Abstract
可以在体外进行的视网膜色素上皮（RPE）细胞，光感受器外节（POS）的花费老化远端片段的吞噬的重要功能之一的分析。光感受器外节与栈含有光转机械膜质盘被连续更新的在视网膜上。花了POS是由视网膜色素上皮细胞每天淘汰。啮齿动物，猪/牛和人RPE细胞识别以类似的方式，从不同物种的POS。为了便于进行大系列很少变性的实验中，一个大的股票的POS可以从猪眼来分离和冷冻储存在等分试样。该协议需要时蒙在鼓里中显示橙色的感光色素的特性优势。在昏暗的红灯，视网膜被收集在从切成两半打开眼罩的缓冲区。视网膜细胞悬浮液均化，过滤，并上样到一个连续的蔗糖梯度。岑后trifugation，POS位于一个离散的频带中具有特性橙色渐变的上部。 POS然后收集，纺丝，在洗涤缓冲液再悬浮依次计数并等分。可用于吞噬作用测定法和蛋白激活，定位或相互作用的POS激发后的不同时间分析得到这样的POS。此外，POS可以标记荧光， 例如 ，FITC，等分的POS随后的荧光定量结合或吞噬之前。其他可能的应用包括使用改性的POS或POS挑战结合胁迫条件，研究氧化应激或RPE细胞老化的作用。
Introduction
在视网膜，视力是由光敏分子，称为视蛋白，被转化成可在神经元之间向上传送到视觉区域在大脑中的信号之前的异构触发。这些分子被嵌入在叠层膜的磁盘类似，构成感光细胞外节的部分（PRS）的煎饼。受到恒定曝光，因此，相当大的水平的氧化应激，收受不断更新它们的外节段，以限制潜在的氧化损伤。光感受器外节是与相邻的视网膜色素上皮（RPE）细胞的顶端微绒毛紧密接触。视网膜色素上皮细胞构成的血-视网膜屏障的外部部分，并确保许多任务，这对于光感受器的健康和功能1是至关重要的，例如经由黑色素颜料，再异构化光反应视蛋白成分的视网膜，提供营养物和克淬火光线rowth因素，参与PR代谢产物处置。
此外，RPE细胞消除花费POS和回收它们的组件，一个由昼夜节律在哺乳动物视网膜2,3调节每日占领。棚的POS的间隙为PR生存绝对必要的。当它被完全废除，POS碎片累积和永久退化造成快速视力下降4,5。如果有节奏的配置文件丢失，通过不断的活动取代，PR和RPE缺陷积累与6岁。因此，这是非常重要的，以便了解表型与它的功能障碍以表征RPE吞噬作用的分子调控体外 。有趣的是，在视网膜色素上皮细胞的分子机制非常类似于使用由巨噬细胞清除凋亡细胞的1和两者都依赖于识别暴露磷脂酰丝氨酸上吞噬碎片7-9。仍然，RPE细胞和巨噬细胞调节pH值agocytosis不同，如巨噬细胞相遇时选择立即消除凋亡细胞的同时RPE细胞有节奏，每天吞噬POS只有一次，尽管他们与外节永久接触。这表明，还没有完全理解特定调节机制。
许多牵连的视网膜色素上皮细胞吞噬机械的分子已被确定或确认由于使用分离的POS和细胞培养物的吞噬作用测定法。与其配体MFG-E8位于RPE顶端细胞表面上的alphavbeta5整联蛋白受体，在协调，特异性结合的POS 10-12，其然后经由MERTK酪氨酸激酶受体13-15内在化。的CD36的清道夫受体已经显示参与POS摄取并影响其速度16,17，和可作为氧化磷脂在POS表面18的传感器。内在需要F-肌动蛋白细胞骨架屁股招聘ociated蛋白例如膜联 蛋白2 19，肌球蛋白II 20和肌球蛋白VIIA 21,22。 体外天然或氧化的POS也利用来理解RPE细胞的体内连接于消化的不良氧化的POS 23-28中累积的衰老表现型。从干细胞的RPE细胞的产生已经开始对被用来证明细胞的功能它们被移植到动物或患者29,30,27之前孤立的POS一个新的应用程序。
首先由Molday和他的同事在1987年31所述，协议牛POS隔离结合连续蔗糖梯度与观察漂白视网膜感光色素的特点橙色外观的视网膜匀浆的超速离心步骤（携带11- 顺式视黄醛）。在过去的10年里，由于为了减少疯牛病的风险采取的预防措施，利用猪的眼睛已成为increasingly突出。这里所描述的协议说明如何获得从猪或牛的眼睛可以被等分并储存延长的时间段的大量的POS的。这样就无需从啮齿动物的眼睛，这需要使用大量POS每个准备和检测32,33,21,22动物准备POS。另外，使用荧光分子贮存前约POS标注细节给出，量化和可视化的POS中用于相对于吞噬测定32,10后的POS标签一些应用的简化和可比的方式。因此，这些大股允许再现性和易用性在许多不同类型的实验。
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Protocol
这个POS隔离实验是耗时且可能需要长达12小时来完成，如果POS存储之前被标记。该协议是改编自1987年31 1997年10由RS Molday和同事发表和修改SC Finnemann和同事的论文。
动物根据研究协会视觉与眼科（ARVO）声明的眼科和视觉研究使用动物的处理。协议进行了审查并批准了查尔斯·达尔文的道德委员会从大学的皮埃尔和玛丽·居里 - 巴黎06和Fordham大学机构动物护理和使用委员会。
1.一般设置
- 屠宰尽可能获得后新鲜一旦80鲜猪或牛的眼睛，让他们冷冻在黑暗中。提供指令给供应商，以便该公司进行的方式相同。该协议是优化80眼。到进行更多的目光并获得更大的股票（ 例如，从160眼），双液量并进行2轮超速离心的;游泳池样品后来在收集步骤（见步骤2.2.2）。
- 设置在板凳上的红色安全指示灯，吸水垫，湿巾（ 材料表 ）。准备15厘米菜肴和生物危害袋垃圾收集（未用眼睛部位，玻璃体...）。穿紧身labcoat，手套，护袖和护目镜。
- 注意事项：
- 预冷所有的解决方案，然后在所有的步骤让他们感冒。保持眼睛和梯度冷冻冰尽可能。
- 保持在黑暗中尽可能直到超速离心后收集步骤，以避免光漂白视色素和感光色素的活性形式的橙粉色的丧失的眼睛和衍生组织 。
2.协议操作
- 准备解决方案和渐变：
- 解冻牛磺酸股票完全采用37℃水浴。
- 准备从原液所有解决方案（ 表1，储备溶液），并充分混合，用磁力搅拌器对每个溶液中的其它成分的蔗糖。
- 制备15ml的所述均质溶液至20％蔗糖的最终浓度，20毫摩尔Tris pH7.2的醋酸盐，2mM的MgCl 2的，10mM葡萄糖和5mM牛磺酸。
- 制备25％的蔗糖溶液，以25％的蔗糖（使用70％的蔗糖的库存），20毫摩尔Tris乙酸盐pH为7.2，10mM葡萄糖和5mM牛磺酸的最终浓度。
- 制备的60％的蔗糖溶液，以60％的蔗糖（使用蔗糖粉末）的终浓度，20毫摩尔Tris pH7.2的醋酸盐，10mM葡萄糖和5mM牛磺酸。
- 制备洗涤溶液1至20毫摩尔Tris乙酸盐pH为7.2和5mM牛磺酸的最终浓度。
- 准备洗2解决方案至10％的蔗糖，20毫摩尔Tris乙酸盐pH为7.2和5mM牛磺酸的最终浓度。
- 制备洗3溶液至10％的蔗糖，20mM磷酸钠pH为7.2和5mM牛磺酸的最终浓度。
- 平稳梯度制造者磁力搅拌器上并插入在最靠近其中60％的溶液将被插入所述出口腔室中的搅拌棒。使用的截止P200吸管尖放置在管道的出口处，以达到适当的铸造速度。
- 微妙的稀释和搅拌与一个25％使用12毫升每个解决方案（ 即共6管80眼）预冷超速离心管的60％的蔗糖溶液浇铸线性渐变。搅逐渐-稀释60％的蔗糖溶液好。平稳梯度流的速度，浇注溶液顺畅且不能太快。
注意：为了得到一个连续的，线性梯度，保持吸管尖开口就在整个梯度formatio溶液的表面ñ。 - 让梯度坐在冰上约1小时的稳定。保持冷冻，直到加载的梯度。不要摇晃试管，防止梯度的破坏。
- 组织收集：
- 收集在昏暗的红灯组织。取的眼睛成一方面与戳前端与刀片边缘，同时保持眼距（以避免飞溅; 图1）。使用剃刀刀片切割的前眼球成两半（角膜加上至少5mm到巩膜）。取下透镜和里面翻转眼罩出来，使得它可以保持在一个手指从而暴露在视网膜的小费。
- 使用剃刀刀片以一个角度，轻轻刮去视网膜，拆卸容易，并显示为粉红色层，脱绒毡层表面和切断视神经头（ 图1）。收集所有的视网膜中2×50毫升各含15ml中在冰上均化溶液管中。
- 视网膜同源genization：
- 为了扰乱不同的细胞层，折断的POS落公关细胞，片段的POS的其余部分，均质视网膜悬浮摇动该悬浮液剧烈用手2分钟。
- 滤波器3倍通过双层纱布清洁，以除去大的组织片段，并收集流过清洁50ml试管（ 图1）。视网膜悬挂是很厚，最大化收益，轻轻按下每个纱布过滤后释放剩余的零散组织。
- 光感受器外段片段（POS）隔离：
- 轻轻地将粗视网膜准备，约6 - 7毫升每管中，在6×30毫升超速离心管各包含24个毫升新鲜冷冻连续25 - 60％的蔗糖梯度（ 图1）。平衡相对管以适合所使用的转子。超速，在106000 XG为50分钟，在4℃。 吸（ 图2A）去除大部分上面的橘粉色的带坡度的上三分之一的解决方案。用一个截止P1000尖到烧杯中收集橙粉色带。使用漂白剂（生物垃圾）中和后，放弃休息。
- 稀释〜4 - 5卷冰冷的洗涤1解决方案。分成许多30毫升管需要。离心机在3000×g离心在4℃下10分钟。小心弃去上清液。
- 在10毫升重悬粒料洗净2溶液并旋在3000×g离心10分钟，具体如上所述。在15毫升重悬粒料洗净3，并再次旋转以3,000×g离心10分钟。组合来自几个粒料悬浮，以减少在洗涤2离心前需要管的数目和清洗3的解决方案。
- POS等分无标签：
- 悬浮POS 10 - 20毫升DMEM。预稀释10微升在490微升DMEM（1:50）和计数细长以及在一个旋转着的POS细胞计数室（ 图2B）。计算产量和浓度在每毫升的POS颗粒。
注：产量变化，取决于主要的年龄和应变的猪/奶牛和眼睛的大小， 例如，良好的制剂的范围内，从5 - 8×10 9的POS 80的猪眼。 - 决定最终的DMEM体积上（一般为10 - 20ml）中，并添加蔗糖以产生2.5％的蔗糖的最终浓度。
- 制备所需大小的等分试样， 例如，每管5×10 7的POS为2ml的悬浮体积为96孔试验，在40微升/孔。自旋1等分试样5分钟，在2300×g离心在RT和评价粒料尺寸。准备各种尺寸的试样为不同的应用量为POS不应被冻结，解冻两次。
- 冻结POS等分在-80°C，直到进一步使用。
注：等份稳定许多个月。在我们手中，未标记的或标记的POS可以存储至少一年。
- 悬浮POS 10 - 20毫升DMEM。预稀释10微升在490微升DMEM（1:50）和计数细长以及在一个旋转着的POS细胞计数室（ 图2B）。计算产量和浓度在每毫升的POS颗粒。
- POS标记和分装 ：
注意：我们通常使用的FITC标记的POS为吞噬作用测定法的定量，但其它的染料也可以使用，以及根据需要。- 重悬1 10毫克的FITC小瓶在2.5毫克/毫升的浓度在0.1M碳酸钠缓冲液pH 9.5通过混合2.6毫升的0.1M的NaHCO 3 pH8.4的与1.4毫升的0.1M的Na 2 CO 3的pH 11.5（ 表2，储备溶液）。旋转1小时在室温下，同时从光及自旋保护5分钟，在最大速度下，以沉淀的非重悬于FITC的固体。
- 重悬在POS沉淀在10ml洗涤3溶液（或DMEM）中，并加入2毫升FITC溶液80的眼睛。存储剩余FITC冷冻在-80℃。旋转为至少1.5小时，在室温。用铝箔避光。
- 直到几乎没有游离的FITC被认为是在上清液F之类在第2.3.4节中所述洗净用洗净3溶液两次标记的POS，然后一次或两次的DMEMraction。悬浮在POS DMEM并继续为未标记的POS计数和分装（ 第2.4节 ）。
- 在实验中使用POS：
- 解冻的POS在RT，并保持在黑暗中尽可能如果它们是荧光标记的。旋转5分钟，在2300 XG在室温。吸出上清液。
- 立即悬浮在测定溶液适当体积决定了实验。的情况下的POS挑战不同的时间，存储在时间点之间的暗的POS悬浮于室温进行数小时。
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Representative Results
线性蔗糖梯度和超速离心的组合允许视网膜悬浮液密度的不同组分的分离。重较大的视网膜碎片和RPE细胞沉到或接近渐变（ 图2A）的底部。来自视网膜打火机POS和较轻的单个细胞或细胞碎片迁移作为单独的频带通过离心期间结束到达梯度的上半部分。通过保持眼睛和样品在黑暗中直到离心步骤后，含有的POS频带可立即通过其明亮的橙色颜色识别。该频带的宽度和强度取决于梯度质量和管的高度（89毫米的高度是优选的）。通常情况下，当适当地分离的POS应该看起来拉长，直链或弯曲的显微镜载玻片上（ 图2B）时观察到。根据显微镜的聚焦平面，它们可以出现两种或暗光泽。如果没有resus挂起得当，他们将留在团块。如果发现有破损（见下文段落），它们将显示为更小的片段，有点像“尘土飞扬”的背景。
可能出现的问题大多涉及到三个问题。第一个可能的问题是，在视网膜匀浆在振荡步骤不是剧烈不够，从而导致POS保持附着到收受从而降低产量。第二个可能的问题是与穷人的梯度铸造或渐变的质量损失，稳定时间前不足或负载过大的晃动管在收集之前的任何步骤。在这种情况下，该频带不能正确地分辨和POS不能被收集在相应的管中。最后，第三个潜在的问题发生，如果任何的溶液的pH值是错误的：POS膜可崩解和可视化它们产量评估时只有很小的POS碎片出现在显微镜。
纯化POS能用于相关的若干研究RPE细胞的吞噬功能不同的应用。 RPE细胞通常用作细胞系或从动物模型32,6,12,18-21初级培养。最近，从重新编程的干细胞一样的iPSC或ESC衍生的视网膜色素上皮细胞已被用于29,30,27,34。孤立的POS用于直接测试突变体RPE细胞的吞噬能力; 例如，POS通过从野生型小鼠的初级RPE细胞容易吞噬，而来自BETA5整合和MFG-E8的基因敲除小鼠的细胞在相同的时间量吞噬更少的POS 6,12。 POS吞噬的量化既可以做由显微镜照片6（ 图3A）手动计数FITC标记的POS，使用的设备能够读取荧光强度10,24,15,35或细胞胰蛋白酶处理后36,27流式细胞仪。最近，POS摄入量和退化已评定为oñ免疫印迹探查视蛋白37,38,27。
在体内 ，POS吸收过程发生的顺序同步内在6识别/绑定先于。摄取的不同阶段也可以通过使用适当的实验程序39区分在体外 。脉冲追踪实验可以使用温度开关来执行：POS绑定发生在20℃而内化需要37℃的温度下进行32,40,7。这种区别也存在于巨噬细胞，其可以识别的POS以及与其中的分子机制，以消除凋亡细胞是非常相似的视网膜色素上皮的机械7。经过FITC-POS吞噬作用，结合和内可以通过固定单元10之前在预孵化与台盼蓝淬火FITC荧光表面结合POS的量化在不同的样品。在台盼蓝处理的细胞，只有实习生人POS将可视化，并绑定POS可以通过从总的POS荧光数减去内部POS进行量化。当吞噬的是，使用的POS挑战后收集裂解物获得的免疫印迹评价，用EDTA裂解之前的等效处理将允许POS绑定在细胞表面内部相对于总的POS吞噬对比37,38的脱离。
巨大进步已在吞噬机器感谢的鉴定实验中采用纯净POS。蛋白质招募可以通过免疫荧光共定位实验13-15,19-21,37,41（ 图3B）进行评估。蛋白质招募或活化可以在免疫沉淀后免疫印迹或通过检查磷酸7,10,12-15,17,19,20,27,35,37,41（ 图3C）进行验证。整体基因表达的变化更多的开放性研究后POS挑战，不同时代有一个LSO已经执行42。
孤立的POS也可以使用由RPE细胞来研究的POS消除。事实上，正常老化过程中和/或当POS不正确消化，POS降解产物逐渐积聚如脂褐质沉积，并可能导致因氧化机制24,27病状。因此，了解和光有关的氧化损伤的效果，可能需要RPE细胞18,26的POS挑战。最后，重复正常27或氧化25,28的POS可用于诱导，以了解该开发在体内经过较长时期的病理机制中的RPE细胞中培养的累积效应喂养。
图1.视网膜脱离猪的眼睛。示出以不同的步骤，眼睛解剖收集并连续蔗糖梯度，起始左上角的超速离心步骤之前均质化视网膜。 A 60毫米宽的刀片是用于在一侧切断依次眼，然后其他以便能够内向外伸展它放在指尖，从而暴露视网膜。接着，视网膜是通过从与叶片绒毡层杀它收集。汇集视网膜然后在同质化的缓冲液彻底摇匀，滤过3次通过纱布双层和微妙浇在25线之上 - 60％的蔗糖梯度。
图2. POS纯化从猪眼观察到25的各种层（A） 的照片。 -视网膜匀浆超速离心后的60％的蔗糖梯度。橙色带对应于POS被收集。白上带对应非POS相关材料，以及更大的碎片附近，或在管的底部迁移。 （B）图片孤立的POS作为观察到明亮的视野显微镜对产量评估计数细胞。 POS存在于长（A，A'，C，D），并转过身（A，A'，B，B'，D）的形式。一些细长的POS可以显示一个盘绕端（C）。当改变焦点的平面中，从光泽到暗的POS外观位移（比较a和a'，B和B'）。 E组说明POS尚未悬浮妥善居住在团块。图F示出了已被损坏，并且不能使用的POS，只有小片是可检测的。规模10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
无花果使用纯化的POS的RPE吞噬能力的URE 3.分析。（A） 的共焦显微镜图像和每个细胞吞噬体随时间表示FITC标记的POS（绿色）已经较少用的RPE初级细胞来自BETA5整合分离吞噬的数量的对应量化敲除（β5 - / - ）相比野生型指示（重量或β5+ / +）的对照小鼠。细胞核（红色）用紧密连接标记ZO-1用DAPI和细胞结（蓝色）标记。比例尺为10μm。从©Nandrot 等 ，2004转载，最初发表在实验医学杂志 200（12） 杂志 ：1539年至1545年。 （B）共聚焦显微镜图片显示β5-GFP融合蛋白（绿色，左上图），表面αVβ5整合素受体 （红色，右上图）和POS（蓝色，底部之间的共定位（黄色-红色，右下图）左图）。比例尺为10μm。从Nandrot 等人 ，2012转载，最初发表于小区 104（6） 生物学 ：326-341，开拓者©出版社有限公司。当未经处理（/）相比，或与挑战介质单独（米）的对照细胞（C）（C）的免疫印迹（WB），并相应的量化（quantif。）表示的POS挑战（POS）增加FAK的上Tyr397残基的磷酸化而细胞表达的FAK（F）灭活形式还没有反应过来，所示。从Finnemann，2003年，最初发表在EMBO杂志 22转载（16）：4143-4154 请点击此处查看该图的放大版本。
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2 Chamber gradient maker | Gradient maker with 30 ml chambers | ||
| 3 mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| Small size magnetic stir bar | Stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| Red safelight lamp | Inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25 x 89 cm tubes | Beckman | 344058 | Ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30 ml centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | Ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | Swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | Rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | Fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| Counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| Dark ice buckets with lids | |||
| Scales | |||
| Magnetic stirrer and upholding pole | |||
| Refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| Labcoat | Health and safety | ||
| Gloves | |||
| Sleeve protectors | |||
| Goggles | |||
| Absorbent pads | |||
| Biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades | Dissection | 60 mm/2.25 inch wide razor blades | |
| 15 cm plastic dish | |||
| Sterile gauze sheets | |||
| 15 and 50 ml tubes | Common consumables | ||
| Microtubes | |||
| Aluminum foil | |||
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