultatene variere i form av medfødt lys / mørk preferanse 20-21. Det er også viktig å merke seg selv den prosedyre som er beskrevet her fremdeles forårsaker noen belastning. Selv om nettingen er betydelig redusert, prosedyren fortsatt innebærer en svært kort tidsperiode hvor fisken må være ute av vann, eventuelt indusere en stressrespons. Ramsay og kolleger 22 opplevde at netted sebrafisk hadde minst doble nivåene av kortisol i kroppen sammenlignet med de som ikke ble utlignet. Siden kortisol er et hormon knyttet til stress 11 kan dette endre atferdsrespons som er målt. Mens vår metode reduserer netting, betyr det ikke eliminere den. Imidlertid, det gir forskerne mulighet for å eliminere forekomsten av netting hvis de ønsker ved boliger sebrafisk i gyteinnsatser. Fremtidige studier bør undersøke om bruk av gyte innsettingt for overføring av fisk kan redusere stressrespons relativt til nettingen. I tillegg er det avgjørende viktig for å opprettholde nøyaktige doseringstider og overføre ganger mellom gruppene. Endringer i dosering ganger eller store forskjeller i tid brukt ute av vannet kan endre resultatene. For å redusere mulige biologiske effekter, er det også viktig å dosere fisken under lignende tider av døgnet. I dagens eksperiment fisken ble dosert og testet mellom 10 AM og 14:00. Nøyaktig og pålitelig replikasjon av denne fremgangsmåten er avhengig av protokollen gjentatt med presisjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erkjenner Joshua Gallup for bruk av sin fotografering utstyr som brukes til figur 1. Dette arbeidet ble støttet av en naturvitenskap og Engineering Research Council (NSERC) Canada Discovery stipend (til TJH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Three shelf benchtop housing system |  Aquatic Habitats |
N/A | |
| 1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle | Aquatic Habitats |
N/A | |
| Pure Grain Ethanol | Luxco, INC |
N/A | |
| Ethovision XT Motion tracking software | Noldus Information Technology |
||
| Pipette | Eppendorf Canada |
||
| Light/Dark Arena | Custom | Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long. |
References
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews. 83 (1), 13-34 (2008).
- Langheinrich, U. Zebrafish: A new model on the pharmaceutical catwalk. BioEssays. 25 (9), 904-912 (2003).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Miller, N., Greene, K., Dydinski, A., Gerlai, R. Effects of nicotine and alcohol on zebrafish ( Danio rerio) shoaling. Behavioural brain research. , (2012).
- Bencan, Z., Sledge, D., Levin, E. D. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 94 (1), 75-80 (2009).
- Holcombe, A., Howorko, A., Powell, R. A., Schalomon, M., Hamilton, T. J. Reversed Scototaxis during Withdrawal after Daily-Moderate, but Not Weekly-Binge Administration of Ethanol in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (5), (2013).
- Mathur, P., Guo, S. Differences of acute versus chronic ethanol exposure on anxiety-like behavioral responses in zebrafish. Behavioural Brain Research. 219 (2), 234-239 (2011).
- Dlugos, C., Rabin, R. Ethanol effects on three strains of zebrafish: model system for genetic investigations. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2003).
- Maximino, C., et al. Scototaxis as anxiety-like behavior in fish. Nature Protocols. 5 (2), 209-216 (2010).
- Gerlai, R., Lee, V., Blaser, R. Effects of acute and chronic ethanol exposure on the behavior of adult zebrafish (Danio rerio). Pharmacology Biochemistry and Behavior. 85 (4), 752-761 (2006).
- Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural brain research. 205 (1), 38-44 (2009).
- Gebauer, D. L., et al. Effects of anxiolytics in zebrafish: Similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and ethanol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 99 (3), 480-486 (2011).
- Serra, M. C., Mattioli, R. Natural preference of zebrafish (Danio rerio) for a dark environment. Braz J Med Biol Res. 32 (12), 1551-1553 (1999).
- Maximino, C., et al. Behavioral and neurochemical changes in the zebrafish leopard strain. Genes Brain Behav. 12 (5), 576-582 (2013).
- Levin, E. D., Bencan, Z., Cerutti, D. T.
- Gerlai, R., Chatterjee, D., Pereira, T., Sawashima, T., Krishnannair, R. Acute and chronic alcohol dose: population differences in behavior and neurochemistry of zebrafish. Genes, Brain and Behavior. 8 (6), 586-599 (2009).
- Mathur, P., Berberoglu, M. A., Guo, S. Preference for ethanol in zebrafish following a single exposure. Behavioural Brain Research. 217 (1), 128-133 (2011).
- Renninger, S. L., et al. Investigating the genetics of visual processing, function and behaviour in zebrafish. Neurogenetics. 12, 97-116 (2011).
- Crawshaw, L. I., et al. Tolerance and withdrawal in goldfish exposed to ethanol. Physiology & Behaviour. 87 (3), 460-468 (2006).
- Hamilton, T. J., Holcombe, A. Tresguerres, M.CO2-induced ocean acidification increases anxiety in rockfish via alteration of GABAA receptor functioning. Proceedings of the Royal Society B. , (2014).
- Ramsay, J. M., Feist, G. W., Varga, Z. M., Westerfield, M., Kent, M. L., Schreck, C. B. Whole-body cortisol response of zebrafish to acute net handling stress. Aquaculture. 297 (1-4), 157-164 (2009).
- Hamilton, T. J., Paz-Yepes, J., Morrison, R. A., Palenik, B., Tresguerres, M. Exposure to bloom-like concentrations of two marine Synechococcus cyanobacteria (strains CC9311 and CC9902) differentially alters fish behaviour. Conservation Physiology. 2 (1), (2014).
