Abstract
Analyse de l'une des fonctions vitales de l'épithélium rétinien pigmentaire (RPE) des cellules, la phagocytose des fragments passés distales âgées de segments externes des photorécepteurs (OP) peut être effectuée in vitro. Photoréceptrices segments extérieurs avec des piles de disques membraneuses contenant les machines de phototransduction sont constamment renouvelés dans la rétine. POS usés sont éliminés quotidiennement par des cellules RPE. Rongeur, porcin / bovin et cellules RPE humaines reconnaître POS partir de diverses espèces d'une manière similaire. Pour faciliter l'exécution grande série d'expériences avec peu de variabilité, un stock important de POS peut être isolé de yeux porcins et conservé congelé en aliquotes. Ce protocole prend avantage de la caractéristique de photopigments qui affichent une couleur orange lorsqu'il est maintenu dans l'obscurité. Sous une lumière rouge sombre, rétines sont collectés dans un tampon d'œilletons ouverts coupées en deux. La suspension de cellules de la rétine est homogénéisé, filtré et chargé sur un gradient de sucrose continu. Après centrifugation, POS sont situés dans une bande distincte dans la partie supérieure de la pente qui a une couleur orange caractéristique. POS sont ensuite collectés, filés, remises en suspension séquentielle dans des tampons de lavage, comptés et aliquotés. POS obtenus de cette manière peuvent être utilisées pour des essais et l'analyse de l'activation des protéines, la localisation ou l'interaction à différents moments après la provocation POS phagocytose. Alternativement, POS peut être étiqueté avec des fluorophores, e. G., FITC, avant aliquotage pour la fluorescence ultérieure quantification des POS de liaison ou engloutissement. Autres applications possibles comprennent l'utilisation de défi POS ou POS modifié combiné à des conditions de stress pour étudier l'effet du stress oxydatif ou de vieillissement sur les cellules de l'EPR.
Introduction
Dans la rétine, la vision est provoquée par isomérisation des molécules photosensibles appelées opsines, avant d'être transformé en un signal qui peut être transmis entre les neurones jusqu'à des zones visuelles du cerveau. Ces molécules sont intégrées dans des piles de disques membraneuses ressemblant à crêpes qui constituent les parties de segments extérieurs des cellules photoréceptrices (PR). Être soumis à une exposition constante à des niveaux considérables donc du stress oxydatif et de la lumière, les PR renouveler continuellement leurs segments extérieurs à limiter les dommages oxydatifs potentiel. Photoréceptrices segments extérieurs sont en contact étroit avec microvillosités apicale des cellules voisines épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Cellules RPE constitue la partie extérieure de la barrière hémato-rétinienne et assurent de nombreuses tâches qui sont cruciaux pour photorécepteurs santé et de la fonction 1, telles que la trempe des rayons lumineux par l'intermédiaire de pigments mélaniques, re-isomérisation du photoréactif rétine de composante de opsine, fournissant des nutriments et de gCROISSANCE facteurs, en participant à l'élimination PR métabolite.
En outre, les cellules RPE éliminent passé POS et recyclent leurs composants, une occupation quotidienne qui est réglementée par le rythme circadien dans la rétine des mammifères 2,3. La clairance du hangar POS est absolument nécessaire pour la survie de PR. Quand il est complètement abrogée, les débris se accumulent POS et PRS dégénèrent provoquant rapide de 4,5 perte de vision. Si le profil rythmique est perdu et remplacé par une activité constante, PR et RPE défauts se accumulent avec l'âge de 6. Par conséquent, il est très important de caractériser la régulation moléculaire d'un EPR phagocytose in vitro afin de comprendre phénotypes liés à son dysfonctionnement. Fait intéressant, la machinerie moléculaire dans les cellules RPE est très similaire à celle utilisée par les macrophages pour effacer les cellules apoptotiques et les deux dépendent de la reconnaissance de la phosphatidylsérine exposée sur les débris phagocytaire 9.7. Pourtant, les cellules macrophages et RPE réguler le pHagocytosis différemment, comme les macrophages optent pour l'élimination immédiate de cellules apoptotiques au moment de la rencontre tandis que les cellules RPE engloutir rythmiquement POS seulement une fois par jour en dépit de leur contact permanent avec des segments extérieurs. Cela suggère des mécanismes de régulation spécifiques qui ne sont pas encore bien compris.
Un grand nombre de molécules impliquées dans le mécanisme de phagocytose RPE ont été identifiés validé ou grâce à l'utilisation de POS isolé et culture de cellules tests de phagocytose. Le récepteur d'intégrine alphavbeta5 située à la surface apicale des cellules RPE, en coordination avec son ligand MFG-E8, se lie spécifiquement à POS 10-12, qui sont ensuite internalisée par l'intermédiaire du récepteur de kinase de tyrosine MerTK 13-15. Le récepteur scavenger CD36 a été montré pour participer à la prise de point de vente et d'influer sur sa vitesse 16,17 et peut servir de capteur de phospholipides oxydés à la surface de 18 points de vente. L'internalisation doit le recrutement de F-cytosquelette d'actine-assdes protéines telles que l'annexine ociated 2 19, la myosine II 20 et de la myosine VIIA 21,22. POS native ou oxydée in vitro sont également utilisés pour comprendre le vieillissement phénotypes de cellules RPE in vivo liés à l'accumulation de mal digéré POS oxydé 23-28. La génération de cellules RPE dérivées de cellules souches a lancé une nouvelle application pour POS isolé qui sont utilisés pour prouver la fonctionnalité des cellules avant qu'elles sont transplantées à des animaux ou patients 29,30,27.
Première décrit par Molday et ses collègues en 1987 31, le protocole pour l'isolement de POS bovine combine une étape d'ultracentrifugation d'homogénats rétiniennes sur des gradients de saccharose continues avec l'observation de l'apparition d'orange caractéristique de la rétine photopigment écrus (portant 11- rétinien cis). Au cours des 10 dernières années, en raison de précautions prises afin de minimiser le risque de maladie de la vache folle, l'utilisation des yeux porcins est devenu increasingly important. Le protocole décrit ici montre comment obtenir de grandes quantités de POS de porc ou les yeux bovins qui peuvent être aliquotés et conservés pendant de longues périodes de temps. Ceci élimine la nécessité de préparer POS des regards de rongeurs, ce qui nécessite l'aide d'un grand nombre d'animaux par la préparation de POS et le dosage 32,33,21,22. En outre, des détails concernant l'étiquetage POS avant stockage en utilisant des molécules fluorescentes sont données, pour quantifier et visualiser POS de manière simplifiée et comparables pour certaines applications par rapport à l'étiquetage POS après l'essai de phagocytose 32,10. Par conséquent, ces stocks importants pour permettre la reproductibilité et la facilité d'utilisation dans de nombreux types d'expériences.
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Protocol
Cette expérience de l'isolement de POS prend du temps et peut nécessiter jusqu'à 12 heures pour compléter si POS sont étiquetés avant le stockage. Le protocole a été adapté à partir d'un document publié par RS Molday et ses collègues en 1987 31 et modifié par SC Finnemann et ses collègues en 1997 10.
Les animaux ont été traités selon l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie (ARVO) Déclaration pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research. Des protocoles ont été examinés et approuvés par le comité d'éthique de l'Université Charles Darwin Pierre et Marie Curie-Paris 06 et le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Université Fordham.
1. Généralités Set Up
- Obtenir 80 porcs ou de vaches fraîches yeux aussi frais dès après l'abattage que possible et garder réfrigéré dans l'obscurité. Fournir des instructions au fournisseur afin que l'entreprise procède de la même façon. Ce protocole est optimisé pour 80 yeux. Àprocéder à plus d'yeux et obtenir des stocks plus importants (par exemple, à partir de 160 yeux), doubler les quantités de solutions et effectuer deux tours de ultracentrifugation; Des échantillons de la piscine par la suite à l'étape de collecte (voir étape 2.2.2).
- Mis en place sur le banc la lampe inactinique rouge, tampons absorbants, lingettes (Table des matières). Préparer des plats de 15 cm et des sacs de risque biologique pour la collecte des déchets (parties de l'œil vitreux, utilisé ...). Porter blouse moulante, gants, manches protectrices et des lunettes.
- Précautions:
- Pré-refroidir toutes les solutions, puis les conserver au froid durant toutes les étapes. Gardez les yeux et les gradients réfrigérés sur la glace autant que possible.
- Gardez les yeux et les tissus dérivés dans l'obscurité autant que possible jusqu'à ce que l'étape de collecte après l'ultracentrifugation pour éviter photoblanchiment des pigments visuels et la perte de la couleur orange-rose de la forme active des photopigments.
2. Protocole Actions
- Préparer des solutions et des gradients:
- Thaw taurine stocks complètement en utilisant un bain d'eau à 37 ° C.
- Préparer toutes les solutions de solutions d'achat d'actions (tableau 1, les solutions mères) et bien mélanger le saccharose et d'autres ingrédients à l'aide d'un agitateur magnétique pour chaque solution.
- Préparer 15 ml de la solution d'homogénéisation à une concentration finale de 20% de saccharose, 20 mM de Tris pH 7,2 acétate, 2 mM de MgCl2, 10 mM de glucose et 5 mM de taurine.
- Préparer la solution de saccharose à 25% à une concentration finale de 25% de saccharose (en utilisant 70% de saccharose actions), 20 mM d'acétate de Tris pH 7,2, glucose 10 mM et 5 mM de taurine.
- Préparer la solution de saccharose à 60% à une concentration finale de 60% de saccharose (en utilisant une poudre de saccharose), 20 mM de Tris pH 7,2 acétate, 10 mM de glucose et 5 mM de taurine.
- Préparer la solution de lavage à une concentration finale de 20 mM d'acétate de tris pH 7,2 et 5 mM de taurine.
- Préparer la solution de lavage 2à une concentration finale de 10% de saccharose, 20 mM d'acétate de tris pH 7,2 et 5 mM de taurine.
- Préparer la solution de lavage 3 à une concentration finale de 10% de saccharose, 20 mM de phosphate de sodium pH 7,2 et 5 mM de taurine.
- Stabiliser le fabricant de gradient sur un agitateur magnétique et d'insérer une barre d'agitation dans la chambre la plus proche de la sortie où la solution de 60% sera inséré. Utiliser un embout pipette P200 coupure placé à la sortie du tube pour atteindre la vitesse de coulée appropriée.
- Fonte gradients linéaires délicatement en diluant et en agitant la solution de saccharose à 60% avec celui de 25% en utilisant 12 ml de chaque solution (à savoir, au total six tubes pour 80 yeux) dans des tubes d'ultracentrifugation de pré-réfrigérés. Agiter la solution progressivement diluer-saccharose 60% ainsi. Stabiliser la vitesse d'écoulement gradient, versant la solution en douceur et pas trop vite.
NOTE: Afin d'obtenir un gradient linéaire continue, gardez l'ouverture de la pointe de la pipette à droite à la surface de la solution pour l'ensemble de formatio de gradientn. - Laissez les gradients sont assis sur la glace pendant environ 1 h pour la stabilisation. Gardez les gradients réfrigérés jusqu'à leur chargement. Ne secouez pas les tubes pour éviter la perturbation du gradient.
- collecte de tissu:
- Recueillir tissus sous faible lumière rouge. Prenez un oeil dans une main et pousser l'avant avec le bord de la lame de rasoir tout en maintenant le regard loin (pour éviter les éclaboussures; Figure 1). Utilisez la lame de rasoir pour couper le globe oculaire antérieure en deux moitiés (cornée, plus au moins 5 mm dans la sclérotique). Retirez la lentille et retournez l'œilleton intérieur de telle sorte qu'il peut être tenu sur la pointe d'un doigt exposant ainsi la rétine.
- Utilisation de la lame de rasoir à un angle, grattez délicatement la rétine, détacher facilement et apparaissant comme une couche rose, sur la surface de tapetum et couper à la tête du nerf optique (Figure 1). Collecter toutes les rétines en 2 x 50 ml tubes contenant 15 ml de solution d'homogénéisation sur la glace.
- Homo Retinagenization:
- Secouez la suspension vigoureusement à la main pendant 2 minutes afin de perturber les différentes couches de cellules, briser POS hors le reste de la cellule de PR, fragment POS et homogénéiser la suspension rétine.
- Filtre 3x par une double couche de gaze propre pour enlever de grands fragments de tissus et de recueillir l'écoulement continu propres tubes de 50 ml (figure 1). La suspension de la rétine étant assez épais, afin de maximiser le rendement, appuyez doucement sur la gaze pour libérer restants tissus fragmentés après chaque filtration.
- Photorécepteur extérieure fragment de segment (POS) l'isolement:
- Posez délicatement la rétine prep brut, autour de 6-7 ml par tube, plus de 6 x 30 ml tubes d'ultracentrifugation contenant chacun 24 ml de fraîches, réfrigérées continue 25 - gradient de saccharose à 60% (figure 1). Équilibrer les tubes opposés, le cas échéant pour le rotor à utiliser. Ultracentrifugeuse à 106 000 g pendant 50 min à 4 ° C. Éliminer la majeure partie de la solution au-dessus de la bande orange-rose dans le tiers supérieur de gradient par aspiration (figure 2A). Recueillir la bande orange-rose avec une pointe de P1000 coupure dans un bécher. Jeter le reste après neutralisation en utilisant l'eau de Javel (biologique des déchets).
- Diluer avec ~ 4-5 volumes de glace froide Laver une solution. Séparer en autant de tubes de 30 ml au besoin. Centrifuger à 3000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Prenez soin de le surnageant.
- granulés de remettre en suspension dans 10 ml Laver deux solution et tournent à 3000 g pendant 10 min comme détaillé ci-dessus. granulés de remettre en suspension dans 15 ml Laver 3 et tourner de nouveau à 3000 g pendant 10 min. Combinez suspensions de plusieurs pastilles de réduire le nombre de tubes nécessaires avant centrifugation dans Wash 2 et 3 Lavez solutions.
- POS aliquotage sans marquage:
- Remettre en suspension POS dans 10-20 ml de DMEM. Prédilué 10 pi à 490 pi DMEM (01h50) et le comte allongé ainsi que POS tourbillonnait dans unchambre de comptage de cellules (figure 2B). Calculer le rendement et la concentration en particules POS par ml.
NOTE: Le rendement varie en fonction principalement sur l'âge et la souche de porcs / vaches et la taille des yeux, par exemple, une bonne préparation est comprise entre 5 - yeux 8 x 10 9 POS de 80 de porcs. - Décider sur le volume de DMEM final (typiquement de 10 à 20 ml) et ajouter du saccharose pour obtenir une concentration finale de 2,5% de saccharose.
- Préparer des aliquots de la taille souhaitée, par exemple, 5 x 10 7 POS par tube pour la remise en suspension d'un volume de 2 ml pour une expérience de 96 puits à 40 uL / puits. Spin une aliquote pendant 5 min à 2300 xg à température ambiante et d'évaluer la taille de culot. Préparer différentes tailles aliquotes pour différents volumes de la demande comme POS devrait PAS être congelé et décongelé deux fois.
- Congeler aliquotes POS à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
NOTE: Des aliquotes sont stables pendant de nombreux mois. Dans nos mains, non marqué ou étiqueté POS peut être conservé pendant au moins un an.
- Remettre en suspension POS dans 10-20 ml de DMEM. Prédilué 10 pi à 490 pi DMEM (01h50) et le comte allongé ainsi que POS tourbillonnait dans unchambre de comptage de cellules (figure 2B). Calculer le rendement et la concentration en particules POS par ml.
- étiquetage POS et aliquotage:
NOTE: Nous utilisons généralement FITC à étiqueter POS pour la quantification des tests de phagocytose, mais d'autres colorants peuvent être utilisés aussi bien en fonction des besoins.- Remettre en suspension 1 10 mg FITC flacon à 2,5 mg / ml de concentration de 0,1 M Na tampon carbonate pH 9,5 en mélangeant 2,6 ml 0,1 M NaHCO 3 pH 8,4 à 1,4 ml 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (tableau 2, des solutions d'achat d'actions). Tourner pendant une heure à température ambiante tout en protégeant de la lumière et de spin pendant 5 min à vitesse maximale pour sédimenter solides FITC non remises en suspension.
- Reprendre le culot de POS dans 10 ml de solution de lavage 3 (ou DMEM) et ajouter 2 ml de solution pour 80 FITC yeux. Conservez les restes FITC congelé à -80 ° C. Tourner pendant au moins 1,5 heure à température ambiante. Protéger de la lumière en utilisant une feuille d'aluminium.
- Laver POS marqué deux fois en utilisant Wash 3 solution comme décrit dans la section 2.3.4, puis une fois ou deux fois dans du DMEM jusqu'à ce que presque aucune FITC libre est vu dans le surnageant fraction. Remettre en suspension dans du DMEM POS et procédez comme pour POS non marqué pour le comptage et aliquotage (section 2.4).
- Utilisation de POS dans les expériences:
- POS décongeler à température ambiante, et de les garder dans l'obscurité autant que possible se ils sont marqués par fluorescence. Spin pendant 5 min à 2300 xg à température ambiante. Aspirer le surnageant.
- Immédiatement remettre en suspension dans un volume approprié de la solution de dosage comme dicté par l'expérience. En cas de différents moments de défi POS, POS magasin remis en suspension à la température ambiante dans l'obscurité entre les points de temps pendant plusieurs heures.
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Representative Results
La combinaison du gradient de saccharose linéaire et l'ultracentrifugation permet la séparation des différents composants de la suspension de la rétine par densité. Les cellules RPE et les débris plus grande rétiniennes lourds tombent au ou près du bas de la pente (figure 2A). POS plus léger et plus légers des cellules individuelles ou des débris de cellules de la rétine migrent bandes distinctes pour atteindre la moitié supérieure de la pente d'ici la fin de la période de centrifugation. En gardant les yeux et les échantillons dans l'obscurité jusqu'à après l'étape de centrifugation, la bande contenant POS peut être immédiatement reconnu par sa couleur orange vif. La largeur et l'intensité de cette bande dépend de la qualité de gradient et la hauteur du tube (89 mm de hauteur est préféré). Typiquement, quand bien isolé POS doit apparaître allongé, droites ou courbes lorsqu'il est observé sur une lame de microscope (figure 2B). Selon le plan de mise au point sur le microscope, ils peuvent apparaître soit sombre ou brillant. Sinon resussuspendu correctement, ils vont rester en touffes. Se ils sont endommagés (voir paragraphe ci-dessous), ils apparaîtront comme des morceaux beaucoup plus petits, un peu comme un fond «poussiéreux».
Problèmes qui peuvent survenir sont principalement liés à trois questions. Le premier problème possible est que l'étape secouant des homogénats rétiniennes ne est pas assez vigoureux, ce qui conduit à POS restant attaché à PR ainsi diminué le rendement. La deuxième question est possible liée à une mauvaise coulée de gradient ou de la perte de la qualité des dégradés à l'insuffisance de temps de stabilisation avant le chargement ou le tube excessive agitation à ne importe quelle étape avant la collecte. Dans ce cas, les bandes ne peuvent pas être clairement distingués et POS ne peuvent pas être collectées dans le tube correspondant. Enfin, le troisième problème potentiel se pose si le pH de l'une des solutions est faux: membranes POS peut se désintégrer et que des débris de petite POS apparaît sur le microscope lorsque les visualiser pour l'évaluation du rendement.
Purifiée POS peutêtre utilisé pour un certain nombre d'applications différentes liées à l'étude de la fonction phagocytaire des cellules RPE. Les cellules RPE sont généralement utilisés comme des lignées de cellules en culture primaire ou à partir de modèles animaux 32,6,12,18-21. Plus récemment, les cellules RPE dérivées de cellules souches reprogrammées comme iPSC ou ESC ont été utilisés 29,30,27,34. POS isolés servent à tester directement la capacité phagocytaire des cellules RPE mutants, par exemple, POS sont facilement phagocyté par des cellules RPE primaires de souris de type sauvage, tandis que les cellules de beta5 intégrine et de souris knock-out MFG-E8 phagocytent moins POS dans le même laps de temps 6,12. La quantification de la phagocytose POS peut se faire soit par comptage marqué au FITC POS manuellement sur les images au microscope 6 (figure 3a), en utilisant un équipement capable de lire l'intensité de fluorescence 10,24,15,35 ou un cytomètre de flux après trypsinisation des cellules 36,27. Plus récemment, l'apport de POS et de la dégradation a été évaluée on immunoblots sondé opsines 37,38,27.
In vivo, le processus d'absorption de POS se produit séquentiellement comme reconnaissance / précède contraignantes internalisation 6 synchronisés. Les différentes phases de l'absorption peuvent également distingué in vitro en utilisant des procédures expérimentales appropriées 39. Expériences pulse-chase peuvent être effectuées en utilisant le commutateur de température: liaison POS se produit à 20 ° C tandis que l'internalisation a besoin d'une température de 37 ° C de procéder 32,40,7. Cette distinction existe également dans les macrophages, les POS qui peuvent reconnaître aussi bien et dans lequel le mécanisme moléculaire pour éliminer les cellules apoptotiques est très similaire à la machinerie de l'EPR 7. Après FITC-POS phagocytose, la liaison et l'internalisation peuvent être quantifiés dans des échantillons séparés par trempe du FITC-fluorescence de POS lié à la surface lors de la pré-incubation avec du bleu trypan avant de fixer les cellules 10. Dans les cellules traitées bleu trypan, seulement internal POS sera visualisée et POS lié peut être quantifiée en soustrayant POS interne à partir de la numération totale de fluorescence de POS. Lorsque la phagocytose est évaluée sur immunoblots obtenus en utilisant des lysats recueillies après la provocation de POS, un traitement équivalent à l'EDTA avant la lyse permettra au détachement de POS lié à la surface de la cellule pour interne ou POS totale comparaison de phagocytose 37,38.
D'énormes progrès ont été réalisés dans l'identification des machines phagocytaires grâce à des expériences utilisant des POS purifiée. recrutement de la protéine peut être évaluée par immunofluorescence co-localisation des dosages 13-15,19-21,37,41 (figure 3B). le recrutement de protéines ou d'activation peuvent être validés sur immunoblots après immunoprécipitation ou en cochant la phosphorylation 7,10,12-15,17,19,20,27,35,37,41 (figure 3C). Des études plus ouvertes sur l'évolution globale de l'expression génique après différents temps de défi POS ont unLSO été effectuée 42.
POS isolé peut également être utilisé pour étudier POS élimination par les cellules de l'EPR. En effet, au cours du vieillissement normal et / ou lorsque POS ne sont pas digérés correctement, des produits de dégradation de POS accumulent progressivement comme des dépôts de lipofuscine et peuvent conduire à des pathologies dues à des mécanismes d'oxydation 24,27. Ainsi, la compréhension des effets de lumière et les dommages oxydatifs liés peut exiger défi POS de cellules RPE 18,26. Enfin, répété l'alimentation avec 27 normales ou oxydées 25,28 POS peuvent être utilisés pour induire des effets cumulatifs dans les cellules de l'EPR en culture afin de comprendre les mécanismes pathologiques qui se développent in vivo sur des périodes de temps plus longues.
Figure 1. Retina isolement yeux porcins. Dessin montrant les différentes étapes de la dissection de l'œil afinà recueillir et à homogénéiser la rétine, avant l'étape d'ultracentrifugation sur des gradients de saccharose en continu, en commençant en haut à gauche. Une lame large de 60 mm est utilisé pour découper la séquence de l'oeil d'un côté puis de l'autre afin de pouvoir étirer intérieur vers l'extérieur sur un bout de doigt, ce qui expose la rétine. Ensuite, la rétine est recueilli par la mise au rebut à partir du tapetum avec la lame. Rétines réunis sont ensuite agité soigneusement dans du tampon d'homogénéisation, filtrée trois fois par de doubles couches de gaze et délicatement versé sur le dessus du linéaire 25 - 60% gradient de saccharose.
Figure 2. POS purification des yeux de porc (A) de la photographie des différentes couches observées sur un 25 -. Gradient de saccharose de 60% après ultracentrifugation d'homogénats de la rétine. La bande orange correspond à POS être collectées. Les blancs correspond de bande supérieureà POS non liée matériaux, ainsi que les gros débris près de la migration ou au fond du tube. (B) Image de POS isolé observé sur un microscope à champ lumineux sur une cellule de comptage pour l'évaluation du rendement. POS existent dans allongé (a, a ', c, d) et tourbillonné (a, a', b, b ', d) formes. Certains POS allongée peut afficher une extrémité enroulée (c). Lors de la modification du plan de mise au point, POS apparence changements de brillant à l'obscurité (comparer A et A ', B et B'). Panneau de e illustre POS qui ne ont pas été remises en suspension correctement et résider en touffes. Panneau f montre POS qui ont été endommagés et ne sont pas utilisables, seuls les petits morceaux sont détectables. Échelle de 10 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figueure 3. Analyse de la phagocytose de l'EPR en utilisant POS purifiée. (A) image au microscope confocal et la quantification correspondante du nombre de phagosomes par cellule avec le temps montrant que POS marqué au FITC (vert) ont été moins phagocyté par RPE cellules primaires isolées de beta5 intégrine KO (β5 - / -) par rapport au type sauvage de souris (WT ou β5 + / +) contrôle comme indiqué. Noyaux (rouge) ont été marqués à l'aide DAPI et jonctions cellulaires (bleu) en utilisant le marqueur de jonctions serrées ZO-1. Échelle barres 10 um. . Reproduit de © Nandrot et al, 2004, publié à l'origine dans The Journal of Experimental Medicine 200 (12): 1539-1545. (B) images de microscope confocal montrant co-localisation (jaune-magenta, le panneau en bas à droite) entre les protéines β5-fusion GFP (vert, panneau en haut à gauche), aVß5 de surface récepteurs d'intégrine (rouge, en haut à droite) et POS (bleu, fondpanneau de gauche). La barre d'échelle 10 um. . Reproduit de Nandrot et al, 2012, publié à l'origine en biologie de la cellule 104 (6): 326-341, © Portland Press Limited. (C) Immunoblots (BM) et correspondant quantification (QUANTIF.) Montrant ce défi POS (POS) augmente la phosphorylation de FAK sur le résidu Tyr397 rapport sans traitement (/) ou remis en question avec le milieu seul (m) dans les cellules de contrôle (c) tandis que les cellules exprimant une forme inactivée de FAK (F) ne réagissent pas, comme indiqué. Reproduit de Finnemann, 2003, publié à l'origine dans EMBO Journal 22 (16):. 4143-4154 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2 Chamber gradient maker | Gradient maker with 30 ml chambers | ||
| 3 mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| Small size magnetic stir bar | Stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| Red safelight lamp | Inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25 x 89 cm tubes | Beckman | 344058 | Ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30 ml centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | Ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | Swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | Rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | Fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| Counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| Dark ice buckets with lids | |||
| Scales | |||
| Magnetic stirrer and upholding pole | |||
| Refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| Labcoat | Health and safety | ||
| Gloves | |||
| Sleeve protectors | |||
| Goggles | |||
| Absorbent pads | |||
| Biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades | Dissection | 60 mm/2.25 inch wide razor blades | |
| 15 cm plastic dish | |||
| Sterile gauze sheets | |||
| 15 and 50 ml tubes | Common consumables | ||
| Microtubes | |||
| Aluminum foil | |||
References
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