Abstract
Analys av en av de vitala funktionerna i retinal pigment epitel (RPE) celler, fagocytos av förbrukade åldern distala fragment av ljusmätare yttre segment (POS) kan utföras in vitro. Ljusmätare yttre segment med högar av membran skivor som innehåller den ljusöver maskiner kontinuerligt förnyas i näthinnan. Förbrukade POS elimineras dagligen av RPE-celler. Gnagare, porcin / bovina och humana RPE-celler känner igen POS från olika arter på ett liknande sätt. För att underlätta att utföra stora serier av experiment med liten variabilitet, kan ett stort lager av POS isoleras från svin ögon och lagras fryst i portioner. Detta protokoll tar fördel av den egenskap hos photopigments som uppvisar en orange färg när den förvaras i mörker. Under svagt rött ljus, är retinae samlas i en buffert från öppnade ögonmusslor skurna i halvor. Den retinala Cellsuspensionen homogeniserades, filtrerades och laddades på en kontinuerlig sackarosgradient. Efter centrifugation, POS är belägna i ett diskret band i den övre delen av gradienten som har en karakteristisk orange färg. POS uppsamlas sedan, spunnet, suspenderades sekventiellt i tvättbuffertar, räknades och alikvoterades. POS erhållits på detta sätt kan användas för fagocytos analyser och analys av proteinaktivering, lokalisering eller interaktion vid olika tidpunkter efter POS utmaning. Alternativt kan POS märkas med fluoroforer, e. G., FITC, innan alikvotering för efterföljande fluorescens kvantifiering av POS-bindning eller engulfment. Andra möjliga tillämpningar inkluderar användning av modifierad POS eller POS utmaning i kombination med stressförhållanden för att studera effekten av oxidativ stress eller åldrande på RPE-celler.
Introduction
I näthinnan, är visionen utlöses av isomerisering av ljuskänsliga molekyler som kallas opsins, innan de omvandlas till en signal som kan överföras mellan nervceller upp till de visuella områden i hjärnan. Dessa molekyler är inbäddade i staplar membran diskar liknar pannkakor som utgör de yttre segment delarna av fotoreceptorceller (PRS). Att utsättas för konstant exponering för ljus och därmed avsevärda nivåer av oxidativ stress, PRs förnya kontinuerligt sina yttre segment för att begränsa potentiella oxidativ skada. Ljusmätare yttre segment är i nära kontakt med apikal mikrovilli av grann retinal pigment epitel (RPE) celler. RPE-celler utgör den yttre delen av blod-retinal barriären och se många uppgifter som är avgörande för fotoreceptorer hälsa och funktion 1, såsom släckning ljusstrålar via melaninpigment, åter isomerisering av fotoreaktiva opsin komponent retinal, ger näring och gTILLVÄXT faktorer, som deltar i PR metabolit förfogande.
Dessutom eliminerar RPE-celler bringade POS och återvinna deras komponenter, en daglig sysselsättning som regleras av dygnsrytmen i däggdjur näthinnan 2,3. Clearance av skjul POS är absolut nödvändig för PR överlevnad. När den är helt upphävd, POS skräp samlas och PRs urarta orsakar snabb synförlust 4,5. Om rytmisk profil förloras och ersätts av en ständig aktivitet, PR och RPE defekter ackumuleras med 6 åldern. Därför är det mycket viktigt att karakterisera den molekylära regleringen av RPE fagocytos in vitro i syfte att förstå fenotyper länkade till dess dysfunktion. Intressant nog är den molekylära maskiner i RPE-celler mycket lik den som används av makrofager att rensa apoptotiska celler och båda är beroende av erkännande av exponerad fosfatidylserin på fagocytisk skräp 7-9. Ändå RPE-celler och makrofager reglerar phagocytosis annorlunda, eftersom makrofager väljer omedelbart avskaffande av apoptotiska celler vid mötet tid medan RPE-celler rytm uppsluka POS endast en gång om dagen trots deras ständig kontakt med yttre segment. Detta tyder på specifika regleringsmekanismer som ännu inte är helt klarlagda.
Många av de molekyler som är inblandade i RPE fagocytiska maskiner har identifierats eller valideras tack vare användningen av isolerade POS och cellodlings fagocytos analyser. Den alphavbeta5 grinreceptor ligger vid RPE apikala cellytan, i samordning med dess ligand MFG-E8, binder specifikt till POS 10-12, som sedan intern via MerTK tyrosinkinasreceptorn 13-15. Den CD36 renhållare receptorn har visat att delta i POS intag och påverka dess hastighet 16,17, och kan tjäna som en sensor av oxiderade fosfolipider vid POS ytan 18. Interna behöver rekryteringen av F-aktin cytoskelettet-associated proteiner såsom annexin 2 19, myosin II 20 och myosin VIIA 21,22. Native eller oxiderade POS in vitro används också för att förstå åldrande fenotyper av RPE-celler in vivo kopplade till ackumulering av dåligt smält oxiderad POS 23-28. Den generation av RPE celler från stamceller har inlett en ny ansökan om isolerade POS som används för att bevisa funktionaliteten av celler innan de transplanteras till djur eller patienter 29,30,27.
Först beskrivs av Molday och kollegor 1987 31, protokollet för isolering av bovin POS kombinerar en ultracentrifuge steg i retinala homogen på kontinuerliga sackarosgradienter med observation av den karakteristiska orangefärgade utseende oblekt retinal photopigment (bär 11- cis retinal). Under de senaste 10 åren, på grund av försiktighetsåtgärder vidtagits för att minimera risken för galna ko-sjukan, användning av svin ögon har blivit increasingly framträdande. Protokollet som beskrivs här visar hur man kan få stora mängder POS från gris eller ögon nötkreatur som kan alikvoter och lagrades under längre tidsperioder. Detta eliminerar behovet att förbereda POS från gnagare ögon, som kräver hjälp av ett stort antal djur per POS förberedelse och analys 32,33,21,22. Dessutom är uppgifter om POS märkning före lagring använder fluorescerande molekyler givet, att kvantifiera och visualisera POS på ett förenklat och jämförbart sätt för vissa tillämpningar jämfört med märkning POS efter fagocytos analysen 32,10. Därför är dessa stora lager möjliggör reproducerbarhet och enkel användning i många olika typer av experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna POS isolering experiment är tidskrävande och kan kräva upp till 12 timmar att slutföra om POS är märkta före lagring. Protokollet har anpassats från en artikel publicerad av RS Molday och kollegor 1987 31 och modifierats av SC Finnemann och kollegor under 1997 10.
Djuren hanteras enligt Föreningen för forskning i Vision och oftalmologi (ARVO) Uttalande om användning av djur i oftalmisk och Vision Research. Protokoll granskades och godkändes av Charles Darwin etikkommitté från University Pierre och Marie Curie-Paris 06 och Fordham University Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Allmänt Konfigurera
- Skaffa 80 färska gris eller ko ögon så färsk som snart efter slakt som möjligt och hålla dem kylda i mörkret. Ge instruktioner till leverantören så företaget fortsätter på samma sätt. Detta protokoll är optimerad för 80 ögon. Tillfortsätta med fler ögon och få större bestånd (t.ex., från 160 ögon), dubbla lösningsmängder och utföra 2 omgångar av ultracentrifuge; pool prover senare vid uppsamlingssteget (se steg 2.2.2).
- Ställ in på bänken den röda skyddsljus lampa, absorberande kuddar, våtservetter (Material tabell). Förbered 15 cm rätter och biohazard väskor för sophämtning (oanvända ögondelar, glasartade ...). Bär åtsittande labcoat, handskar, ärmskydd och skyddsglasögon.
- Försiktighetsåtgärder:
- Pre-chill alla lösningar sedan hålla dem kalla under alla steg. Håll ögon och gradienter kylda på is så mycket som möjligt.
- Håll ögon och härledda vävnader i mörkret så mycket som möjligt tills uppsamlingssteget efter ultracentrifuge att undvika fotoblekning av visuella pigment och förlust av den orange-rosa färg på den aktiva formen av photopigments.
2. Protokoll Åtgärder
- Förbered lösningar och gradienter:
- Tina taurin lager helt med hjälp av en 37 ° C vattenbad.
- Förbered alla lösningar från stamlösningar (Tabell 1, stamlösningar) och blandas noggrant sackaros med andra ingredienser med en magnetisk omrörare för varje lösning.
- Bered 15 ml av homogenisering lösningen till en slutkoncentration av 20% sackaros, 20 mM Tris acetat pH 7,2, 2 mM MgCl2, 10 mM glukos och 5 mM taurin.
- Förbered 25% sackaroslösning till en slutkoncentration av 25% sackaros (med användning av 70% sackaros stock), 20 mM tris-acetat pH 7,2, 10 mM glukos och 5 mM taurin.
- Förbered 60% sackaroslösning till en slutkoncentration av 60% sackaros (sackaros har använts pulver), 20 mM Tris acetat pH 7,2, 10 mM glukos och 5 mM taurin.
- Bered tvätt en lösning till en slutlig koncentration av 20 mM tris-acetat pH 7,2 och 5 mM taurin.
- Bered tvätt 2 lösningentill en slutkoncentration av 10% sackaros, 20 mM tris-acetat pH 7,2 och 5 mM taurin.
- Bered tvätt 3 lösningen till en slutkoncentration av 10% sackaros, 20 mM natriumfosfat pH 7,2 och 5 mM taurin.
- Stadig gradienten maker på en magnetomrörare och infoga en omrörare i kammaren närmast utloppet där 60% lösning kommer att infogas. Använd en cut-off P200 pipettspetsen placerad vid utfarten av slangen för att uppnå rätt gjuthastighet.
- Kasta linjära övertoningar fint genom utspädning och omrörning av 60% sackaros lösning med 25% en med hjälp 12 ml från varje lösning (dvs totalt 6 rör för 80 ögon) i pre-kylda ultracentrifugrör. Rör om gradvis-späda 60% sackaroslösning väl. Stadig hastighet lutning flöde, hälla lösningen smidigt och inte för fort.
NOTERA: För att få en kontinuerlig, linjär gradient, hålla pipettspetsen öppningen höger vid lösningens yta för hela gradienten formation. - Låt gradienterna sitta på is under omkring 1 h för stabilisering. Håll gradienter kylda fram laddad. Skaka inte rören för att förhindra störningar av gradienten.
- Vävnads samling:
- Samla vävnader under dim rött ljus. Ta ett öga i ena handen och peta fram med kant rakblad medan du håller ögat bort (för att undvika stänk, Figur 1). Använd rakblad för att skära den främre ögongloben i 2 halvor (hornhinnan plus minst 5 mm in i sklera). Ta bort lins och vänd ögonmusslan ut och in så att den kan hållas över spetsen av ett finger därmed utsätta näthinnan.
- Använda rakblad i en vinkel, försiktigt skrapa näthinnan, lösgör lätt och som förekommer som ett rosaaktigt skikt, av tapetum ytan och skär vid synnervspapillen (Figur 1). Samla alla näthinnor i 2 x 50 ml rör vardera innehåller 15 ml homogenisering lösningen på is.
- Retina homogenization:
- Skaka suspensionen kraftigt för hand under 2 min för att störa de olika cellskikten, bryta POS utanför resten av PR cellen, fragment POS och homogenisera näthinnan fjädring.
- Filter 3x genom ett dubbelt lager av ren kompress för att avlägsna stora vävnadsfragment och samla genomströmning i rena 50 ml rör (Figur 1). Näthinnans fjädring är ganska tjock, för att maximera avkastningen, tryck försiktigt på gasväv att släppa återstående fragmente vävnader efter varje filtrering.
- Fotoreceptor yttre fragment segmentet (POS) isolering:
- Försiktigt lägger rå näthinnan prep, cirka 6-7 ml per rör, över 6 x 30 ml ultracentrifugrör vardera innehållande 24 ml av färsk kyld kontinuerlig 25-60% sackarosgradient (Figur 1). Balans de motstående rören samt lämpligt för den rötor som skall användas. Ultracentrifug vid 106.000 xg under 50 minuter vid 4 ° C. Ta bort det mesta av lösningen ovanför orange-rosa bandet i den övre tredjedelen av lutning genom aspiration (Figur 2A). Samla den orange-rosa band med en cut-off P1000 spets i en bägare. Kassera vila efter neutralisering använda blekmedel (biologiskt avfall).
- Späd med ~ 4-5 volymer iskall Wash 1 lösning. Separera in så många 30 ml rör som behövs. Centrifugera vid 3000 xg under 10 min vid 4 ° C. Försiktigt kassera supernatanten.
- Resuspendera pellets i 10 ml Tvätta 2-lösning och snurra vid 3000 xg under 10 minuter enligt ovan. Resuspendera pellets i 15 ml Tvätta 3 och snurra igen vid 3000 xg under 10 min. Kombinera suspensioner från flera pellets för att minska antalet rör som behövs innan centrifugering i Wash 2 och Tvätta 3 lösningar.
- POS alikvotering utan märkning:
- Resuspendera POS i 10 - 20 ml DMEM. Predilute 10 pl i 490 pl DMEM (1:50) och räkna avlånga liksom virvlade POS i encellräkningskammare (Figur 2B). Beräkna avkastningen och koncentration i POS partiklar per ml.
OBS: Avkastningen varierar beroende främst på ålder och stam av grisar / kor och storlek av ögonen, t.ex. varierar en bra förberedelse 5-8 x 10 9 POS från 80 gris ögon. - Beslut om det slutliga DMEM volym (typiskt 10 - 20 ml) och tillsätt sackaros för att ge en slutkoncentration av 2,5% sackaros.
- Förbered alikvoter av önskad storlek, t.ex., 5 x 10 7 POS per rör för en 2 ml resuspension volym för en 96-brunnars experimentet vid 40 | il / brunn. Spin en alikvot under 5 min vid 2300 xg vid RT och utvärdera pelletstorlek. Förbered olika alikvot storlekar för olika applikationsvolymer som POS INTE bör frysas och tinas två gånger.
- Freeze POS alikvoter vid -80 ° C tills vidare användning.
OBS: Portioner är stabila i flera månader. I våra händer, kan omärkt eller märkt POS lagras i minst ett år.
- Resuspendera POS i 10 - 20 ml DMEM. Predilute 10 pl i 490 pl DMEM (1:50) och räkna avlånga liksom virvlade POS i encellräkningskammare (Figur 2B). Beräkna avkastningen och koncentration i POS partiklar per ml.
- POS märkning och alikvotering:
OBS: Vi använder vanligtvis FITC att märka POS för kvantifiering av fagocytos analyser, men andra färgämnen kan också användas beroende på behov.- Resuspendera 1 10 mg FITC flaska på en 2,5 mg / ml koncentration i 0,1 M Na karbonatbuffert pH 9,5 genom att blanda 2,6 ml 0,1 M NaHCO 3 pH 8,4 med 1,4 ml 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (tabell 2, Stamlösningar). Rotera under 1 h vid RT samtidigt skydda från ljus och spinn i 5 min vid maximal hastighet för att pelle icke suspenderade FITC fasta ämnen.
- Resuspendera POS pelleten i 10 ml tvätt 3-lösning (eller DMEM) och tillsätt 2 ml av FITC-lösning för 80 ögon. Förvara överblivna FITC fryst vid -80 ° C. Rotera under minst 1,5 h vid RT. Skyddas från ljus med hjälp av aluminiumfolie.
- Tvätta märkt POS två gånger med Wash 3-lösning som beskrivs i avsnitt 2.3.4, då en eller två gånger i DMEM tills nästan ingen fri FITC ses i supernatanten fdiffraktion. Resuspendera POS i DMEM och fortsätt som för omärkt POS för räkning och alikvotering (avsnitt 2.4).
- Använda POS i experiment:
- Tina POS vid RT, och hålla dem i mörkret så mycket som möjligt om de fluorescerande-märkta. Snurra under 5 min vid 2300 xg vid RT. Aspirera supernatanten.
- Omedelbart suspendera i lämplig volym av analyslösning som dikteras av experimentet. Vid olika tider på POS utmaning, lagra suspenderades POS vid RT i mörker mellan tidpunkter under flera timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kombinationen av den linjära sackarosgradient och ultracentrifugering möjliggör separeringen av de olika komponenterna i den retinala suspensionen genom densitet. Tunga större retinala skräp och RPE-celler sjunker till eller nära botten av gradienten (Figur 2A). Lättare POS och lättare enskilda celler eller cellrester från näthinnan migrerar som separata band att nå den övre halvan av gradienten i slutet av centrifugeperioden. Genom att hålla ögon och proverna i mörker tills efter centrifugeringssteget, kan bandet innehåller POS omedelbart igen av sin ljusa orange färg. Bredden och intensiteten av detta band är beroende av lutning kvalitet och röret höjd (89 mm höjd är att föredra). Vanligtvis när isolerats på rätt POS borde visas avlånga, rak eller böjd då observeras på ett objektglas (Figur 2B). Beroende på fokusplanet på mikroskop, kan de verkar antingen mörk eller blanka. Om inte resusfjädrade ordentligt, kommer de att stanna i klumpar. Om de är skadade (se punkt nedan), kommer de att visas så mycket mindre bitar, lite som en "dammig" bakgrund.
Problem som kan uppstå är främst relaterade till tre frågor. Den första möjliga frågan är att skaka steget näthinnans homogen är inte tillräckligt kraftfull för, vilket leder till POS förblir fäst PRs därmed minskad avkastning. Den andra möjliga frågan är kopplad till dålig lutning gjutning eller lutning kvalitetsförlust otillräcklig stabilisering innan lastning eller överdriven röret skaka vid varje steg före insamlingen. I detta fall kan banden vara tydligt klarlagt och POS kan inte samlas i motsvarande röret. Slutligen uppstår tredje potentiellt problem om pH av någon av de lösningar som är fel: POS membran kan upplösas och endast små POS skräp visas på mikroskopet när visualisera dem för bedömning avkastning.
Renat POS kananvändas för ett antal olika tillämpningar i samband med att studera fagocytos av RPE-celler. RPE-celler används vanligen som cellinjer eller primär kultur från djurmodeller 32,6,12,18-21. På senare tid har RPE-celler härledda från omprogrammerade stamceller som iPSC eller ESC använts 29,30,27,34. Isolerade POS tjänar testa direkt fagocytiska förmåga muterade RPE-celler, t ex, är POS lätt fagocyteras av primära RPE celler från vildtypsmöss, medan celler från beta5 grin och MFG-E8 knockoutmöss fagocytera mindre POS i samma tid 6,12. Kvantifiering av POS fagocytos kan ske antingen genom att räkna FITC-märkt POS manuellt på mikroskopbilder 6 (Figur 3A), med hjälp av utrustning som kan läsa fluorescensintensiteten 10,24,15,35 eller en flödescytometer efter cell trypsinization 36,27. På senare tid har utvärderats POS intag och nedbrytning on immunoblottar sonde för opsins 37,38,27.
In vivo sker POS upptagsprocessen sekventiellt som erkännande / bindande föregår synkroniserade interna 6. De olika faserna i upptag kan också urskiljas in vitro med hjälp av lämpliga experimentella procedurer 39. Puls-chase experiment kan utföras med hjälp av temperaturbrytare: POS-bindning sker vid 20 ° C medan interna behöver en temperatur på 37 ° C för att fortsätta 32,40,7. Denna distinktion finns även i makrofager, som kan känna igen POS samt och i vilken den molekylära maskiner för att eliminera apoptotiska celler är mycket lik RPE maskineri 7. Efter FITC-POS fagocytos, bindande och interna kan kvantifieras i separata prov genom härdning FITC-fluorescens av ytbundet POS under pre-inkubation med trypanblått innan fastställande av cellerna 10. I trypanblått behandlade celler, enbart praktikantal POS kommer att visualiseras och bundna POS kan kvantifieras genom att subtrahera intern POS från total POS fluorescens räknas. När fagocytos utvärderas immunoblots erhållits med hjälp av lysat samlats efter POS utmaning, kommer en likvärdig behandling med EDTA före lys tillåter avskiljandet av POS bunden vid cellytan för intern kontra total POS fagocytos jämförelse 37,38.
Enorma framsteg har gjorts i identifieringen av de fagocytiska maskiner tack vare experiment använder renat POS. Protein rekrytering kan bedömas genom immunofluorescens samlokalisering analyser 13-15,19-21,37,41 (Figur 3B). Protein rekrytering eller aktivering kan valideras på immunoblots efter immunoprecipitation eller genom att söka efter fosforylering 7,10,12-15,17,19,20,27,35,37,41 (Figur 3C). Öppnare-slutade studier om övergripande förändringar genuttryck efter olika tider på POS utmaning har enLSO utförts 42.
Isolerad POS kan också användas för att studera POS eliminering av RPE-celler. Faktum är att under normalt åldrande och / eller när POS inte smälts ordentligt, POS nedbrytningsprodukter ansamlas successivt som lipofuscin insättningar och kan leda till sjukdomar på grund av oxidation mekanismer 24,27. Därför kan förstå effekterna av ljus och relaterade oxidativ skada kräver POS utmaning RPE-celler 18,26. Slutligen upprepade utfodring med normala 27 eller oxiderade 25,28 POS kan användas för att framkalla kumulativa effekter i RPE celler i kultur för att förstå sjukdomsmekanismer som utvecklas in vivo över längre tidsperioder.
Figur 1. Retina isolering från svin ögon. Ritning som visar de olika stegen i ögat dissektion föratt samla in och homogenisera näthinnan innan ultracentrifuge steg på kontinuerliga sackarosgradienter, börjar längst upp till vänster. Ett 60 mm brett blad används för att skära ögat sekventiellt på den ena sidan och sedan den andra för att kunna sträcka det ut och in på en fingertopp och exponerar därmed näthinnan. Därefter näthinnan uppsamlas genom skrotning den från tapetum med bladet. Poolad retinae därefter skakades noggrant i homogeniseringsbuffert, filtrerades tre gånger genom dubbla skikt av gasväv och noga hälls ovanpå det linjära 25-60% sackarosgradient.
Figur 2. POS rening från svin ögon (A) Fotografera av de olika skikten som observerats på en 25 -. 60% sukrosgradient efter ultracentrifuge av näthinnan homogen. Den orange bandet motsvarar POS som ska samlas. De vita övre band motsvarartill icke-POS relaterat material, liksom större skräp migrerar nära eller på botten av röret. (B) Bild av isolerade POS som observerats på en ljus fältmikroskop på en räkningscell för bedömning avkastning. POS existerar i långsträckt (a, a ', c, d) och virvlade (a, a', b, b ', d) former. Vissa långsträckt POS kan visa en lindad extremitet (c). Vid byte fokalplanet, POS utseende skiftar från glänsande till mörkt (jämför och en ", b och b '). Panel e illustrerar POS som inte har lösts upp ordentligt och bor i klumpar. Panel f visar POS som har skadats och är inte användbara, bara små bitar är detekterbara. Skala 10 mikrometer. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figure 3. Analys av RPE fagocytos användning av renat POS. (A) konfokalmikroskop bild och motsvarande kvantifiering av antalet fagosomer per cell med tiden visar att FITC-märkt POS (grön) har mindre fagocyteras av RPE primära celler isolerade från beta5 grin knockout (β5 - / -) jämfört med vildtyp (wt eller β5 + / +) kontrollmöss som anges. Kärnor (röd) märktes med hjälp DAPI och cell korsningar (blå) med hjälp av snäva korsningen markören ZO-1. Scale bars 10 um. . Reproducerat från © Nandrot et al, 2004, ursprungligen publicerad i The Journal of Experimental Medicine 200 (12): 1539-1545. (B) konfokalmikroskop bilder som visar samlokalisering (gul-magenta, nedre högra panelen) mellan β5-GFP fusionsproteiner (grön, övre vänstra panelen), yta aVp5 grinreceptorer (rött, övre högra panelen) och POS (blå, bottenvänstra panelen). Scale bar 10 ^ m. . Reproducerat från Nandrot et al, 2012, ursprungligen publicerad i Biology of Cell 104 (6): 326-341, © Portland Press Limited. (C) Immunoblots (WB) och motsvarande kvantifiering (quantif.) Visar att POS utmaning (POS) ökar fosforylering av FAK på Tyr397 rest jämfört utan behandling (/) eller utmanas med enbart medium (m) i kontrollceller (c) medan celler som uttrycker en inaktiverad form av FAK (F) reagerar inte, såsom anges. Reproduceras från Finnemann, 2003, ursprungligen publicerad i EMBO Journal 22 (16):. 4143-4154 klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2 Chamber gradient maker | Gradient maker with 30 ml chambers | ||
| 3 mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| Small size magnetic stir bar | Stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| Red safelight lamp | Inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25 x 89 cm tubes | Beckman | 344058 | Ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30 ml centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | Ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | Swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | Rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | Fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| Counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| Dark ice buckets with lids | |||
| Scales | |||
| Magnetic stirrer and upholding pole | |||
| Refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| Labcoat | Health and safety | ||
| Gloves | |||
| Sleeve protectors | |||
| Goggles | |||
| Absorbent pads | |||
| Biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades | Dissection | 60 mm/2.25 inch wide razor blades | |
| 15 cm plastic dish | |||
| Sterile gauze sheets | |||
| 15 and 50 ml tubes | Common consumables | ||
| Microtubes | |||
| Aluminum foil | |||
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Young, R. W., Bok, D. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process. J. Cell Biol. 42 (2), 392-403 (1969).
- LaVail, M. M. Rod outer segment disk shedding in rat retina: relationship to cyclic lighting. Science. 194 (4269), 1071-1074 (1976).
- Mullen, R. J., LaVail, M. M. Inherited retinal dystrophy: primary defect in pigment epithelium determined with experimental rat chimeras. Science. 192 (4241), 799-801 (1976).
- Nandrot, E., et al. Homozygous deletion in the coding sequence of the c-mer gene in RCS rats unravels general mechanisms of physiological cell adhesion and apoptosis. Neurobiol. Dis. 7 (6 pt B), 586-599 (2000).
- Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. J. Exp. Med. Nandrot, E. F., Kim, Y., Brodie, S. E., Huang, X., Sheppard, D., Finnemann, S. C. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Macrophage and retinal pigment epithelium phagocytosis: apoptotic cells and photoreceptors compete for alphavbeta3 and alphavbeta5 integrins, and protein kinase C regulates alphavbeta5 binding and cytoskeletal linkage. J. Exp. Med. 190 (6), 861-874 (1999).
- Savill, J., Dransfield, I., Hogg, N., Haslett, C. Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Nature. 343 (6254), 170-173 (1990).
- Ruggiero, L., Connor, M. P., Chen, J., Langen, R., Diurnal Finnemann, S. C. localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tips in wild-type but not Itgb5-/- or Mfge8-/- mouse retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8145-8148 (2012).
- Finnemann, S. C., Bonilha, V. L., Marmorstein, A. D., Rodriguez-Boulan, E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alphavbeta5 integrin for binding but not for internalization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24), 12932-12937 (1997).
- Lin, H., Clegg, D. O. Integrin alphavbeta5 participates in the binding of photoreceptor rod outer segments during phagocytosis by cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39 (9), 1703-1712 (1998).
- Nandrot, E. F., Anand, M., Almeida, D., Atabai, K., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Essential role for MFG-E8 as ligand for alphavbeta5 integrin in diurnal retinal phagocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (29), 12005-12010 (2007).
- Feng, W., Yasumura, D., Matthes, M. T., LaVail, M. M., Vollrath, D. Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 277 (19), 17016-17022 (2002).
- Finnemann, S. C. Focal adhesion kinase signaling promotes phagocytosis of integrin-bound photoreceptors. EMBO J. 22 (16), 4143-4154 (2003).
- Nandrot, E. F., Silva, K. E., Scelfo, C., Finnemann, S. C. Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of αvβ5 integrin. Biol. Cell. 104 (6), 326-341 (2012).
- Ryeom, S. W., Sparrow, J. R., Silverstein, R. L. CD36 participates in the phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelium. J. Cell Sci. 109 (2), 387-395 (1996).
- Finnemann, S. C., Silverstein, R. L. Differential roles of CD36 and alphavbeta5 integrin in photoreceptor phagocytosis by the retinal pigment epithelium. J. Exp. Med. 194 (9), 1289-1298 (2001).
- Sun, M., et al. Light-induced oxidation of photoreceptor outer segment phospholipids generates ligands for CD36-mediated phagocytosis by retinal pigment epithelium: a potential mechanism for modulating outer segment phagocytosis under oxidant stress conditions. J. Biol. Chem. 281 (7), 4222-4230 (2006).
- Law, A. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Mol. Biol. Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
- Strick, D. J., Feng, W., Vollrath, D. Mertk drives myosin II redistribution during retinal pigment epithelial phagocytosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (5), 2427-2435 (2009).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Diemer, T., Khanobdee, K., Hu, J., Bok, D., Williams, D. S. Function of MYO7A in the human RPE and the validity of shaker1 mice as a model for Usher syndrome 1B. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (2), 1130-1135 (2010).
- Kennedy, C. J., Rakoczy, P. E., Constable, I. J. Lipofuscin of the retinal pigment epithelium: a review. Eye (Lond.). 9 (Pt 6), 763-771 (1995).
- Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (6), 3842-3847 (2002).
- Sugano, E., Tomita, H., Ishiguro, S., Isago, H., Tamai, M. Nitric oxide-induced accumulation of lipofuscin-like materials is caused by inhibition of cathepsin. S. Curr. Eye Res. 31 (7-8), 607-616 (2006).
- Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 283 (36), 24770-24780 (2008).
- Singh, R., et al. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 54 (10), 6767-6778 (2013).
- Lei, L., Tzekov, R., McDowell, J. H., Smith, W. C., Tang, S., Kaushal, S. Formation of lipofuscin-like material in the RPE Cell by different components of rod outer segments. Exp. Eye Res. 112, 57-67 (2013).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), 8152 (2009).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells reveal early developmental molecular correlates with a probable Leber congenital amaurosis type I. Cell. Reprogram. 15 (3), 233-246 (2013).
- Molday, R. S., Hicks, D., Peripherin Molday, L. A rim-specific membrane protein of rod outer segment discs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28 (1), 50-61 (1987).
- Chaitin, M. H., Hall, M. O. Defective ingestion of rod outer segments by cultured dystrophic rat pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24 (7), 812-820 (1983).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Carr, A. J., et al. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15, 283-295 (2009).
- Dun, Y., Vargas, J., Brot, N., Finnemann, S. C. Independent roles of methionine sulfoxide reductase A in mitochondrial ATP synthesis and as antioxidant in retinal pigment epithelial cells. Free Radic. Biol. Med. 65, 1340-1351 (2013).
- Xu, Y. T., Wang, Y., Chen, P., Xu, H. F. Age-related maculopathy susceptibility 2 participates in the phagocytosis functions of the retinal pigment epithelium. Int. J. Ophthalmol. 5 (2), 125-132 (2012).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Essential diurnal Rac1 activation during retinal phagocytosis requires αvβ5 integrin but not tyrosine kinases focal adhesion kinase or Mer tyrosine kinase. Mol. Biol. Cell. 23 (6), 1104-1114 (2013).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol. Biol. 935, 285-295 (2013).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Hall, M. O., Abrams, T. Kinetic studies of rod outer segment binding and ingestion by cultured rat RPE cells. Exp. Eye Res. 45 (6), 907-922 (1987).
- Bulloj, A., Duan, W., Finnemann, S. C. PI 3-kinase independent role for AKT in F-actin regulation during outer segment phagocytosis by RPE cells. Exp. Eye Res. 113, 9-18 (2013).
- Chowers, I., et al. Changes in retinal pigment epithelial gene expression induced by rod outer segment uptake. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (7), 2098-2106 (2004).
- Edwards, R. B., Szamier, R. B. Defective phagocytosis of isolated rod outer segments by RCS rat retinal pigment epithelium in culture. Science. 197 (4307), 1001-1003 (1977).
- Philp, N. J., Bernstein, M. H. Phagocytosis by retinal pigment epithelium explants in culture. Exp. Eye Res. 33 (1), 47-53 (1981).
- Burstyn-Cohen, T., Lew, E. D., Través, P. G., Burrola, P. G., Hash, J. C., Lemke, G. Genetic dissection of TAM receptor-ligand interaction in retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Neuron. 76 (6), 1123-1132 (2012).
