Abstract
Analyse av en av de vitale funksjoner i retinalt pigmentepitel (RPE) celler, fagocytose av brukte alderen distale fragmenter av fotoreseptoren ytre segmenter (POS) kan bli utført in vitro. Fotoreseptorlidelser ytre segmenter med stabler av membran plater med fototransduksjons maskiner kontinuerlig fornyes i netthinnen. Tilbrakt POS elimineres daglig av RPE celler. Gnagere, svin / bovine og humane RPE-celler gjenkjenner POS fra forskjellige arter på en lignende måte. Å legge til rette for å utføre store serie eksperimenter med litt variasjon, kan et stort lager av POS isoleres fra svin øyne og lagret frosset i porsjoner. Denne protokollen utnyttet karakteristisk for photopigments som viser en oransje farge når holdt i mørket. Under svakt rødt lys, er retinae samlet i en buffer fra åpnede eyecups kuttet i halvdeler. Retinal cellesuspensjonen homogenisert, filtrert og fylt på en kontinuerlig sukrosegradient. Etter CENtrifugation, POS er plassert i et diskret bånd i den øvre del av gradienten som har en karakteristisk farge oransje. POS blir deretter samlet opp, sentrifugert, resuspendert sekvensielt i vaskebuffere, telles og porsjonert. POS som oppnås på denne måten kan anvendes for fagocytose analyser og analyse av protein-aktivering, lokalisering eller interaksjon ved forskjellige tidspunkter etter POS utfordring. Alternativt kan POS være merket med fluoroforer, e. G., FITC, før alikvoteringsprosessen for påfølgende kvantifisering av fluorescens POS binding eller engulfment. Andre mulige bruksområder inkluderer bruk av modifisert POS eller POS utfordring kombinert med stress forhold for å studere effekten av oksidativt stress eller aldring på RPE celler.
Introduction
I netthinnen, er visjonen utløst av isomerisering av lysfølsomme molekyler som kalles opsins, før de blir forvandlet til et signal som kan overføres mellom nerveceller opp til de visuelle områder i hjernen. Disse molekylene er innebygd i stabler av membran disker ligner pannekaker som utgjør de ytre segment deler av fotoreseptorcellene (PRS). Blir utsatt for konstant eksponering for lys og derfor betydelige nivåer av oksidativt stress, PRs kontinuerlig fornye sine ytre segmenter for å begrense potensiell oksidativ skade. Fotoreseptorlidelser ytre segmenter er i nær kontakt med apikale microvilli av nabo retinal pigment epitel (RPE) celler. RPE cellene utgjør den ytre delen av blod-retinal barriere og sikre mange oppgaver som er avgjørende for fotoreseptorene helse og funksjon 1, slik som å slukke lyset stråler via melanin pigmenter, re-isomeriseringen av fotoreaktivt opsin komponent retinal, som gir næring og growth faktorer, delta i PR metabolitt disposisjon.
I tillegg eliminere RPE celler brukt POS og resirkulere sine komponenter, en daglig yrke som reguleres av døgnrytmen i pattedyr retina 2,3. Clearance av skur POS er helt nødvendig for PR overlevelse. Når det er fullstendig avskaffet, POS samle seg skitt og PRs utarte forårsaker rask synstap 4,5. Hvis den rytmiske profil tapes og erstattes med en konstant aktivitet, PR og RPE defekter akkumuleres med alderen 6. Derfor er det svært viktig å karakterisere molekyl regulering av RPE fagocytose in vitro for å forstå fenotyper knyttet til brukerens dysfunksjon. Interessant er det molekylære maskineri i RPE-celler svært lik den som brukes av makrofager for å fjerne apoptotiske celler, og begge er avhengige av anerkjennelse av eksponert fosfatidylserin på fagocytisk rusk 7-9. Likevel, RPE-celler og makrofager regulere phagocytosis annerledes, som makrofager velge umiddelbar eliminering av apoptotiske celler på møtet tid mens RPE celler rytmisk sluker POS bare en gang om dagen til tross for deres permanent kontakt med ytre segmenter. Dette tyder på konkrete reguleringsmekanismer som ennå ikke er fullt ut forstått.
Mange av de molekyler som er innblandet i RPE fagocytisk maskiner er blitt identifisert eller validert, takket være bruken av isolerte POS og cellekulturanalyser fagocytose. Den alphavbeta5 inte reseptoren ligger på RPE apikale celleoverflaten, i samarbeid med sin ligand MFG-E8, binder seg spesifikt til POS 10-12, som deretter internalisert via MerTK tyrosinkinasereseptor 13-15. Den CD36 scavenger reseptor er blitt vist å delta i POS inntak og påvirke dens hastighet 16,17, og kan tjene som en føler for oksyderte fosfolipider ved POS overflate 18. Intern trenger rekruttering av F-aktin cytoskjelettet-associated proteiner som annexin 2 19, myosin II 20 og myosin VIIA 21,22. Native eller oksidert POS in vitro benyttes også for å forstå aldring fenotyper av RPE-celler in vivo knyttet til akkumulering av dårlig fordøyd oksydert POS 23-28. Generering av RPE celler avledet fra stamceller har igangsatt en ny søknad for isolerte POS som brukes til å bevise funksjonaliteten celler før de blir transplantert til dyr eller pasienter 29,30,27.
Først beskrevet av Molday og kolleger i 1987 31, kombinerer protokollen for isolering av storfe POS en ultrasentrifuge trinn i netthinnens homogenates på kontinuerlige sukrosegradienter med observasjon av den karakteristiske oransje utseende ubleket retinal photopigment (bærer 11- cis retinal). I de siste 10 årene, på grunn vurderes tiltak for å minimere risikoen for kugalskap, har bruk av svin øynene blir increasingly fremtredende. Protokollen er beskrevet her viser hvordan du kan få store mengder POS fra svin eller storfe øyne som kan alikvoteres og lagres over lengre tid. Dette eliminerer behovet for å forberede POS fra gnager øyne, som krever bruk av et stort antall dyr per POS forberedelse og analyse 32,33,21,22. I tillegg blir informasjon om POS merking før lagring ved hjelp av fluorescerende molekyler gitt, for å kvantifisere og visualisere POS i en forenklet og tilsvarende måte som for visse anvendelser sammenlignet med merking POS etter fagocytose analysen 32,10. Derfor er disse store lagrene tillate reproduserbarhet og enkel bruk i mange forskjellige typer av eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette POS isolasjon eksperiment er tidkrevende og kan kreve opptil 12 timer å fullføre hvis POS er merket før lagring. Protokollen er tilpasset fra en artikkel publisert av RS Molday og kolleger i 1987 31 og modifisert av SC Finnemann og kolleger i 1997 10.
Dyrene ble håndtert i henhold til Association for Research in Vision og Ophthalmology (ARVO) Erklæring for bruk av dyr i Ophthalmic og Vision Research. Protokoller ble gjennomgått og godkjent av Charles Darwin etiske komité fra University Pierre og Marie Curie-Paris 06 og Fordham University Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Generelt Set Up
- Skaffe 80 friske gris eller ku-øyne så fersk som snart etter slakting som mulig og holde dem kjølt i mørket. Gi instruksjoner til leverandøren slik at selskapet fortsetter på samme måte. Denne protokollen er optimalisert for 80 øynene. Tilfortsette med flere øyne og få større bestander (f.eks, fra 160 øyne), doble løsningen mengder og utføre to runder av ultrasentrifugering; bassengprøver senere på samlingen trinn (se trinn 2.2.2).
- Satt opp på benken den røde sikkerhetslys lampe, absorberende pads, kluter (Materialer tabell). Forbered 15 cm retter og biohazard poser for avfall samlingen (ubrukt øye deler, glasslegemet ...). Bruk tettsittende labcoat, hansker, ermet beskyttere og beskyttelsesbriller.
- Forholdsregler:
- Pre-slappe alle løsningene deretter holde dem kalde under alle trinn. Hold øynene og graderinger kjølt på is så mye som mulig.
- Holde øynene og avledet vev i mørket så mye som mulig inntil oppsamlingstrinnet etter ultrasentrifugering for å unngå fotobleking av visuelle pigmenter og tap av den oransje-rosa farge av den aktive formen av photopigments.
2. Protokoll Handlinger
- Forberede løsninger og graderinger:
- Tine taurin lager fullstendig ved en 37 ° C vannbad.
- Forberede alle løsninger fra stamløsninger (Tabell 1, stamløsninger) og bland godt sukrose med andre ingredienser ved hjelp av en magnetrører for hver løsning.
- Forbered 15 ml av homogenisering oppløsning til en endelig konsentrasjon på 20% sukrose, 20 mM Tris-acetat pH 7,2, 2 mM MgCl2, 10 mM glukose, 5 mM taurin.
- Klargjør 25% sukrose-løsning til en sluttkonsentrasjon på 25% sakkarose (ved bruk av 70% sukrose lager), 20 mM tris-acetat pH 7,2, 10 mM glukose, 5 mM taurin.
- Klargjør 60% sukrose-løsning til en sluttkonsentrasjon på 60% sakkarose (ved hjelp av sukrose-pulver), 20 mM Tris-acetat pH 7,2, 10 mM glukose, 5 mM taurin.
- Klargjør vaske en løsning til en sluttkonsentrasjon på 20 mM tris-acetat pH 7,2 og 5 mM taurin.
- Klargjør vaske 2-løsningtil en sluttkonsentrasjon på 10% sukrose, 20 mM tris-acetat pH 7,2 og 5 mM taurin.
- Klargjør vaske 3-løsning til en sluttkonsentrasjon på 10% sukrose, 20 mM natriumfosfat pH 7,2 og 5 mM taurin.
- Stabilisere gradient maker på en magnetrører og sette inn en røre bar i kammeret nærmest avkjørselen hvor 60% løsning vil bli satt inn. Bruk en cut-off P200 pipette tips plassert i slutten av slangen for å oppnå riktig støpehastighet.
- Cast lineære gradienter delikat ved å fortynne og omrøring av 60% sukrose løsning med 25% som bruker 12 ml fra hver løsning (dvs. totalt 6 rør for 80 øyne) i pre-kjølt ultrasentrifugerør rør. Rør gradvis-fortynne 60% sukroseløsning godt. Jevn hastighet gradient strømning, helle oppløsningen jevnt og ikke for fort.
MERK: For å få en sammenhengende, lineær gradient, holde pipettespiss åpning rett på overflaten av løsningen for hele gradient formation. - La gradienter sitte på is for rundt en time for stabilisering. Hold gradienter kjølt inntil lastet. Ikke rist rør for å hindre forstyrrelse av graderingen.
- Tissue samling:
- Samle vev under svakt rødt lys. Ta et øye i den ene hånden og dytte foran med kant barberblad mens du holder øye bort (for å unngå sprut, figur 1). Bruk barberblad for å kutte den fremre øyeeplet inn i to halvdeler (hornhinne pluss minst 5 mm inn i sclera). Ta av objektivet og snu eyecup innsiden ut slik at det kan holdes over tuppen av en finger og dermed utsette netthinnen.
- Bruke barberblad i en vinkel, forsiktig skrape netthinnen, løsne lett og vises som en rosa lag, utenfor tapetum overflate og kuttet ved synsnervepapillen (figur 1). Samle alle netthinne i 2 x 50 ml rør som hver inneholder 15 ml av homogenisering løsning på is.
- Retina homogenization:
- Riste suspensjonen kraftig for hånd i 2 min for å forstyrre de forskjellige cellelagene, bryte POS av resten av den PR-celle, fragment POS og homogen retina suspensjon.
- Filter 3x gjennom et dobbelt-lag av rent gas for å fjerne store vevfragmenter og samle gjennomstrømnings i rene 50 ml rør (figur 1). Retinal suspensjon være ganske tykk, for å maksimere utbyttet, trykk forsiktig på gasbind å frigi de resterende fragmenterte vev etter hvert filtrering.
- Fotoreseptor ytre segment fragment (POS) isolasjon:
- Forsiktig lå det urene retina prep, rundt 6-7 ml per rør, over 6 x 30 ml ultrasentrifuge-rør hver inneholdende 24 ml friskt kjølt kontinuerlig 25 - 60% sakkarose-gradient (figur 1). Balansere de motstridende rør som er hensiktsmessig for at rotoren skal brukes. Ultrasentrifuge ved 106 000 xg i 50 min ved 4 ° C. Fjern mesteparten av løsningen ovenfor den oransje-rosa båndet i den øvre tredjedel av gradienten ved aspirasjon (figur 2A). Samle den oransje-rosa band med en cut-off P1000 spiss i et beger. Kast resten etter å nøytralisere ved å bruke blekemiddel (biologisk avfall).
- Fortynn med ~ 4-5 volumer av iskald vaske en løsning. Del den opp i så mange 30 ml rør som trengs. Sentrifuger ved 3000 x g i 10 min ved 4 ° C. Forkaste nøye supernatanten.
- Resuspender pellet i 10 ml Vask 2-løsning og sentrifugering ved 3000 xg i 10 minutter som beskrevet ovenfor. Resuspender pellet i 15 ml Vask 3 og spinne på nytt ved 3000 xg i 10 min. Kombiner suspensjoner fra flere pellets til å redusere antall rør som trengs før sentrifugering i Wash 2 og vaskes tre løsninger.
- POS alikvoteringsprosessen uten merking:
- Resuspender POS i 10 - 20 ml DMEM. Predilute 10 pl i 490 mL DMEM (01:50) og telle forlenget samt virvles POS i encelletellekammer (figur 2B). Beregne avkastning og konsentrasjon i POS partikler per ml.
MERK: Avkastningen varierer, avhengig meste på alder og belastning av griser / kyr og størrelsen på øynene, for eksempel, en god forberedelse varierer 5-8 x 10 9 POS fra 80 grise øyne. - Bestemme den endelige DMEM volum (typisk 10 - 20 ml) og tilsett sukrose for å gi en sluttkonsentrasjon på 2,5% sukrose.
- Forbered porsjoner av ønsket størrelse, for eksempel, 5 x 10 7 POS per rør for en 2 ml resuspensjon volum for en 96-brønns eksperimentet på 40 ul / brønn. Spinne en delmengde i 5 min ved 2300 xg ved RT og evaluere pellet størrelse. Tilberede ulike alikvote størrelser for ulike applikasjons volumer som POS skal IKKE være frosset og tint to ganger.
- Fryse POS alikvoter ved -80 ° C inntil videre bruk.
MERK: Porsjoner er stabile i mange måneder. I våre hender, kan umerket eller merket POS oppbevares i minst ett år.
- Resuspender POS i 10 - 20 ml DMEM. Predilute 10 pl i 490 mL DMEM (01:50) og telle forlenget samt virvles POS i encelletellekammer (figur 2B). Beregne avkastning og konsentrasjon i POS partikler per ml.
- POS merking og alikvoteringsprosessen:
MERK: Vi bruker vanligvis FITC å merke POS for kvantifisering av fagocytose-analyser, men også andre fargestoffer kan anvendes i tillegg, avhengig av behov.- Gjensuspender 10 mg 1 FITC rør til en 2,5 mg / ml konsentrasjon i 0,1 M Na-karbonat-buffer pH 9,5 ved å blande 2,6 ml 0,1 M NaHCO3 pH 8,4 med 1,4 ml 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (Tabell 2, Stamløsninger). Rotere for 1 time ved RT samtidig beskytte mot lys og spinn i 5 min ved maksimal hastighet til pellet ikke-resuspendert FITC faste stoffer.
- Resuspender POS pellet i 10 ml Wash tre løsning (eller DMEM) og tilsett 2 ml FITC løsning for 80 øyne. Lagre left FITC frosset ved -80 ° C. Rotere i minst 1,5 timer ved romtemperatur. Beskytt mot lys ved hjelp av aluminiumsfolie.
- Vask merket POS to ganger ved hjelp Wash tre løsning som beskrevet i avsnitt 2.3.4, deretter en eller to ganger i DMEM til nesten ingen gratis FITC er sett i supernatanten fraction. Resuspender POS i DMEM og fortsett som for umerket POS for telling og alikvoteringsprosessen (punkt 2.4).
- Ved hjelp av POS i eksperimenter:
- Tine POS ved RT, og holde dem i mørket så mye som mulig om de er fluorescently-merket. Spinne i 5 min ved 2300 xg ved RT. Aspirer supernatanten.
- Umiddelbart resuspender i passende volum av analyseoppløsning som diktert av forsøket. Ved ulike tider av POS utfordring, lagre resuspendert POS ved RT i mørket mellom tidspunktene i flere timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kombinasjonen av den lineære sucrose-gradient-ultrasentrifugering og tillater separering av de forskjellige komponenter av retinal suspensjon av tetthet. Tunge større retinal rusk og RPE cellene synker til eller nær bunnen av gradienten (Figur 2A). Lettere POS og lettere individuelle celler eller celleavfall fra netthinnen migrere som separate band å nå den øverste halvdelen av gradienten ved utgangen av sentrifugeperioden. Ved å holde øynene og prøvene i mørket til etter sentrifugeringstrinnet, kan båndet som inneholder POS være umiddelbart anerkjent av dens lys oransje farge. Bredden og intensiteten i dette bandet er avhengig av gradient kvalitet og rør høyde (89 mm høyde er å foretrekke). Vanligvis, når den skal isoleres POS skal vises langstrakt, rett eller bøyd når observert på et objektglass (figur 2B). Avhengig av fokuseringsplanet på mikroskopet, kan de vises enten mørke eller skinnende. Hvis ikke resuspendertTilbakeholdte riktig, vil de bo i klumper. Hvis de er skadet (se avsnittet nedenfor), vil de fremstå som mye mindre biter, litt som en 'støvete' bakgrunn.
Problemer som kan oppstå er for det meste knyttet til tre forhold. Den første mulige problem er at ristetrinnet av de retinale homogenater ikke er kraftig nok, noe som fører til POS rester festet til PRS dermed til redusert utbytte. Det andre problemet er knyttet til dårlig gradient støping eller gradient tap av kvalitet til utilstrekkelig stabilisering tid før lasting eller overdreven tube risting på alle trinn før samlingen. I dette tilfellet, kan båndene ikke være korrekt skilles og POS ikke kan samles opp i det tilsvarende rør. Til slutt oppstår det tredje potensielt problem dersom pH-verdien i en hvilken som helst av oppløsningene er feil: POS membraner kan gå i oppløsning, og bare små POS rusk vises på mikroskopet ved å visualisere dem for utbytte vurdering.
Renset POS kanbli brukt for et antall forskjellige applikasjoner relatert til å studere fagocytisk funksjon av RPE-celler. RPE cellene er vanligvis brukt som cellelinjer eller i primærkultur fra dyremodeller 32,6,12,18-21. Mer nylig har RPE celler avledet fra omprogrammerte stamceller som IPSC eller ESC blitt brukt 29,30,27,34. Isolerte POS tjene til å teste direkte phagocytic evne mutante RPE celler, for eksempel, er POS lett phagocytosed av primærinnsidere RPE celler fra villtype mus, mens celler fra beta5 inte og MFG-E8 knockout mus fagocyttere mindre POS i samme tidsperiode 6,12. Kvantifisering av POS fagocytose kan gjøres enten ved å telle FITC-merket POS manuelt på mikroskopbilder 6 (figur 3a), ved bruk av utstyr i stand til å lese fluorescensintensitet 10,24,15,35 eller et strømningscytometer etter celle trypsinering 36,27. Mer nylig har POS inntak og degradering blitt evaluert on immunoblots autosøk for opsins 37,38,27.
In vivo, skjer POS opptak prosessen sekvensielt som anerkjennelse / bindende forut synkronisert intern 6. De ulike fasene av opptak kan også preget in vitro ved hjelp av egnede eksperimentelle prosedyrer 39. Puls-chase eksperimenter kan utføres ved hjelp av temperaturbryter: POS binding forekommer ved 20 ° C, mens internalise trenger en temperatur på 37 ° C for å fortsette 32,40,7. Denne forskjell eksisterer også i makrofager, som kan gjenkjenne POS i tillegg og i hvilken molekylære maskineri for å eliminere apoptotiske celler er svært lik RPE maskineri 7. Etter FITC-POS fagocytose, kan binding og internalisering bli kvantifisert i separate prøver ved bråkjøling av FITC-fluorescens av overflate-bundet POS under pre-inkubering med trypanblått før fiksering av cellene 10. I trypanblått-behandlede celler, bare lærlingal POS vil bli visualisert, og bundet POS kan kvantifiseres ved å trekke intern POS fra total POS fluorescens teller. Når fagocytose blir evaluert på immunoblots oppnådd ved anvendelse av lysater innsamlet etter POS utfordring, vil en tilsvarende behandling med EDTA før lysis tillate løsgjøring av POS bindes på celleoverflaten for intern versus totale POS fagocytose sammenligning 37,38.
Store fremskritt er gjort i identifisering av de fagocytiske maskiner takket være eksperimenter ansette renset POS. Protein rekruttering kan vurderes ved immunfluorescens samlokalisering analyser 13-15,19-21,37,41 (Figur 3B). Protein rekruttering eller aktivering kan valideres på immunoblots etter immunopresipitering eller ved å se etter fosforylering 7,10,12-15,17,19,20,27,35,37,41 (Figur 3C). Mer åpne endte studier på samlede genuttrykk endringer etter ulike tider av POS utfordring har enLSO blitt utført 42.
Isolert POS kan også brukes til å studere POS eliminering av RPE-celler. Faktisk, ved normal aldring og / eller når POS ikke fordøyes riktig, POS degraderingsprodukter akkumuleres etter hvert som Lipofuscin avleiringer og kan føre til sykdommer som skyldes oksidasjon mekanismer 24,27. Derfor kan forstå effektene av lys og relaterte oksidativ skade krever POS utfordringen med RPE celler 18,26. Til slutt gjentatt mating med normale 27 eller oksydert 25,28 POS kan brukes for å indusere kumulative effekter i RPE-celler i kultur for å forstå patologiske mekanismer som utvikler in vivo over lengre tidsperioder.
Figur 1. Retina isolert fra svine øyne. Tegning som viser de forskjellige trinn i øyet for disseksjonå samle og homogennetthinnen før ultracentrifugation skritt på kontinuerlige sukrosegradienter, og starter øverst til venstre. Et 60 mm bredt blad blir brukt til å kutte øyet sekvensielt på en side og deretter den andre for å kunne være i stand til å strekke det innsiden ut på en fingertupp, og dermed eksponere hinnen. Det neste er at netthinnen samles ved opphugging den fra tapetum med bladet. Sammenslått retinae blir deretter ristet grundig i homogeniseringsbuffer og filtrert 3 ganger gjennom doble lag av gas og delikat helles på toppen av den lineære 25 - 60% sakkarose-gradient.
Figur 2. POS rensing fra svin øyne (A) Fotografi av de forskjellige lag observert på en 25 -. 60% sucrose-gradient etter ultrasentrifugering av homogenater netthinnen. Den oransje bånd tilsvarer POS som skal samles. De hvite høybåndsfrekvenser tilsvarertil ikke-POS relatert materiale, samt større rusk migrere nær eller på bunnen av røret. (B) Bilde av isolert POS som observert på en lys feltet mikroskop på en telling celle for yield vurdering. POS foreligger i langstrakt (a, a ', c, d) og virvlet (a, a', b, b ', d) former. Noen langstrakt POS kan vise en coiled ekstremitet (c). Når du endrer fokusplanet, POS utseende skifter fra skinnende til mørk (sammenligne en og en, b og b '). Panel e illustrerer POS som ikke er resuspendert riktig og ligge i klumper. Panel f viser POS som har blitt skadet og er ikke brukbare, bare små biter kan påvises. Skalere 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figure 3. Analyse av RPE fagocytose ved anvendelse av renset POS. (A) Confocal mikroskopbilde og tilsvarende kvantifisering av antallet phagosomes per celle med tiden viser at FITC-merket POS (grønn) er mindre utsatt for fagocytose av RPE primære celler isolert fra beta5 grin knockout (β5 - / -) sammenlignet med villtype (WT eller β5 + / +) kontrollmus som indikert. Kjerner (rød) ble merket ved hjelp DAPI og celle veikryss (blå) med tight junction markør ZO-en. Skala barer 10 mikrometer. . Gjengitt fra © Nandrot et al, 2004, opprinnelig publisert i The Journal of Experimental Medicine 200 (12): 1539-1545. (B) Confocal mikroskop bilder som viser samlokalisering (gul-magenta, nederst til høyre panel) mellom β5-GFP fusjonsproteiner (grønn, øvre venstre panel), overflate αvβ5 integrinantagonister reseptorer (rød, øverst til høyre panel) og POS (blå, bunnvenstre panel). Skala bar 10 mikrometer. . Gjengitt fra Nandrot et al, 2012, opprinnelig publisert i Biology av Cell 104 (6): 326-341, © Portland Press Limited. (C) immunoblots (WB) og tilsvarende kvantifisering (quantif.) Viser at POS utfordring (POS) øker fosforylering av FAK på Tyr397 rest sammenlignet uten behandling (/) eller utfordret med medium alene (m) i kontrollceller (c) mens celler som uttrykker en inaktivert form av FAK (F) ikke reagerer, som angitt. Gjengitt fra Finnemann, 2003, opprinnelig utgitt i EMBO Journal 22 (16):. 4143-4154 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2 Chamber gradient maker | Gradient maker with 30 ml chambers | ||
| 3 mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| Small size magnetic stir bar | Stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| Red safelight lamp | Inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25 x 89 cm tubes | Beckman | 344058 | Ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30 ml centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | Ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | Swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | Rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | Fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| Counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| Dark ice buckets with lids | |||
| Scales | |||
| Magnetic stirrer and upholding pole | |||
| Refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| Labcoat | Health and safety | ||
| Gloves | |||
| Sleeve protectors | |||
| Goggles | |||
| Absorbent pads | |||
| Biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades | Dissection | 60 mm/2.25 inch wide razor blades | |
| 15 cm plastic dish | |||
| Sterile gauze sheets | |||
| 15 and 50 ml tubes | Common consumables | ||
| Microtubes | |||
| Aluminum foil | |||
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Young, R. W., Bok, D. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process. J. Cell Biol. 42 (2), 392-403 (1969).
- LaVail, M. M. Rod outer segment disk shedding in rat retina: relationship to cyclic lighting. Science. 194 (4269), 1071-1074 (1976).
- Mullen, R. J., LaVail, M. M. Inherited retinal dystrophy: primary defect in pigment epithelium determined with experimental rat chimeras. Science. 192 (4241), 799-801 (1976).
- Nandrot, E., et al. Homozygous deletion in the coding sequence of the c-mer gene in RCS rats unravels general mechanisms of physiological cell adhesion and apoptosis. Neurobiol. Dis. 7 (6 pt B), 586-599 (2000).
- Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. J. Exp. Med. Nandrot, E. F., Kim, Y., Brodie, S. E., Huang, X., Sheppard, D., Finnemann, S. C. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Macrophage and retinal pigment epithelium phagocytosis: apoptotic cells and photoreceptors compete for alphavbeta3 and alphavbeta5 integrins, and protein kinase C regulates alphavbeta5 binding and cytoskeletal linkage. J. Exp. Med. 190 (6), 861-874 (1999).
- Savill, J., Dransfield, I., Hogg, N., Haslett, C. Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Nature. 343 (6254), 170-173 (1990).
- Ruggiero, L., Connor, M. P., Chen, J., Langen, R., Diurnal Finnemann, S. C. localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tips in wild-type but not Itgb5-/- or Mfge8-/- mouse retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8145-8148 (2012).
- Finnemann, S. C., Bonilha, V. L., Marmorstein, A. D., Rodriguez-Boulan, E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alphavbeta5 integrin for binding but not for internalization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24), 12932-12937 (1997).
- Lin, H., Clegg, D. O. Integrin alphavbeta5 participates in the binding of photoreceptor rod outer segments during phagocytosis by cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39 (9), 1703-1712 (1998).
- Nandrot, E. F., Anand, M., Almeida, D., Atabai, K., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Essential role for MFG-E8 as ligand for alphavbeta5 integrin in diurnal retinal phagocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (29), 12005-12010 (2007).
- Feng, W., Yasumura, D., Matthes, M. T., LaVail, M. M., Vollrath, D. Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 277 (19), 17016-17022 (2002).
- Finnemann, S. C. Focal adhesion kinase signaling promotes phagocytosis of integrin-bound photoreceptors. EMBO J. 22 (16), 4143-4154 (2003).
- Nandrot, E. F., Silva, K. E., Scelfo, C., Finnemann, S. C. Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of αvβ5 integrin. Biol. Cell. 104 (6), 326-341 (2012).
- Ryeom, S. W., Sparrow, J. R., Silverstein, R. L. CD36 participates in the phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelium. J. Cell Sci. 109 (2), 387-395 (1996).
- Finnemann, S. C., Silverstein, R. L. Differential roles of CD36 and alphavbeta5 integrin in photoreceptor phagocytosis by the retinal pigment epithelium. J. Exp. Med. 194 (9), 1289-1298 (2001).
- Sun, M., et al. Light-induced oxidation of photoreceptor outer segment phospholipids generates ligands for CD36-mediated phagocytosis by retinal pigment epithelium: a potential mechanism for modulating outer segment phagocytosis under oxidant stress conditions. J. Biol. Chem. 281 (7), 4222-4230 (2006).
- Law, A. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Mol. Biol. Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
- Strick, D. J., Feng, W., Vollrath, D. Mertk drives myosin II redistribution during retinal pigment epithelial phagocytosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (5), 2427-2435 (2009).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Diemer, T., Khanobdee, K., Hu, J., Bok, D., Williams, D. S. Function of MYO7A in the human RPE and the validity of shaker1 mice as a model for Usher syndrome 1B. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (2), 1130-1135 (2010).
- Kennedy, C. J., Rakoczy, P. E., Constable, I. J. Lipofuscin of the retinal pigment epithelium: a review. Eye (Lond.). 9 (Pt 6), 763-771 (1995).
- Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (6), 3842-3847 (2002).
- Sugano, E., Tomita, H., Ishiguro, S., Isago, H., Tamai, M. Nitric oxide-induced accumulation of lipofuscin-like materials is caused by inhibition of cathepsin. S. Curr. Eye Res. 31 (7-8), 607-616 (2006).
- Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 283 (36), 24770-24780 (2008).
- Singh, R., et al. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 54 (10), 6767-6778 (2013).
- Lei, L., Tzekov, R., McDowell, J. H., Smith, W. C., Tang, S., Kaushal, S. Formation of lipofuscin-like material in the RPE Cell by different components of rod outer segments. Exp. Eye Res. 112, 57-67 (2013).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), 8152 (2009).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells reveal early developmental molecular correlates with a probable Leber congenital amaurosis type I. Cell. Reprogram. 15 (3), 233-246 (2013).
- Molday, R. S., Hicks, D., Peripherin Molday, L. A rim-specific membrane protein of rod outer segment discs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28 (1), 50-61 (1987).
- Chaitin, M. H., Hall, M. O. Defective ingestion of rod outer segments by cultured dystrophic rat pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24 (7), 812-820 (1983).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Carr, A. J., et al. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15, 283-295 (2009).
- Dun, Y., Vargas, J., Brot, N., Finnemann, S. C. Independent roles of methionine sulfoxide reductase A in mitochondrial ATP synthesis and as antioxidant in retinal pigment epithelial cells. Free Radic. Biol. Med. 65, 1340-1351 (2013).
- Xu, Y. T., Wang, Y., Chen, P., Xu, H. F. Age-related maculopathy susceptibility 2 participates in the phagocytosis functions of the retinal pigment epithelium. Int. J. Ophthalmol. 5 (2), 125-132 (2012).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Essential diurnal Rac1 activation during retinal phagocytosis requires αvβ5 integrin but not tyrosine kinases focal adhesion kinase or Mer tyrosine kinase. Mol. Biol. Cell. 23 (6), 1104-1114 (2013).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol. Biol. 935, 285-295 (2013).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Hall, M. O., Abrams, T. Kinetic studies of rod outer segment binding and ingestion by cultured rat RPE cells. Exp. Eye Res. 45 (6), 907-922 (1987).
- Bulloj, A., Duan, W., Finnemann, S. C. PI 3-kinase independent role for AKT in F-actin regulation during outer segment phagocytosis by RPE cells. Exp. Eye Res. 113, 9-18 (2013).
- Chowers, I., et al. Changes in retinal pigment epithelial gene expression induced by rod outer segment uptake. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (7), 2098-2106 (2004).
- Edwards, R. B., Szamier, R. B. Defective phagocytosis of isolated rod outer segments by RCS rat retinal pigment epithelium in culture. Science. 197 (4307), 1001-1003 (1977).
- Philp, N. J., Bernstein, M. H. Phagocytosis by retinal pigment epithelium explants in culture. Exp. Eye Res. 33 (1), 47-53 (1981).
- Burstyn-Cohen, T., Lew, E. D., Través, P. G., Burrola, P. G., Hash, J. C., Lemke, G. Genetic dissection of TAM receptor-ligand interaction in retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Neuron. 76 (6), 1123-1132 (2012).
