Abstract
Retina pigment epitel (RPE) hücreler, fotoreseptör dış segmentleri (POS) harcanan yaşlı uzak parçalarının fagositoz hayati fonksiyonlarından biri Analizi in vitro yapılabilir. Fototransdüksiyon makineleri içeren membranöz diskler yığınları ile fotoreseptör dış segmentleri sürekli retinada yenilenmektedir. Harcanan POS RPE hücreleri tarafından günlük olarak elimine edilir. Kemirgen, domuz / sığır ve insan RPE hücreleri, benzer bir şekilde, çeşitli türlerden POS tanır. Küçük değişkenlik deneylerin büyük bir dizi performans sağlamak için, POS büyük bir stok domuz gözlerinin izole edilir ve eşit miktarlarda dondurulmuş olarak saklanır. Bu protokol, karanlıkta muhafaza edildiğinde, turuncu bir renk gösterir photopigments özelliklerini yararlanır. Loş kırmızı ışık altında, yarım kesilmiş açılan eyecups bir tampon içinde retinae toplanır. retinal hücre süspansiyonu, homojen bir devamlı sükroz gradyanı üzerinde süzüldü ve sütuna yüklenir. Cen sonratrifugation POS karakteristik turuncu bir renge sahiptir gradyanının üst kısmında ayrı bir bant bulunur. POS daha sonra toplandı, bükülmüş, yıkama tampon içinde yeniden süspansiyon haline getirildi, sırasıyla, sayılır ve bölünür. Bu şekilde elde edilen POS fagositoz tahlilleri ve POS uygulamasından sonra, çeşitli zamanlarda protein aktivasyonu, lokalizasyonu veya etkileşim analizi için kullanılabilir. Alternatif olarak, POS ör. Florofor ile etiketlenebilir örn., FITC, daha sonra floresan bağlayıcı POS miktarının veya yutulma için aliquoting önce. Diğer olası uygulamalar oksidatif stres ya da RPE hücrelerinin yaşlanma etkilerini incelemek için stres koşulları ile birlikte modifiye POS veya POS meydan kullanımını içerir.
Introduction
Retinasında, görme beyinde görsel alana kadar nöronlar arasındaki iletilebilir bir sinyal haline dönüştürülmeden önce, opsins adı ışığa moleküllerin izomerizasyonu ile tetiklenir. Bu moleküller, fotoreseptör hücrelerinin dış segment bölümlerini (PR) oluşturan krep benzeyen membranöz disklerin yığınlarının içinde gömülü. Işık ve oksidatif stres dolayısıyla önemli seviyelere sürekli maruz tabi olmak, PR sürekli potansiyel oksidatif hasarı sınırlamak için dış segmentleri yenilemek. Fotoreseptör dış segmentleri komşu retina pigment epitel (RPE) hücrelerinin apikal mikrovilluslu yakın temas halindeyiz. RPE hücreleri, kan-retina bariyerinin dış kısmını oluşturan ve melanin pigmentleri, fotoreaktif opsin bileşeni Retinal'in yeniden izomerizasyonuna sağlayan besin ve g yoluyla ışık ışınları söndürme gibi fotoreseptör sağlık ve fonksiyonu 1 için çok önemli olan çok sayıda görev, sağlamakPR metaboliti bertaraf katılan faktörler rowth.
Buna ek olarak, RPE hücreleri POS geçirdi ve onların bileşenleri, memeli retina 2,3 sirkadiyen ritim tarafından düzenlenen bir günlük işgal geri dönüşüm ortadan kaldırmak. sundurma POS boşluk PR hayatta kalmak için kesinlikle gereklidir. Tamamen kaldırılmıştır zaman, POS enkaz birikir ve PRs hızlı görme kaybı 4,5 neden dejenere. Ritmik profil kaybetti ve sabit aktivitesi ile değiştirilirse, PR ve RPE kusurlar yaş 6 birikir. Bu nedenle, bu da fonksiyon bozukluğu ile bağlantılı fenotipler anlaşılması için in vitro RPE fagositoz moleküler düzenleme karakterize etmek için çok önemlidir. İlginçtir, RPE hücrelerinde moleküler makineleri apoptotik hücreleri temizlemek için makrofajlar tarafından kullanılan bir çok benzer ve her ikisi de fagositik enkaz 7-9 maruz fosfatidilserin tanınması bağlıdır. Yine, RPE hücreleri ve makrofajlar ph düzenleyenmakrofajlar karşılaşma anda apoptotik hücrelerin hemen ortadan kaldırılması için tercih olarak agocytosis farklı, RPE hücreleri ritmik dış kesimleri ile sürekli temas rağmen bir günde sadece bir kez POS yutmak ise. Bu henüz tam olarak anlaşılmış değildir özgü düzenleme mekanizmalarını önerir.
RPE fagositik makine implike moleküllerin bir çoğu bu tanımlanmış ya da izole edilmiş bir POS ve hücre kültürü fagositoz tahlillerin kullanımı sayesinde doğrulanmıştır. onun ligandı MFG-E8 ile koordineli olarak RPE apikal hücre yüzeyinde bulunan alfa beta5'in integrin reseptörü, ardından MerTK tirozin kinaz reseptörü 13-15 yoluyla içselleştirilmiş olan POS 10-12, özellikle bağlanır. CD36 çöpçü reseptör POS alımı katılmak ve hızını 16,17 etkilemek için gösterilmiştir, ve POS yüzeyi 18 oksitlenmiş fosfolipidlerin bir sensör olarak kullanılabilir. Içselleştirilmesi F-aktin hücre iskeleti-eşek işe ihtiyacıBöyle anneksin 2 19, miyozin II 20 ve miyozin VIIA 21,22 olarak ociated proteinler. In vitro olarak doğal ya da oksitlenmiş POS da az sindirilmiş oksitlenmiş POS 23-28 birikimine bağlı, in vivo olarak, RPE hücreleri yaşlanma fenotipleri anlamak için kullanılmaktadır. akış önleme hücrelerinden hasıl RPE hücrelerinin üretimi, hayvanların ya da hasta 29,30,27 nakledilen önce hücrelerin özelliğe kanıtlamak için kullanılan izole edilmiş bir POS için yeni bir uygulama başlatmıştır.
İlk 1987 yılında 31 Molday ve arkadaşları tarafından tarif, sığır POS izolasyonu için protokol (11- sis retina taşıyan) ağartılmamış retina photopigment karakteristik portakal görünümü gözlem sürekli sakaroz Yokuşta retina homojenatlarının bir Ultrasantrifügasyon adımını birleştirir. Geçtiğimiz 10 yıl içinde, deli dana hastalığı riskini en aza indirmek amacıyla alınan önlemler nedeniyle, domuz gözlerin kullanımı increasi haline gelmiştirngly belirgin. Burada açıklanan protokol domuz veya numune alınır ve uzun bir süre boyunca saklanabilir sığır gözlerden POS büyük miktarlarda elde etmek için nasıl kullanılacağını gösterir. Bu POS hazırlanması ve analiz 32,33,21,22 başına hayvan çok sayıda kullanımını gerektiren, kemirgen gözlerden POS hazırlanması ihtiyacını ortadan kaldırmaktadır. Buna ek olarak, floresan molekülleri kullanarak depolama önce POS etiketleme ile ilgili ayrıntılar ölçmek ve fagositoz tahlil 32,10 sonra etiketleme POS göre bazı uygulamalar için basitleştirilmiş ve karşılaştırılabilir bir şekilde POS görselleştirmek için, verilir. Bu nedenle, bu büyük stoklar deneyler birçok farklı tipte yeniden üretilebilirlik ve kullanım kolaylığı için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu POS izolasyon deney zaman alıcıdır ve POS depolamadan önce etiketlenmiş eğer tamamlamak için 12 saat kadar gerektirebilir. protokol 1997 10 SC Finnemann ve arkadaşları tarafından 1987 31 RS Molday ve arkadaşları tarafından yayınlanan ve modifiye bir kağıt adapte edilmiştir.
Hayvanlar Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım Vizyon ve Oftalmoloji (ARVO) Beyanında Araştırma Derneği göre ele alınmıştır. Protokoller gözden ve Üniversite Pierre ve Marie Curie-Paris 06 Charles Darwin Etik Kurulu ve Fordham Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
1. Genel Kurma
- Mümkün Kesim sonrası taze domuz 80 veya inek gözleri gibi taze kısa sürede elde edilir ve karanlıkta soğutulmuş tutmak. Şirket aynı şekilde devam böylece sağlayıcısına talimatları sağlayın. Bu protokol, 80 gözler için optimize edilmiştir. IçinDaha fazla gözlerle devam ve büyük hisse almak (örneğin, 160 gözlerden), çözüm miktarları iki katına ve Ultrasantrifügasyon 2 mermi yerine; Havuz örnekleri daha sonra toplama aşamasında (adım 2.2.2 bakınız).
- Kırmızı emniyet ışığı lamba, emici pedler bankta kurmak, (Malzeme tablosu) mendil. (... Vitreus kullanılmayan göz parçaları,) 15 cm yemekleri ve biyolojik tehlikeli atık toplama torbaları için hazırlayın. Dar Labcoat, eldiven, kol koruyucuları ve gözlük takın.
- Önlemler:
- Sonra tüm çözümleri Öncesi soğuk her aşamasında soğuk tutmak. Mümkün olduğunca buz üzerinde soğutulmuş gözleri ve degradeler tutun.
- Ultrasantrifüje edildikten sonra toplama aşaması görsel pigmentler ve photopigments aktif formunun turuncu-pembe bir renk kaybı ışıkla ağartma bilmek kadar mümkün olduğu kadar karanlıkta gözler ve elde edilen dokuların tutun.
2. Protokol Eylemleri
- Çözüm ve geçişlerini hazırlayın:
- Çözülme taurin stoku tamamen 37 ° C su banyosu kullanılarak.
- İnhibitörler, stok çözeltilerden tüm çözümler (Tablo 1, stok çözeltileri) hazırlayın ve iyice her çözelti için bir manyetik karıştırıcı kullanılarak, diğer katkı maddeleri ile sükroz karıştırın.
- % 20 sakroz nihai bir konsantrasyona kadar homojenleştirme çözeltisi 15 ml hazırlayın, 20 mM asetat pH 7.2 Tris, 2 mM MgCl2, 10 mM glikoz ve 5 mM taurin.
- (% 70 sukroz stok kullanarak)% 25 sukroz, 20 mM Tris asetat pH 7.2, 10 mM glikoz ve 5 mM taurin bir son konsantrasyon elde etmek üzere% 25 sukroz çözeltisi hazırlayın.
- (Sakaroz tozu kullanarak)% 60 sakroz ve nihai bir konsantrasyona kadar% 60 sukroz çözeltisi hazırlayın, 20 mM asetat pH 7.2, 10 mM glükoz ve 5 mM tris taurin.
- 20 mM Tris asetat pH 7.2 ve 5 mM taurin bir son konsantrasyon elde etmek üzere, yıkama 1 çözelti hazırlayın.
- Yıkama 2 çözeltisi hazırlayın% 10 sukroz, 20 mM Tris asetat pH 7.2 ve 5 mM taurin bir nihai konsantrasyona seyreltildi.
- % 10 sukroz, 20 mM sodyum fosfat pH 7.2 ve 5 mM taurin bir son konsantrasyon elde etmek üzere, yıkama 3 çözelti hazırlayın.
- Manyetik bir karıştırıcı ile gradyan yapıcı istikrarlı ve% 60 çözelti eklenir çıkmak için en yakın odası içinde bir karıştırma çubuğu ile ekleyin. Uygun döküm hızı elde etmek için, borunun çıkışında yerleştirilen bir kesme P200 pipet ucu kullanarak.
- Ince seyreltilmesi ve önceden soğutulmuş ultrasantrifüjdeki tüpleri her çözümden (80 gözler için, yani toplam 6 tüpler) 12 ml kullanılarak% 25 biriyle% 60 sakaroz çözüm karıştırılarak doğrusal degradeler Cast. Iyi kademeli-seyreltilmesi% 60 sukroz solüsyonu karıştırın. Çok hızlı sorunsuz ve çözüm dökme, gradyan akış hızını sakinleştirmeye.
NOT: Sürekli, doğrusal degrade almak için, sağ tamamı degrade kutu kurma için çözeltinin yüzeyinde pipet ucu açıklığı tutmakn. - Geçişlerini istikrar için yaklaşık 1 saat boyunca buz üzerinde bekletin. Yüklenen kadar soğutulmuş geçişlerini tutun. Degrade aksamaması için tüpler sallamayın.
- Doku koleksiyonu:
- Loş kırmızı ışık altında dokuları toplayın. Bir yandan içine bir göz atın ve uzak göz tutarken jilet kenarı ile ön karıştırmak (sıçramasını önlemek için, Şekil 1). 2 yarısı (kornea artı sklera içine en az 5 mm) içine ön gözün kesmek için jilet kullanın. Lensini çıkarın ve bir parmak böylece retinanın açığa ucu üzerinde tutulabilir böylece içini Göz yuvası çevirin.
- Bir açıyla jilet kullanarak, yavaşça kolayca ayırarak ve Tapetum yüzeyinden, pembemsi bir tabaka olarak görünen ve optik sinir başı (Şekil 1) kesilmiş, retina kazımak. 2 x 50 mL tüpler buz üzerinde homojenizasyon çözeltisi 15 ml içeren, her tüm retina toplayın.
- Retina homogenization:
- Farklı hücre tabakaları bozabilir PR hücre fragman POS geri kalanı kapalı POS kırmak ve retina süspansiyon homojen hale getirmek amacıyla 2 dakika süreyle elle kuvvetli bir şekilde süspansiyon çalkalayın.
- Temiz bir gazlı bez bir çift katmanı üzerinden filtre 3x geniş doku parçaları kaldırmak ve akış yoluyla temiz 50 ml tüpler (Şekil 1) toplamak için. retina süspansiyon yavaşça, verimi en üst düzeye çıkarmak, her süzüldükten sonra geriye kalan parçalanmış dokuların serbest bırakmak için gazlı bez üzerine basın, oldukça kalın olan.
- Fotoreseptör dış segment fragmanı (POS) izolasyon:
- % 60 sukroz gradyanı (Şekil 1) - 30 x 6 ml üzerinde ultrasantrifüjdeki tüpleri taze soğutulmuş sürekli 25 her içeren 24 ml tüp başına 7 ml - Yavaşça, 6 civarında ham retina hazırlık yatıyordu. Rotor kullanılacak uygun olarak karşı tüpleri dengeleyin. 4 ° C'de 50 dakika boyunca 106,000 x g'de ultrasantrifüj. Aspirasyon (Şekil 2A) tarafından degrade üst üçte turuncu-pembe bandın üstünde çözümün en çıkartın. Bir behere bir cut-off P1000 ucu ile turuncu-pembe bant toplayın. Çamaşır suyu (biyolojik atık) kullanarak nötralize sonra geri kalanını atın.
- Buz soğukluğunda Wash 1 çözelti 5 hacim -, 4 ile seyreltin. Gerektiği kadar 30 ml tüpler içine ayırın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüjleyin. Dikkatle süpernatant atın.
- Yukarıda ayrıntılı olarak 10 ml pelet tekrar 10 dakika boyunca 3.000 xg'de 2 çözümü ve spin yıkayın. 15 ml pelet tekrar 3 kez yıkanır ve 10 dakika boyunca 3000 x g hızında tekrar dönerler. Wash 2 santrifüj önce gerekli tüplerin sayısını azaltmak ve 3 çözümleri yıkayın birkaç pelet süspansiyonlar birleştirin.
- POS etiketleme olmadan aliquoting:
- 20 ml DMEM - 10 süspanse POS. Seyreltme 10 490 ul DMEM (01:50) 'de ul ve whirled POS yanı sıra uzatılmış sayısıhücre sayım odası (Şekil 2B). ML başına POS parçacıklar halinde verim ve konsantrasyon hesaplayın.
NOT: - 8 x 10 9 POS 80 domuz gözleri verim örneğin yaş ve gerginlik domuz / inek ve gözlerinin büyüklüğü, çoğunlukla bağlı olarak değişir, iyi bir hazırlık 5 değişmektedir. - Nihai DMEM hacmi karar (tipik olarak 10-20 mi) ve% 2.5 sükroz bir son konsantrasyon elde etmek üzere sukroz ekleyin.
- Örneğin, istenilen büyüklükte alikotlarının hazırlayın / göz 40 ul, 96 oyuklu bir deney için 2 ml'lik bir yeniden süspansiyon hacmi için tüp başına 5 x 10 7 POS. Oda sıcaklığında 2300 x g'de 5 dakika boyunca 1 kısım Spin ve topak boyutunu değerlendirmek. POS kez donmuş ve çözülmüş olmaMAlıdır gibi farklı uygulama birimleri için çeşitli kısım boyutları hazırlayın.
- Bir sonraki kullanıma kadar -80 ° C 'de, POS alikotları dondurun.
NOT: Bu süspansiyonun tam bölenleri birçok ay boyunca stabildir. Bizim ellerde, etiketsiz veya etiketli POS en az bir yıl süreyle saklanabilir.
- 20 ml DMEM - 10 süspanse POS. Seyreltme 10 490 ul DMEM (01:50) 'de ul ve whirled POS yanı sıra uzatılmış sayısıhücre sayım odası (Şekil 2B). ML başına POS parçacıklar halinde verim ve konsantrasyon hesaplayın.
- POS etiketleme ve Alikotlama:
NOT: Biz genellikle fagositoz deneyleri ölçümü için POS etiketlemek için FITC kullanın, ancak diğer boyalar kullanılan yanı sıra ihtiyaçlarına bağlı olarak olabilir.- 1.4 ml 0.1 M Na-2 CO 3, pH 11.5 (Tablo 2, stok çözeltileri) ile 2.6 ml 0.1 M NaHCO 3 pH 8.4 karıştırılarak 0.1 M Na karbonat tampon pH 9.5 içinde 2.5 mg / ml bir konsantrasyonda yeniden süspanse 1: 10 mg FITC bir tüpe konulmuştur. Olmayan yeniden süspansiyon haline getirilmiş, FITC katı pelet maksimum hızda 5 dakika boyunca hafif ve spin korurken, oda sıcaklığında 1 saat süre ile döndürür.
- Yıkama 3 çözeltisi (ya da DMEM), 10 ml POS pelet yeniden süspanse edin ve 80 gözler için FITC 2 ml solüsyon ilave edin. -80 ° C 'de dondurulmuş bir artık, FITC saklayın. Oda sıcaklığında en az 1.5 saat için döndürün. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun.
- Bölüm 2.3.4'de tarif edildiği gibi, hemen hemen hiç FITC yüzer f görülmeyene kadar sonra bir kez ya da iki kez DMEM içinde iki kere yıkayın 3 çözeltisi kullanılarak etiketli POS yıkayınreaksiyona karşı. DMEM yeniden süspanse POS ve sayma ve şişelemeden (bölüm 2.4) için etiketsiz POS gibi devam edin.
- Deneylerde POS kullanılması:
- Çözülme oda sıcaklığında POS ve floresan etiketli ise mümkün olduğu kadar karanlıkta tutun. RT'de 2.300 xg'de 5 dakika Spin. Süpernatant aspire.
- Deney tarafından belirlenen hemen tahlil çözeltinin uygun hacmi içinde yeniden süspanse edin. POS meydan farklı zamanlarda durumunda, mağaza birkaç saat zaman noktaları arasında karanlıkta oda sıcaklığında POS yeniden süspansiyon haline getirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
lineer sakroz derecesi ve ultra-santrifüj kombinasyonu yoğunluğu retinal süspansiyon, farklı bileşenlerin ayrılmasına izin verir. Ağır büyük retina döküntü ve RPE hücreleri gradyanı (Şekil 2A) tabanına veya yakınındaki batar. Retinadan Çakmak POS ve hafif tek tek hücreler veya hücre enkaz santrifüj dönemi sonunda degrade üst yarısını ulaşmak için ayrı bantları göç. Santrifüj adım sonrasına kadar karanlıkta gözleri ve örnekleri tutarak, POS içeren grup derhal parlak turuncu rengi ile ayırt edilebilir. Bu bandın genişliği ve yoğunluğu degrade kalitesi ve tüp yüksekliği (89 mm yükseklik tercih edilir) bağlıdır. Uygun bir şekilde izole edildiğinde, bir mikroskop lamı (Şekil 2B) üzerinde gözlenen Tipik olarak, POS düz ya da bükülmüş uzunlamasına görünür olmalıdır. Mikroskop odak düzlemi bağlı olarak, karanlık veya parlak ya görünebilir. Değil resus Eğerdüzgün pended, onlar yığınlarda kalacak. Onlar (aşağıda paragrafa bakın) zarar görmüşse, onlar biraz bir 'tozlu' arka plan gibi çok daha küçük parçalar, görünecektir.
Ortaya çıkabilir Sorunları üç konulara çoğunlukla ilişkilidir. Birincisi, olası sorun retina homojenatlarının çalkalama aşaması azalma verim böylece PRs bağlı kalan POS yol açar, yeteri kadar güçlü olmamasıdır. yükleme veya aşırı tüp toplama önce herhangi bir aşamada sallamadan önce ikinci olası sorunu yetersiz stabilizasyon zaman kötü degrade döküm veya degrade kalite kaybı bağlıdır. Bu durumda, bantları düzgün ayırt edemez ve POS ilgili tüp içinde tahsil edilemez. POS membranlar parçalanır olabilir ve verim değerlendirmesi için onları görselleştirmek zaman sadece küçük POS enkaz mikroskop görünür: çözümlerin herhangi pH yanlış ise Nihayet, üçüncü potansiyel sorun ortaya çıkar.
Saf POS canRPE hücrelerinin fagositik işlevi çalışmak ilişkin farklı bir dizi uygulamalar için kullanılabilir. RPE hücreleri, genellikle hücre çizgileri ya da hayvan modellerinde 32,6,12,18-21 birincil kültürde kullanılırlar. Daha yakın zamanda, IPSC veya ESC gibi Yeniden programlanan akış önleme hücrelerinden hasıl RPE hücreleri 29,30,27,34 kullanılmıştır. İzole edilmiş POS doğrudan mutan RPE hücrelerinin fagositik yeteneği test etmek için hizmet eder; örneğin beta5 integrin MFG-E8 eksiği olan farelerden alınan hücrelerin aynı süre içinde daha az POS fagosite ise POS hali hazırda, vahşi tip farelerden primer RPE hücreleri fagosite edilir 6,12. POS fagositoz miktarının belirlenmesi yapılabilir, ya da mikroskop resim 6 (Şekil 3A) el ile FITC-işaretli POS sayma floresan yoğunluğu 10,24,15,35 ya da hücre tripsinizasyon 36,27 sonra bir akış sitometrisi okuyabilen ekipmanı kullanılarak. Daha yakın zamanlarda, POS alımı ve bozulma o değerlendirilmiştiropsins 37,38,27 için incelenir N bağışıklık lekeleriyle.
In vivo olarak, POS alımı süreci içselleştirilmesi 6 senkronize tanıma / bağlanma öncesinde olarak sırayla ortaya çıkar. alımından farklı evreleri de uygun deneysel prosedürler 39 ile in vitro ayırt edebilirsiniz. Darbe kovalayıcı deneyler, sıcaklık anahtarı kullanılarak yapılabilir: içselleştirme 32,40,7 devam etmek için 37 ° C bir sıcaklığa ihtiyacı olduğu POS bağlayıcı 20 ° C'de meydana gelir. Bu fark, apoptotik hücrelerin ortadan kaldırmak için de ve burada moleküler yapıların POS tanıyabilir makrofajlar, var RPE en makine 7 çok benzer. FITC POS fagositoz sonra bağlanma ve içselleştirme hücreleri 10 sabitleme önce tripan mavisi ile ön-inkübasyon sırasında yüzeye bağlı POS FITC floresan söndürülerek ayrı örneklerde belirlenebilir. Tripan mavisi ile muamele edilmiş hücrelerde, tek stajyerimark POS görüntülenmiştir olacak ve bağlı POS toplam POS floresan sayısı iç POS çıkarılarak tayin edilebilir. Fagositoz POS mücadeleden sonra toplanan lizatlarını kullanılarak elde edilen bağışıklık benekleri üzerinde değerlendirildiğinde, lizis önce EDTA ile eşdeğer bir tedavi toplam POS fagositoz karşılaştırma 37,38 karşı iç hücre yüzeyinde bağlı POS dekolmanı sağlayacaktır.
Olağanüstü gelişmeler saflaştırılmış POS kullanan deneylere fagositik makine sayesinde tanımlama yapılmıştır. Protein alımları imüno-co-lokalizasyon deneyleri 13-15,19-21,37,41 (Şekil 3B) ile değerlendirilebilir. Protein alımı veya aktivasyon immunoprecipitation sonra immunoblötları veya fosforilasyon 7,10,12-15,17,19,20,27,35,37,41 (Şekil 3C) kontrol tarafından onaylanmış olabilir. POS meydan farklı kez aldıktan sonra genel gen ifadesi değişiklikler hakkında daha fazla açık uçlu çalışmalarLSO 42 yapılmıştır.
İzole POS da RPE hücreleri tarafından POS eleme incelemek için kullanılabilir. Nitekim, normal yaşlanma sırasında ve / veya POS düzgün sindirmek değilken, POS bozunma ürünleri lipofusin mevduat olarak yavaş yavaş birikir ve oksidasyon mekanizmaları 24,27 nedeniyle patolojiler yol açabilir. Bu nedenle, ışık ve ilgili oksidatif hasarın etkilerini anlamak RPE hücrelerinin 18,26 POS meydan gerektirebilir. Son olarak, normal bir 27 ya da oksitlenmiş 25,28 POS uzun süreler boyunca in vivo gelişebilir patolojik mekanizmalar de kültür içinde RPE hücreleri kümülatif etkileri indüklemek için kullanılabilir olan, besleme tekrarladı.
Domuz gözlerden Şekil 1. Retina izolasyon. Sırayla göz diseksiyon farklı aşamalarını gösteren Çizimtoplamak ve üst sol başlayan sürekli sakaroz geçişlerini, üzerinde ultrasantrifügasyon adımından önce retina homojenize etmek. 60 mm genişliğinde bir bıçak ve böylece retina açığa, bir parmak ucu ile iç dışarı uzatmak mümkün olması için, bir tarafta göz ardışık kesme ve sonra da diğer için kullanılır. Sonraki, retina bıçak ile tapetum onu hurdaya tarafından toplanır. Havuzlanan retinae sonra, homojenizasyon tamponu içinde iyice çalkalandı, süzüldü 3 kez gazlı çift tabakası içinden ve ince doğrusal 25'in üzerine dökülür -% 60 sukroz gradyanı.
Domuz gözlerinin Şekil 2: POS saflaştırma 25 görülen değişik tabakaların (A) Fotoğraf -. Retina homojenatlarının ultrasantrifüj sonra% 60 sukroz gradyanı. turuncu bant tahsil edilecek POS karşılık gelir. beyaz üst bant karşılık gelirolmayan POS ile ilgili malzemeler, yanı sıra yakın veya tüpün dibinde göç büyük enkaz. Verim değerlendirmesi için bir sayma hücre üzerinde parlak bir alan mikroskobu üzerinde görüldüğü gibi izole POS (B) Resim. POS (a, a, uzatılmış mevcut olan ', c, d) ve (a, a hızla dönerek', b, b ', d) oluşturur. Bazı uzatılmış POS sarmal ekstremite (c) görüntüleyebilirsiniz. Odak düzlemini değiştirirken, koyu parlak POS görünüm vardiya (a ve a ', B ve b' karşılaştırın). Panel e doğru yeniden süspanse ve topaklar ikamet henüz POS göstermektedir. Panel f hasarlı ve kullanışlı değildir edilmiştir POS gösterir, sadece küçük parçalar saptanabilir. 10 mikron Ölçek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
İncirsaflaştırılmış POS kullanarak RPE fagositozun ure 3. Analiz. (A) Konfokal mikroskop resim ve FITC-etiketli POS (yeşil) daha az beta5 integrin izole RPE birincil hücreler tarafından fagosite edilmiş olduğunu gösteren zaman hücre başına fagosomların sayısının tekabül ölçümü nakavt (β5 - / -), vahşi tip belirtildiği gibi (wt ya da β5 + / +) kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında. Çekirdekler (kırmızı) sıkı bir bağlantı belirteci ZO-1 kullanarak DAPI ve hücre kavşakları (mavi) kullanılarak işaretlendi. Ölçek 10 mikron barlar. . © Nandrot ark, 2004 çoğaltılamaz, aslen Deneysel Tıp 200 (12) Dergisi'nde yayınlanan: 1539-1545. (B) β5-GFP füzyon proteinleri (yeşil, sol üst panel), yüzey αvβ5 integrin reseptörleri (kırmızı, sağ üst panel) ve POS (mavi, alt arasındaki işbirliği yerelleştirme (sarı-kırmızı, sağ alt panel) gösteren Konfokal mikroskop resimlerisol panel). Ölçek çubuğu 10 mikron. . Nandrot ark, 2012 çoğaltılamaz, başlangıçta Cell 104 (6) Biyoloji yayınlanan: 326-341, © Portland Press Limited. Tedavi (/) karşılaştırmalarının veya kontrol hücrelerinde tek başına ortamı (m) (c) meydan (C) Muafiyet benekleri (DB) ve karşılık gelen miktar (quantif.) Bu POS meydan (POS) gösteren Tyr397 kalıntısında FAK fosforilasyonunu arttıran FAK (F) 'nin bir inaktive edilmiş biçimde ifade eden hücreler tepki yok iken olarak gösterilir. Başlangıçta EMBO Journal 22 yılında yayınlanan Finnemann, 2003, çoğaltılamaz (16):. 4143-4154 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2 Chamber gradient maker | Gradient maker with 30 ml chambers | ||
| 3 mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| Small size magnetic stir bar | Stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| Red safelight lamp | Inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25 x 89 cm tubes | Beckman | 344058 | Ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30 ml centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | Ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | Swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | Rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | Fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| Counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| Dark ice buckets with lids | |||
| Scales | |||
| Magnetic stirrer and upholding pole | |||
| Refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| Labcoat | Health and safety | ||
| Gloves | |||
| Sleeve protectors | |||
| Goggles | |||
| Absorbent pads | |||
| Biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades | Dissection | 60 mm/2.25 inch wide razor blades | |
| 15 cm plastic dish | |||
| Sterile gauze sheets | |||
| 15 and 50 ml tubes | Common consumables | ||
| Microtubes | |||
| Aluminum foil | |||
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Young, R. W., Bok, D. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process. J. Cell Biol. 42 (2), 392-403 (1969).
- LaVail, M. M. Rod outer segment disk shedding in rat retina: relationship to cyclic lighting. Science. 194 (4269), 1071-1074 (1976).
- Mullen, R. J., LaVail, M. M. Inherited retinal dystrophy: primary defect in pigment epithelium determined with experimental rat chimeras. Science. 192 (4241), 799-801 (1976).
- Nandrot, E., et al. Homozygous deletion in the coding sequence of the c-mer gene in RCS rats unravels general mechanisms of physiological cell adhesion and apoptosis. Neurobiol. Dis. 7 (6 pt B), 586-599 (2000).
- Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. J. Exp. Med. Nandrot, E. F., Kim, Y., Brodie, S. E., Huang, X., Sheppard, D., Finnemann, S. C. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Macrophage and retinal pigment epithelium phagocytosis: apoptotic cells and photoreceptors compete for alphavbeta3 and alphavbeta5 integrins, and protein kinase C regulates alphavbeta5 binding and cytoskeletal linkage. J. Exp. Med. 190 (6), 861-874 (1999).
- Savill, J., Dransfield, I., Hogg, N., Haslett, C. Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Nature. 343 (6254), 170-173 (1990).
- Ruggiero, L., Connor, M. P., Chen, J., Langen, R., Diurnal Finnemann, S. C. localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tips in wild-type but not Itgb5-/- or Mfge8-/- mouse retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8145-8148 (2012).
- Finnemann, S. C., Bonilha, V. L., Marmorstein, A. D., Rodriguez-Boulan, E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alphavbeta5 integrin for binding but not for internalization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24), 12932-12937 (1997).
- Lin, H., Clegg, D. O. Integrin alphavbeta5 participates in the binding of photoreceptor rod outer segments during phagocytosis by cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39 (9), 1703-1712 (1998).
- Nandrot, E. F., Anand, M., Almeida, D., Atabai, K., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Essential role for MFG-E8 as ligand for alphavbeta5 integrin in diurnal retinal phagocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (29), 12005-12010 (2007).
- Feng, W., Yasumura, D., Matthes, M. T., LaVail, M. M., Vollrath, D. Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 277 (19), 17016-17022 (2002).
- Finnemann, S. C. Focal adhesion kinase signaling promotes phagocytosis of integrin-bound photoreceptors. EMBO J. 22 (16), 4143-4154 (2003).
- Nandrot, E. F., Silva, K. E., Scelfo, C., Finnemann, S. C. Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of αvβ5 integrin. Biol. Cell. 104 (6), 326-341 (2012).
- Ryeom, S. W., Sparrow, J. R., Silverstein, R. L. CD36 participates in the phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelium. J. Cell Sci. 109 (2), 387-395 (1996).
- Finnemann, S. C., Silverstein, R. L. Differential roles of CD36 and alphavbeta5 integrin in photoreceptor phagocytosis by the retinal pigment epithelium. J. Exp. Med. 194 (9), 1289-1298 (2001).
- Sun, M., et al. Light-induced oxidation of photoreceptor outer segment phospholipids generates ligands for CD36-mediated phagocytosis by retinal pigment epithelium: a potential mechanism for modulating outer segment phagocytosis under oxidant stress conditions. J. Biol. Chem. 281 (7), 4222-4230 (2006).
- Law, A. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Mol. Biol. Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
- Strick, D. J., Feng, W., Vollrath, D. Mertk drives myosin II redistribution during retinal pigment epithelial phagocytosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (5), 2427-2435 (2009).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Diemer, T., Khanobdee, K., Hu, J., Bok, D., Williams, D. S. Function of MYO7A in the human RPE and the validity of shaker1 mice as a model for Usher syndrome 1B. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (2), 1130-1135 (2010).
- Kennedy, C. J., Rakoczy, P. E., Constable, I. J. Lipofuscin of the retinal pigment epithelium: a review. Eye (Lond.). 9 (Pt 6), 763-771 (1995).
- Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (6), 3842-3847 (2002).
- Sugano, E., Tomita, H., Ishiguro, S., Isago, H., Tamai, M. Nitric oxide-induced accumulation of lipofuscin-like materials is caused by inhibition of cathepsin. S. Curr. Eye Res. 31 (7-8), 607-616 (2006).
- Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 283 (36), 24770-24780 (2008).
- Singh, R., et al. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 54 (10), 6767-6778 (2013).
- Lei, L., Tzekov, R., McDowell, J. H., Smith, W. C., Tang, S., Kaushal, S. Formation of lipofuscin-like material in the RPE Cell by different components of rod outer segments. Exp. Eye Res. 112, 57-67 (2013).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), 8152 (2009).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells reveal early developmental molecular correlates with a probable Leber congenital amaurosis type I. Cell. Reprogram. 15 (3), 233-246 (2013).
- Molday, R. S., Hicks, D., Peripherin Molday, L. A rim-specific membrane protein of rod outer segment discs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28 (1), 50-61 (1987).
- Chaitin, M. H., Hall, M. O. Defective ingestion of rod outer segments by cultured dystrophic rat pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24 (7), 812-820 (1983).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Carr, A. J., et al. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15, 283-295 (2009).
- Dun, Y., Vargas, J., Brot, N., Finnemann, S. C. Independent roles of methionine sulfoxide reductase A in mitochondrial ATP synthesis and as antioxidant in retinal pigment epithelial cells. Free Radic. Biol. Med. 65, 1340-1351 (2013).
- Xu, Y. T., Wang, Y., Chen, P., Xu, H. F. Age-related maculopathy susceptibility 2 participates in the phagocytosis functions of the retinal pigment epithelium. Int. J. Ophthalmol. 5 (2), 125-132 (2012).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Essential diurnal Rac1 activation during retinal phagocytosis requires αvβ5 integrin but not tyrosine kinases focal adhesion kinase or Mer tyrosine kinase. Mol. Biol. Cell. 23 (6), 1104-1114 (2013).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol. Biol. 935, 285-295 (2013).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Hall, M. O., Abrams, T. Kinetic studies of rod outer segment binding and ingestion by cultured rat RPE cells. Exp. Eye Res. 45 (6), 907-922 (1987).
- Bulloj, A., Duan, W., Finnemann, S. C. PI 3-kinase independent role for AKT in F-actin regulation during outer segment phagocytosis by RPE cells. Exp. Eye Res. 113, 9-18 (2013).
- Chowers, I., et al. Changes in retinal pigment epithelial gene expression induced by rod outer segment uptake. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (7), 2098-2106 (2004).
- Edwards, R. B., Szamier, R. B. Defective phagocytosis of isolated rod outer segments by RCS rat retinal pigment epithelium in culture. Science. 197 (4307), 1001-1003 (1977).
- Philp, N. J., Bernstein, M. H. Phagocytosis by retinal pigment epithelium explants in culture. Exp. Eye Res. 33 (1), 47-53 (1981).
- Burstyn-Cohen, T., Lew, E. D., Través, P. G., Burrola, P. G., Hash, J. C., Lemke, G. Genetic dissection of TAM receptor-ligand interaction in retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Neuron. 76 (6), 1123-1132 (2012).
