Spot den korrekte Tissue hver gang i Multi-væv Blocks

Summary

Formålet med Specimen Orientation Tag (spot) er at fungere som en orientering værktøj til at hjælpe med individuelle væv identifikation i flere væv paraffinblokke. Disse protokoller viser, hvordan det er konstrueret let fra almindelige, billige histologi materialer og fungerer som en pålidelig visuel markør i paraffinblokke og sektioner.

Abstract

Multi-væv paraffinblokke giver high throughput analyse med øget effektivitet, eksperimenterende ensartethed og reduceret tid og omkostninger. Tissue microarrays udgør størstedelen af ​​multi-væv paraffinblokke, men i stigende grad er forskere ved hjælp af ikke-klædt blokke med større væv fra flere individer, der kan give mange af fordelene ved væv microarrays uden betydelige investeringer i planlægning og udstyr. En kritisk komponent i enhver multi-væv analyse er orienteringen metode, der anvendes til at identificere de enkelte væv. Selv om der findes metoder til at opretholde en korrekt orientering og identifikation af væv i multi-vævsblokke, de fleste er ikke velegnede til ikke-klædt blokke kan forbruge værdifuld plads i en matrix og / eller er vanskelige at fremstille i standard histologi laboratorium. Den Prøve Orientering Tag (spot) er en enkel, billig orientering værktøj, der er klart synlig i paraffinblokke og alle vævssnit for pålidelig model identifikation i grupperede og ikke-grupperede layouts. SPOT giver fordele i forhold til eksisterende orientering metoder til ikke-klædt blokke, da det ikke kræver nogen direkte ændring af væv og giver mulighed for fleksibilitet i indretning af væv stykker.

Introduction

Evnen til at integrere vævsprøver fra flere individer i en enkelt paraffin blok gør det nemt side-by-side sammenligning mellem behandlinger og enkeltpersoner, fjerner variabilitet mellem dias, og reducerer omkostningerne og arbejdsbyrden for sektionering og farvning prøver. Disse multi-vævsblokke fremstilles typisk som enten væv microarrays (TMA) eller paraffinblokke indeholder væv fra flere individer i en ikke-matrix layout. Vedligeholdelse af prøve identitet er afgørende for succes for enhver multi-væv analyse. Forskere har brugt TMAs siden deres udvikling for at forbedre effektiviteten af analyser, reducere variation mellem dias, bevare værdifulde ressourcer væv og reducere den tid og omkostninger til eksperimenter ^1. Korrekte orientering af TMAs kan tilvejebringes ved anvendelse af en række fremgangsmåder, herunder mellemrum, rækker eller kolonner mellem vævskerner ^2-4, asymmetrisk arrangement af kernegrupper ^{3, 5} (f.eks control vs. behandling), "beacon" kerner ⁶ og udpegede orientering kerner placeret uden for TMA matricen ^3. Selv om disse metoder fungerer godt for TMAs, de fleste forbruger værdifulde TMA core plads og TMAs med huller og mellemrum som identifikatorer kan blive forvirrende, da væv kerner er opbrugt over tid. Derudover disse metoder er ikke egnede til brug i multi-væv blokke uden et array format, fordi de er afhængige af uregelmæssigheder i den stramt bestilt mønster af ensartede microarray kerner som identifikatorer. De fleste ikke-klædt multi-væv blokke skal rumme ikke-ensartede væv og per definition ikke vise den strukturerede vifte gitter, der gør disse afvigelser skiller sig ud som vartegn.

Selvom der er mange fordele ved at bruge en TMA, en af de største ulemper er den lille størrelse af kernerne, som ikke altid er repræsentative for stort set heterogen væv ^1. Ikke-opstillede multi-væv blokke giver mange af than nyder en TMA, men indeholder større vævsprøver eller hele organer fra dyreforsøg. Tissue microarrays bruger enkelte kerner har varierende overensstemmelse med hele vævssnit baseret på proteinet af interesse, og mange kræver flere kerner til øget overensstemmelse ^7-11. På grund af kompleksiteten og heterogene karakter af nogle biomarkør fænotyper, TMAs hjælp selv store antal kerner (> 10) kan stadig være utilstrækkelig og kan kræve andre end microarrays til analyse ⁸ metoder. Derudover TMA konstruktion er tidskrævende, teknisk krævende, og kræver den oprindelige pris og investering i eller adgang til et væv arrayer. Ikke-grupperede multi-væv blokke kan foretages i enhver grundlæggende laboratorium med betydeligt mindre tid og kræfter og er et gyldigt alternativ til undersøgelser, der kræver mere væv end arrays tillade eller som et middel til at reducere omkostningerne og forenkle analysen.

Ikke-klædt multi-væv blokke på samme måde kræve en pålidelig ellerientation markør til at spore prøveidentifikation imidlertid udviklingen af ​​disse markører er blevet begrænset. Meget af den litteratur, der beskriver væv orientering fokuserer på korrekt fysiologisk orientering for indlejring individuelle vævsstykker, såsom tatovering vævet med blæk ^12, præ-embedding væv i agar-gelatine inden forarbejdningen ^13, og mærkning bestemte væv med indskæringer ¹⁴ eller suturer ¹⁵ . Selv om funktionelle, disse metoder er ikke ideelle som markører i multi-vævsblokke på grund af deres begrænsninger. En sutur vil blive sektioneret igennem hurtigt og kan ikke ses i hver sektion. Pre-embedding teknikker, der anvender agar-gelatine kan holde vævet i korrekt orientering under bearbejdning og forankring, men giver ikke en visuel cue til at skelne mellem flere prøver i paraffin blok og dias. Indhak eller farvestof på væv kan komplicere analyse eller okkludere vigtige morfologiske detaljer. Alternativt væv identiteti en ikke-klædt multi-vævsblok kan opretholdes ved indlejring af vævsstykker i et asymmetrisk arrangement, men det kræver 3 eller flere vævsstykker og kan ikke tillader optimal indretning af væv til analyse.

Den Prøve Orientering Tag (spot) er udviklet som en nem og billig metode til klart at identificere væv i multi-væv blokke og byder på mange fordele i forhold til eksisterende orientering metoder. Stedet er et lille, farverig, kerne bestående af Hydroxyethyl agarose behandling gel og væv mærkning farvestof, og infiltreret med paraffin (figur 2C). SPOT kerne er integreret på enden ved siden af en enkelt væv i en multi-væv paraffin blok og fremstår som en farvestrålende prik i blokken og i hvert afsnit (figur 1A - D) med tydelig angivelse af korrekt orientering af blokken og sektioner for nem identifikation væv.

Protocol

1. Konstruktion af stedet

1. Der tilsættes 50 mg bovint serumalbumin (BSA) til 1 ml væv mærkning farvestof i en 15 ml konisk rør eller 2 ml mikrofugerør og vortex i 1 min eller indtil den er helt opløst.
   Bemærk: Til denne protokol, anvender biokemiske Grade BSA. Mens andre kvaliteter og renheder ikke er blevet testet, forventes det, at lønklasse og renhed ikke ville have en betydelig indvirkning på succesen med stedet.
2. Heat 9 ml hydroxyethyl agarose forarbejdning gel i en 15 ml konisk rør i en mikrobølgeovn ved 30% effekt i trin på 10 sek, indtil gelen er fuldstændigt smeltet.
3. Kombiner den smeltede behandling gel og dye-BSA opløsning i en enkelt 15 ml konisk rør og bland grundigt med en pipette. Vortexes opløsning.
4. Placer konisk rør i køleskab i et par timer, eller indtil fast.
5. Brug en lang, tynd, metal spatel eller sonde forsigtigt af farvede gel stikket ud af konisk rør.
6. Brug en skalpel eller barberblad til cut gelen stikket på tværs i 5 mm tykke sektioner. Fjern de afrundede ender og bortskaffes som affald (figur 2A).
7. Placer gel plug sektioner fladt i histologi kassetter og holde i 70% ethanol i 1 time. Ændre 70% ethanolopløsning hver 2-4 time i mindst 3 ændringer over en 24 timers periode.
8. Manuelt behandle gel snit gennem en ethanol-serien (1 time hver: 70% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol (3x ændringer), derefter klar i clearing opløsning 3x i 1 time hver (f.eks, alifatiske carbonhydrider ( xylener stedfortræder)) blev anvendt i denne protokol, xylener er også acceptable), og infiltrere med smeltet paraffin (3x i 1 time hver), enten manuelt eller i et væv processer.
   Bemærk: Før fuld dehydrering i 100% ethanol, kan farvestoffet lække fra gelen prop, som kan påvirke andre væv og de flydende reagenser i en automatiseret vævsprocessor. Som sådan manuel rehydrering anbefales dog automatiseret behandling er EQUallierede effektiv.
9. Integrer flere forarbejdede gel sektioner ved hjælp af standard paraffin indlejring metode (figur 2B). Tillad blokke til at afkøle og hærde og derefter komme til stuetemperatur.
10. Brug en dermal hulning nål ønskede størrelse for at fjerne plet kerner fra de indlejrede gel afsnittene indtil blokken er opbrugt (figur 2C). En enkelt blok kan give op til 20 x 2 mm ² kerner. Opbevar kernerne i et køligt område. Brug dermal punch i denne protokol se fig, et 1,5 mm (figur 1D, og 2D) eller en 2 mm (figur 1B, 1C og 2C).

2. Brug steder at Orient Ikke-array Blocks

1. Opret en væv orientering diagram at angive de ønskede steder og identiteter alle de individuelle væv dele, der skal indlejret sammen, og placeringen af ​​stedet.
   BEMÆRK: Vævet orientering diagram er en illustreret kort, der indeholder physical placeringer af alle væv stykker mærket med identifikatorer og placeringen af ​​stedet. Det kan oprettes elektronisk eller kan være håndtegnede. Diagrammet skal oprettes ved hjælp uanset hvilken metode der passer bedst til teknikeren og forsker ved hjælp af den endelige produkt. Dette kort vil fungere som vejledning for forskeren, så prøver kan let identificeres ved mikroskopisk analyse. Kortet anvendes i denne protokol blev håndtegnet. Det forestiller et væv blok og objektglas med hvert stykke væv og SPOT tegnet og mærket i samme position som den faktiske væv blok og dias.
2. Proces vævsstykkerne normalt, der sikrer, at de forbliver korrekt identificeret hele ekstrapolationsfaktorer og procestrin. Til denne protokol, behandler væv i 1 time hver i: 70% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol (x3 ændringer), alifatiske kulbrinter (xylener erstatte) (x3 ændringer), og smeltet væv infiltration paraffin på 60 ° C (X3 ændringer).
   BEMÆRK: Etll væv skal behandles efter standard histologi laboratorieprocedurer. Dette kan være variabel skyldes individuelle laboratorium procedure, væv størrelse og type, men det vil ikke påvirke evnen til at bruge stedet som en orientering værktøj.
3. Arranger væv stykker på indlejring station i de korrekte tildelte steder ifølge vævet orientering diagrammet. Brug vævet orientering diagram som reference til at vejlede teknikeren om, hvordan man arrangerer stedet og væv stykker i hver blok.
   BEMÆRK: I denne protokol den indlejring tekniker satte håndtegnede orientering map siden af ​​indlejring station og arrangeret vævsstykkerne på indlejring station på nøjagtig samme arrangement som tegnet på diagrammet. Dette sikrer, at alle vævsstykker forbliver korrekt identificeres i slutproduktet. Dette er helt afgørende for en vellykket anvendelse af multi-væv blokke.
4. Sørg for SPOT kernen er højere end alle væv brikker til at blive indlejret i blokken.
5. Integrer vævsstykkerne og derefter stedet på enden (tværgående) i de rigtige steder efter vævet orientering diagram ved hjælp af standard indlejring metodik. Efter behov, holde stedet (r) oprejst med pincet, indtil paraffinen er størknet nok, at stedet (s) ikke vil falde over (1-2 min).
6. Afsnit og plet paraffinsnit med stedet ved hjælp af standard metodik.
   1. Tillad sektionerne til at flyde på et vandbad ved 40 ° C og klæbet til et positivt ladet objektglas (uladede objektglas er ikke blevet testet). Tør dias i en tørreovn ved 60 ° C i mindst 20 min.
   2. Objektglassene anbringes i et automatisk farvningsværktøjet og behandles gennem følgende reagenser: xylener (xylener 1-5 min, xylener 2 og 3-2 min, hver), 100% ethanol (2 min), 95% ethanol (1 min), 80 % ethanol (30 sek), 70% ethanol (30 sek), rindende vand (2 min), hematoxylin (1,5 min), rindende vand (3 min), sur alkohol (1 min), rindende vand (2 min ), bluing reagens (1 min), rindende vand (2 min), 80% ethanol (30 sek), eosin (1 min), rindende vand (10 sek), 80% ethanol (1 min), 100% ethanol (3 ændringer, 2 min hver), xylener (3 ændringer, 30 sek hver).
   3. Dæk dias med dækglas, monteret med montering medium.
      BEMÆRK: I denne protokol, de histotechnician sektioneret de paraffin blokke på en mikrotom i 5 um sektioner. Til denne protokol brugte vi en automatisk farvningsværktøjet dog lige resultater kan opnås via manuel farvning.

3. stedet i TMAs (Manuel TMA Kit)

1. Opret en væv orientering diagram, som beskrevet i 2.1 og tildele den ønskede placering (er) på stedet.
2. Fyld TMA støbeformen med smeltet paraffin på en indlejring station. Da formen er køling, integrere stedet (r) på højkant i tilknytning til TMA mug på de ønskede steder angivet af vævet orientering diagrammet. Efter behov, holde stedet (r) oprejst med pincet, indtil paraffin has størknet nok, at stedet (s) ikke vil falde over (1-2 min).
3. Saml TMA kerner ifølge producentens anvisninger og med hensyn til placeringen af stedet (r) i array margener (figur 2D), og følger standardprocedurer sektionsopdelingen og farvningsprotokoller.
   BEMÆRK: Se venligst trin 2.6 for at se sektionsopdelingen og farvningsmetoder anvendes i denne protokol.

Representative Results

SPOT vises som en rund, farvestrålende prik i paraffin blok (figur 1A og 2D), i alle paraffinsnit, og forbliver på glasset glide gennem H & E eller IHC farvningsprocedure (figur 1B - 1D og 2D). Denne åbenlyse visuelle cue hjælpemidler både den histotechnician og forsker i at identificere de enkelte væv stykke og forenkler kommunikation som histotechnician kan bruge denne visuelle cue til at angive placeringen af ​​vævsstykkerne til forskeren at indsamle data fra slide på mikroskopet. Vævet orientering diagram vedlægges dias leveres til forskeren og forklaret i detaljer, så der vil være nogen forvirring under mikroskopisk analyse. Figur 2A viser resultaterne af sektionering de størknede, farvede agarose gel stik. Figur 2B viser resultatet af indlejring af delbar agarosegel plugs i en paraffin blok. Figur 2C viser resultaterne af anvendelse af en dermal patrice til at producere SPOT kerner.

Figur 1: spot kerner let skabt og let synlig i væv blokke og dias (A) pletter er tydeligt i den integrerede blok.. (B) spots giver mulighed for nem orientering og væv identifikation for multi-væv blokke med lignende optræder væv fra forskellige individer / behandlingsgrupper. (C) pletter tillader hver kerne af en Tissue Microarray skal anvendes til værdifulde vævsprøver. (D) Mikroskop billede af Spot støder op til en TMA kerne. Pile angiver stedet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Udarbejdelse af Spot kerner (A) Solidificeret hydroxyethyl agarose propper frigives fra Eppendorf-rør og skæres på tværs i 5 mm skiver. (B) Flere skiver er indlejret i en enkelt paraffin blok og (C) en dermal patrice anvendes til at fjerne pletter kerner. (D) pletter er indlejret i tilknytning til en Tissue Microarray. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Vellykket forberedelse og udnyttelse af pletterne kræver omhyggelig overholdelse af nogle tekniske trin. Smeltning af hydroxyethyl agarose bør ske langsomt og ved lav varme. Melting hurtigt ved høj varme kan resultere i en vis nedbrydning af agarose i mindre end optimale resultater. Når skære dye-laden stik i stykker for behandling, sikre, at tykkelsen af ​​hvert stykke er større end 4,5 mm, og ikke overstiger 7 mm. De afrundede ender fjernes som affald, da de ikke er ensartet 5 mm i tykkelse. Pieces mindre end 5 mm vil resultere i skabelsen af ​​kortere pletter, der risikerer at blive udmattet af sektionering før konsumption af tilstødende væv materiale. At sikre plet er til stede gennem hele den blok, brikkerne skal være mindst 4,5-5 mm. For at sikre korrekt infiltration af voks imidlertid stykkerne bør ikke overstige 7 mm. Når dehydrering farvestoffet stykker for voks infiltration, vil farvestoffet udvaskes lidt ud af stykkerne i lower koncentrationer af ethanol. Udvaskningen påvirker ikke det endelige produkt, vil pletterne stadig være intenst farvet og klart synlige. Udvaskningen kan påvirke andre væv, selv om, så vævssnit ikke bør behandles i samme bade som farvestof stykker indtil stykkerne har nået 100% ethanol.

Ved placering pletterne ind i opstillede blokke, sikre, at alle andre væv placering er færdig før tilsætning stedet. Da stedet er infiltreret med paraffin, kan det smeltede voks modtagerens blok begynder at smelte SPOT kerne, hvis det får lov til at sidde for længe. Arranger alle væv stykker først, tilsæt spot kerne og straks overføre blokken til en kold plade til at forhindre enhver smeltning af stedet.

SPOT kan ændres til at passe ind i de fleste histologi lab arbejdsgange. Farven af ​​farvestoffet kan ændres for optimal kontrast i hvert program. Rød eller sort farvestof producerer klar høj kontrast på IHC farvede objektglas, while den røde plet er ikke så iøjnefaldende i en H & E-farvede objektglas af opstillede nyre sektioner. For H & E dias, grønne eller gule pletter tendens til at give større kontrast. Yderligere, under under processer såsom varme induceret antigengenfinding for immunhistokemi høj varme, hydroxyethyl agarose smelter væk. BSA tilsættes farvestoffet under SPOT forberedelse til at opretholde en farvestrålende plet på diaset, selv efter høj varme hentning metoder. Hvis objektglassene ikke vil blive udsat for høj varme, kan BSA udelades for hurtigere spot produktion.

De mest kritiske aspekter af brugen af ​​Spot er i oprettelse og vedligeholdelse af en klar og præcis orientering kort og den trofaste overholdelse af kortet, når du placerer stedet. Når det bruges korrekt, SPOT reducerer forvirring over væv arrangement og forenkler kommunikationen mellem teknikere og forskere, som indlejring tekniker kan simpelthen angive placeringen af ​​stedet og relationen af ​​tissues til det på et kort. SPOT er klart synlig i alle trin i præparatglaspræpareringsprotokol giver mulighed for meget konsekvent sektion montering på dias til lettere nedstrøms analyse. I modsætning til fysiologiske markører, SPOT er klart synlige i hvert afsnit og ikke ændrer vævet på nogen måde, forhindrer indførelsen af ​​artefakter eller obstruktion af morfologi. I modsætning til den metode indlejre væv asymmetrisk, SPOT giver teknikere og forskere fleksibilitet i indretning af væv til at optimere visuel analyse under mikroskop. I TMAs, kan SPOT placeres uden for de vigtigste matrix, hvilket eliminerer behovet for mellemrum, asymmetriske samlinger eller beacon kerner, således at hele systemet skal bestå af værdifulde vævssnit. SPOT kan også anvendes til at angive anatomisk retning (f.eks distale eller proximale) af vævsprøver. SPOT er en enkel og billig løsning til nem og ensartet orientering af vævsprøver under opførelsen og etNALYSE af multi-væv blokke og TMAs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Histogel Specimen Processing Gel	Thermo Scientific	HG-4000-012	http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html
Tissue Marking Dye	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TMD-5	Any tissue marking dye would most likely be sufficient.
Arraymold Kit A 2 mm (60 core)	Arraymold	20015A	Any manual tissue arrayer would work similarly.