Summary
Het doel van het Specimen Orientation Tag (spot) is gefunctioneerd als leidraad ter te helpen bij individuele identificatie weefsel in meerdere weefsels paraffineblokken. Deze protocollen laten zien hoe dit is opgebouwd uit zachte, low-cost histologie materiaal en dient als een betrouwbare visuele marker in paraffineblokken en secties.
Abstract
Multi-tissue paraffineblokken een hoge doorvoer analyse van doelmatigheid experimentele uniformiteit en verminderde tijd en kosten. Weefsel microarrays vormen de meerderheid van de multi-weefsel paraffine blokken, maar in toenemende mate, zijn de onderzoekers met behulp van niet-array blokken met grotere weefsels uit meerdere personen, die veel van de voordelen van het weefsel microarrays kan verschaffen zonder aanzienlijke investeringen in de planning en uitrusting. Een essentieel onderdeel van een multi-weefsel analyse is de oriëntatie methode voor elke afzonderlijke weefsel identificeren. Hoewel methoden bestaan om de juiste oriëntatie en het identificeren van weefsels in multi-weefselblokken handhaven meeste zijn niet goed geschikt voor niet-array blokken, kan waardevolle ruimte consumeren in een matrix en / of moeilijk te produceren in de standaard histologische laboratoria. Het Specimen Orientation Tag (spot) is een eenvoudige, goedkope oriëntatie instrument dat is duidelijk zichtbaar in paraffine blokken en alle weefselcoupes for betrouwbaar specimen identificatie in arrayed en non-array layouts. De spot verschaft voordelen boven bestaande oriëntatiemethoden voor niet array blokken als er geen directe wijziging van het weefsel vereisen en maakt flexibiliteit in de regeling van stukken weefsel.
Introduction
De mogelijkheid om weefselmonsters van verschillende individuen te bedden in een paraffineblok het eenvoudig side-by-side vergelijking tussen behandelingen en individuen, elimineert variabiliteit tussen dia en vermindert de kosten en de werkbelasting van snijden en vlekken specimens. Deze multi-weefselblokken worden typisch bereid als hetzij tissue microarray (TMA) of paraffineblokken die weefsel van meerdere personen in een niet array layout. Onderhoud monster identiteit is cruciaal voor het succes van een multi-weefselanalyse. De onderzoekers zijn met behulp van TMA's, omdat hun ontwikkeling om de efficiëntie van de analyse te verbeteren, variatie te verminderen tussen dia's, sparen waardevolle middelen weefsel, en het verminderen van de tijd en de kosten van de experimenten 1. Correcte oriëntatie van TMA kan worden uitgevoerd met verschillende methoden, zoals spaties, rijen of kolommen tussen weefselkernen 2-4, asymmetrische opstelling van kerngroepen 3, 5 (bijvoorbeeld control versus behandeling), "baken" kernen 6 en aangewezen oriëntatie kernen buiten de TMA matrix 3 gevestigd. Hoewel deze methoden goed werken voor TMA's, de meeste verbruikt waardevolle TMA kern ruimte en TMA's met lacunes en ruimten als identifiers verwarrend kan worden als weefsel kernen zijn uitgeput na verloop van tijd. Bovendien zijn deze werkwijzen niet geschikt voor gebruik in multi-weefselblokken zonder matrix format omdat ze vertrouwen op afwijkingen in de strak gelast patroon van uniforme microarray kernen als id. De meeste niet-array multi-weefsel blokken moeten geschikt niet-uniforme weefsels en, per definitie, niet de gestructureerde matrix raster dat maakt deze afwijkingen opvallen als oriëntatiepunten niet weergegeven.
Hoewel er vele voordelen aan het gebruik van een TMA, een van de grootste nadelen is de geringe omvang van de kernen die niet altijd representatief mate heterogeen weefsel 1. Non-array multi-weefsel blokken bieden veel van tHij profiteert van een TMA, maar bevatten grotere weefselmonsters, of hele organen uit dierproeven. Tissue microarrays gebruikt enkele kernen variëren overeenstemming met hele weefselsecties basis van het eiwit van interesse en vele vereisen meerdere kernen voor extra concordantie 7-11. Vanwege de complexiteit en heterogeniteit van enkele biomarker fenotypes, TMA gebruikt zelfs grote aantallen geleiders (> 10) nog onvoldoende zijn en kunnen andere dan microarrays for analysis 8 vereisen. Bovendien, TMA constructie is tijdrovend, technisch veeleisende en vereist de initiële kosten en investeringen in of toegang tot een tissue Arrayer. Non-array meerdere weefselblokken kan geschieden in basisch laboratorium met aanzienlijk minder tijd en moeite en is een alternatief voor studies die meer weefsel vereisen dan arrays toestaan of als middel om kosten te besparen en te vereenvoudigen analyse.
Non-array multi-weefsel blokken op dezelfde vereisen een betrouwbaar ofientation marker voor monsteridentificatie sporen echter de ontwikkeling van deze merkers is beperkt. In de literatuur beschreven weefseloriëntatiedetectoren gericht op juiste fysiologische richting voor het inbedden afzonderlijke stukken weefsel, zoals het weefsel tatoeage inkt 12, pre-inbedding weefsels in agar-gelatine voorafgaand aan de verwerking 13 en markering bepaalde weefsels van inkepingen 14 of 15 hechtingen . Hoewel functioneel zijn deze werkwijzen niet geschikt als markers in multi-weefselblokken vanwege hun beperkingen. Een hechting zal snel worden gesegmenteerd door en mogelijk niet zichtbaar in elk deel zijn. Pre-inbedding technieken met behulp agar-gelatine kan het weefsel in de juiste oriëntatie tijdens de verwerking inbedden houden, maar biedt geen visuele aanwijzing om onderscheid te maken tussen meerdere monsters in paraffine blokken en glijbanen. Inkepingen of kleurstof op het weefsel kan analyse bemoeilijken of af te sluiten belangrijke morfologische details. Als alternatief weefsel identiteitin een niet-array meerdere weefselblokje kan worden gehandhaafd door middel van het inbedden van weefselstukken in een asymmetrische rangschikking, maar dit vereist 3 of meer weefselstukken en wellicht niet toelaat optimale plaatsing van weefsels voor analyse.
Het Specimen Orientation Tag (spot) is ontwikkeld als een gemakkelijke en goedkope methode om weefsels in multi-weefsel blokken duidelijk te identificeren en biedt vele voordelen ten opzichte van bestaande oriëntatie methoden. De plek is een kleine, kleurrijke, kern bestaat uit Hydroxyethyl agarose verwerking gel en weefsel markering kleurstof, en geïnfiltreerd met paraffine (figuur 2C). De plek kern is ingesloten op het einde naast een enkele weefsel in een multi-tissue paraffineblok en verschijnt als een helder gekleurde stip in het blok en in elke sectie (Figuur 1A - D), duidelijke vermelding van de juiste oriëntatie van het blok en secties voor eenvoudige weefsel identificatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. De bouw van The Spot
- Voeg 50 mg van runderserumalbumine (BSA) tot 1 ml weefsel markeerinrichting kleurstof in een 15 ml conische buis of 2 ml microcentrifugebuis en vortex gedurende 1 minuut of totdat het volledig opgelost.
Opmerking: Voor dit protocol, gebruiken biochemische Grade BSA. Terwijl andere kwaliteiten en zuiverheid zijn niet getest, wordt verwacht dat de kwaliteit en zuiverheid van een significante invloed op het succes van de locatie, niet zou hebben. - Verwarm 9 ml hydroxyethyl agarose gel verwerking in een 15 ml conische buis in een magnetron bij 30% vermogen gedurende 10 seconden stappen totdat de gel volledig gesmolten.
- Combineer de gesmolten verwerking gel en dye-BSA-oplossing in een enkele 15 ml conische buis en meng met een pipet. Vortex de oplossing.
- Plaats de conische buis in een koelkast gedurende enkele uren of tot vaste stof.
- Gebruik een lange, dunne, metalen spatel of een sonde naar de gekleurde gel stekker voorzichtig los te maken van de conische buis.
- Gebruik een scalpel of scheermesje om cut de gel stekker dwars in 5 mm dikke secties. Verwijder de afgeronde uiteinden en afvoeren als afval (Figuur 2A).
- Plaats de gel plug secties flat in histologie cassettes en houdt in 70% ethanol gedurende 1 uur. Wijzig de 70% ethanoloplossing elke 2-4 uur gedurende ten minste 3 verandert gedurende een 24 uurs periode.
- Handmatig verwerken gel doorsneden door een ethanol reeks (1 hr st: 70% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol (3x verandert), dan duidelijk clearingoplossing 3x gedurende 1 uur elk (bijvoorbeeld alifatische koolwaterstoffen ( xylenen plaatsvervanger)) werden gebruikt in dit protocol, xylenen zijn ook aanvaardbaar) en infiltreren met gesmolten paraffine (3x gedurende 1 uur elk), handmatig of in een weefsel verwerker.
Opmerking: Alvorens volledige dehydratie in 100% ethanol, kan de kleurstof lekken uit de gel plug die invloed kunnen andere weefsels en vloeibare reagentia in een geautomatiseerd weefselprocessor. Als zodanig handmatige rehydratie sterk wordt echter aangeraden geautomatiseerde verwerking equbondgenoot effectief. - Insluiten meerdere verwerkte gel secties met behulp van standaard paraffine inbedding methodiek (Figuur 2B). Laat blokken afkoelen en uitharden en vervolgens op kamertemperatuur komen.
- Gebruik een dermal punch naald van de gewenste grootte te spotten kernen van de ingesloten gel secties te verwijderen totdat het blok is uitgeput (figuur 2C). Een enkel blok kan voorzien in tot 20 x 2 mm 2 cores. Bewaar de kernen in een koele omgeving. Gebruik dermal punch in dit protocol zie figuren, een 1,5 mm (figuren 1D en 2D) of een 2 mm (figuren 1B, 1C en 2C).
2. Met behulp van plekken om Orient Non-gekleed Blocks
- Een weefseloriëntatiedetectoren schema om de gewenste locaties en identiteiten van alle afzonderlijke stukken weefsel samen worden ingebed, en de locatie van de lokaties aan te geven.
OPMERKING: Het weefsel oriëntatie diagram is een geïllustreerde kaart die de p omvathysical locaties van alle weefselstukken gelabeld met identifiers en de locatie van de plek. Het kan elektronisch worden gemaakt of kan met de hand getekend zijn. Het diagram moet worden gecreëerd met behulp van welke methode het beste past bij de technicus en onderzoeker die het eindproduct. Deze kaart zal als de gids voor de onderzoeker te dienen, zodat de monsters gemakkelijk geïdentificeerd kunnen worden tijdens de microscopische analyse. De kaart gebruikt in dit protocol werd met de hand getekend. Het schildert een tissue blok en glas microscoop dia met elk stukje weefsel en The Spot getrokken en geëtiketteerd in dezelfde positie als de werkelijke weefsel blok en glijbaan. - Verwerk de stukjes weefsel normaal, ervoor te zorgen dat ze goed blijven geïdentificeerd gedurende de brutowinst en verwerking stappen. Voor dit protocol verwerkt de weefsels gedurende 1 uur elk in: 70% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol (x3 verandert), alifatische koolwaterstoffen (xylenen plaatsvervanger) (x3 verandert) en gesmolten weefselinfiltratie paraffine bij 60 ° C (x3 wijzigingen).
LET OP: All weefsels moeten worden verwerkt volgende standaard histologie laboratorium procedures. Dit kan variabele te wijten zijn aan de individuele laboratorium procedure, tissue grootte en type, maar dit zal niet van invloed op de mogelijkheid om ter plaatse te gebruiken als oriëntatie tool. - Regelen weefsel stukken op de inbedding station in de juiste locaties toegewezen volgens weefseloriëntatiedetectoren diagram. Gebruik het weefsel oriëntatie diagram als een verwijzing naar de technicus over hoe naar de plek en weefsel stukken in elk blok regelen begeleiden.
Opmerking: In dit protocol zet de inbedding technicus de hand getekende oriëntatie map naast de inbedding station en regelde de stukken weefsel op de inbedding station in precies dezelfde opstelling zoals getekend in het schema. Alleen in dat geval blijven weefselstukken correct geïdentificeerd in het eindproduct. Dit is van cruciaal belang voor het succesvol gebruik van multi-weefselblokken. - Zorg ervoor dat de SPOT-kern is groter dan alle stukken weefsel worden ingebed in het blok.
- Insluiten het weefsel stukken en vervolgens de plaats op einde (dwars) op de juiste locaties volgens het weefsel oriëntatie diagram met behulp van standaard inbedding methodologie. Als dat nodig is, houdt u de Spot (s) rechtop met een tang totdat de paraffine genoeg dat de plek (s) niet zullen omvallen (1-2 min) is gestold.
- Sectie en vlek paraffinecoupes met ter plaatse met behulp van standaard methodologie.
- Laat de secties te drijven op een waterbad bij 40 ° C en gehecht aan een positief geladen glasplaatje (geladen objectglaasjes niet getest). Droog de objectglaasjes in een droogoven bij 60 ° C gedurende ten minste 20 min.
- Plaats de objectglaasjes in een automatische stainer en verwerkt via de volgende reagentia: xyleen (xylenen 1-5 min, xylenen 2 en 3-2 min elk), 100% ethanol (2 min), 95% ethanol (1 min), 80 % ethanol (30 sec), 70% ethanol (30 sec), stromend water (2 min), hematoxyline (1,5 min), stromend water (3 min), zuur alcohol (1 min), stromend water (2 min ), bluing reagens (1 min), stromend water (2 min), 80% ethanol (30 sec), eosine (1 min), stromend water (10 sec), 80% ethanol (1 min), 100% ethanol (3 verandert, 2 min elk), xyleen (3 veranderingen, 30 seconden elk).
- Bedek de dia's met dekglaasjes, gemonteerd met montage medium.
NB: In dit protocol, de histotechnician doorsnede de paraffine blokken op een microtoom in 5 micrometer secties. Hiervoor protocol gebruikten we een automatische stainer echter gelijke resultaten kunnen worden verkregen via handmatige kleuring.
3. plek in TMA's (Manual TMA Kit)
- Maak een tissue oriëntatie schema, zoals beschreven in 2.1 en wijs de gewenste locatie (s) van The Spot.
- Vul het TMA mal met gesmolten paraffine op een inbedding station. Omdat de mal is koeling, insluiten ter plaatse (s) op het einde in de marge van de TMA mal op de gewenste locaties aangegeven door het weefsel oriëntatie diagram. Als dat nodig is, houdt u de Spot (s) rechtop met een tang totdat de paraffine has gestold genoeg dat de plek (s) niet zullen omvallen (1-2 min).
- Monteer de TMA kernen volgens de aanwijzingen van de fabrikant en met betrekking tot de locatie van de spot (en) in de matrix marges (figuur 2D) en de standaardprocedures snijden en kleuringsprotocollen.
OPMERKING: Zie stap 2.6 op het snijden en vlekken methoden die worden gebruikt in dit protocol te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De plek verschijnt als een ronde, helder gekleurde stip in het paraffine blok (figuur 1A en 2D), in alle paraffine secties, en blijft op het glaasje door de H & E en IHC kleuring procedure (figuren 1B - 1D en 2D). Deze duidelijke visuele hint hulpmiddelen zowel histotechnician en onderzoeker om elke afzonderlijke stuk weefsel en vergemakkelijkt de communicatie histotechnician kan deze visueel waarschuwingssignaal de opstelling van de stukken weefsel aan de onderzoeker verzamelen van gegevens van de glijbaan in de microscoop te geven. Het weefsel moet oriëntatieschema worden bij de glijbanen die de onderzoeker en becommentarieerd zodat geen verwarring bij microscopische analyse wordt. Figuur 2A toont de resultaten van de gestolde snijden, gekleurde agarose gel pluggen. Figuur 2B toont het resultaat van inbedding de doorsnede agarosegel plugs in een paraffineblok. Figuur 2C toont de resultaten van het gebruik van een huid stoot plaatse kernen te produceren.
Figuur 1: SpOt cores gemakkelijk te maken en gemakkelijk zichtbaar in weefselblokken slides (A) vlekken zijn zichtbaar in het ingesloten blok.. (B) plekken zorgen voor een gemakkelijke oriëntatie en weefsel identificatie voor multi-weefsel blokken met soortgelijke verschijnen weefsels van verschillende individuen / behandelingsgroepen. (C) plekken laten elke kern van een Tissue Microarray te worden gebruikt voor waardevolle weefselmonsters. (D) Microscope Gezien SpOt naast een TMA kern. Pijlen geven ter plaatse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 2:. Bereiding van SpOt kernen (A) Verhard hydroxyethyl agarosestukjes vrijkomen uit Eppendorf buizen en dwarsrichting gesneden tot 5 mm segmenten. (B) meerdere segmenten ingebed in een paraffineblok en (C) een dermale pons gebruikt om vlekken kernen te verwijderen. (D) Spots zijn ingebed in de marge van een Tissue Microarray. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Succesvolle voorbereiding en het gebruik van de vlekken vereist een zorgvuldige naleving van enkele technische stappen. Het smelten van de hydroxyethyl agarose moet langzaam en op een laag vuur worden gedaan. Snel smelten bij hoge temperatuur kan leiden tot enige afbraak van de agarose minder dan optimale resultaten. Bij het snijden van de kleurstof beladen pluggen in stukken verwerkt, opdat de dikte van elk stuk groter is dan 4,5 mm en niet meer dan 7 mm. De afgeronde einden verwijderd als afval zij niet uniform 5 mm dik. Stukken minder dan 5 mm zal resulteren in de creatie van kortere plekken die dreigen te worden uitgeput door het snijden voorafgaand aan de uitputting van aangrenzende weefsel materiaal. Om ervoor te zorgen plaatse aanwezig via het geheel van het blok is, moeten de stukken tenminste 4,5-5 mm. Voor een goede infiltratie van was er echter voor zorgen de stukken niet meer dan 7 mm. Wanneer het drogen de kleurstof stukken voor wax infiltratie, zal de kleurstof iets uitlogen van de stukken in de Lower concentraties ethanol. De uitloging heeft het eindproduct geen invloed, zal de vlekken nog steeds intens geverfd en duidelijk zichtbaar. De uitloging van invloed kunnen andere weefsels, dus weefselcoupes niet worden verwerkt op dezelfde baden de kleurstof stukken totdat de stukjes 100% ethanol bereikt.
Bij het plaatsen van de vlekken in de gekleed blokken, ervoor zorgen dat alle andere weefsels plaatsing is voltooid voorafgaand aan het toevoegen van de plek. Omdat de Spot is geïnfiltreerd met paraffine, kan de gesmolten was van de ontvanger blok beginnen naar de plek kern smelt als het is toegestaan om te zitten voor te lang. Schik alle weefsel stukken eerste, voeg de SPOT-kern en direct overdragen het blok aan een koude plaat aan een smelten van ter plaatse te voorkomen.
De plek kan worden aangepast om te passen in de meeste histologie lab workflows. De kleur van de kleurstof kan worden veranderd voor een optimaal contrast in elke toepassing. Rode of zwarte kleurstof produceert duidelijk hoog contrast op IHC gekleurd glijbanen, while de rode vlek is niet zo opvallend in een H & E gekleurd slide van gekleed niersecties. Voor H & E dia's, groene of gele vlekken hebben de neiging om een hoger contrast geven. Verder onder hoge warmte tijdens processen zoals warmte-geïnduceerde antigen retrieval voor immunohistochemie, de hydroxyethyl agarose wegsmelt. BSA is aan de kleurstof toegevoegd tijdens SpOt voorbereiding op een felgekleurde plek op de dia zelfs na hoog vuur retrieval methoden te behouden. Als de dia niet wordt blootgesteld aan hoge temperaturen, kan de BSA worden weggelaten SpOt snellere productie.
De meest kritische aspecten van het gebruik van spot zijn in het creëren en onderhouden van een duidelijke en beknopte oriëntatie kaart en de gelovigen naleving van de kaart bij het plaatsen van de plek. Mits goed gebruikt, ter plaatse vermindert verwarring over weefsel arrangement en vereenvoudigt de communicatie tussen technici en onderzoekers, zoals de inbedding technicus kan eenvoudig aangeven van de locatie van de plek en de relatie van de tissues om het op een kaart. Spot is duidelijk zichtbaar in alle fasen van dia voorbereiding waardoor zeer consistente gedeelte montage op objectglaasjes gemakkelijker downstream analyse. In tegenstelling tot fysiologische markers, spot duidelijk zichtbaar in elk deel en het weefsel niet op enigerlei wijze, waardoor de introductie van artefacten of verstopping van de morfologie. In tegenstelling tot de werkwijze van het inbedden weefsels asymmetrisch, ter plaatse maakt technici en wetenschappers flexibiliteit in de regeling van weefsel te optimaliseren visuele analyse onder de microscoop. In TMA kan ter plaatse buiten het array geplaatst, waardoor de noodzaak voor spaties, asymmetrische samenstellingen of beacon kernen, waardoor de hele array te bestaan waardevolle weefselsecties. De plek kan ook worden gebruikt om anatomische richting (bijv distaal of proximaal) weefselmonsters te geven. De spot is een eenvoudige en goedkope oplossing voor eenvoudige en consistente oriëntatie van weefselmonsters tijdens constructie enbestudeert de analyse van multi-weefsel blokken en TMA's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dr Brent Harris bedanken voor het verstrekken van kritische herziening van het manuscript. Deze studies werden uitgevoerd aan de Lombardi Comprehensive Cancer Center Histopathologie & Tissue gedeelde bron die wordt mede ondersteund door NIH / NCI subsidie P30-CA051008. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Cancer Institute en de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histogel Specimen Processing Gel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html |
| Tissue Marking Dye | Triangle Biomedical Sciences, Inc. | TMD-5 | Any tissue marking dye would most likely be sufficient. |
| Arraymold Kit A 2 mm (60 core) | Arraymold | 20015A | Any manual tissue arrayer would work similarly. |
References
- Jawhar, N. Tissue microarray: a rapidly evolving diagnostic and research tool. Ann. Saudi. Med. 29 (2), 123-127 (2009).
- Dhir, R.
- Parsons, M., Grabsch, H. How to make tissue microarrays. Diagn. Histopath. 15 (3), 142-150 (2009).
- Saxena, R., Bade, S. Ch. 7 Tissue Microarray – Construction and Quality Assurance. Immunohistochemical Staining Methods 6th ed. , Available from: http://www.dako.com/08002_ihc_staining_methods_5ed.pdf (2013).
- Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O., Sauter, G. Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research. Int. J. Cancer. 94, 1-5 (2001).
- Rangel, C. The tissue microarray: helpful hints. J.Histotech. 25 (2), 93-100 (2002).
- Hammer, A., Williams, B., Dietz, H., Hamilton-Dutoit, S. High-throughput immunophenotyping of 43 ferret lymphomas using tissue microarray technology. Vet. Path. 44, 196-203 (2007).
- Eckel-Passow, J., Lohse, C., Sheinin, Y., Crispen, P., Krco, C., Kwon, E. Tissue microarrays: one size does not fit all. Diagn Pathol. 5, 48-57 (2010).
- Lin, Y., Hatem, J., Wang, J., Quinn, A., Hicks, D., Tang, P. Tissue microarray-based immunohistochemical study can significantly underestimate the expression of HER2 and progesterone receptor in ductal carcinoma in situ of the breast. Biotech. Histochem. 86 (5), 345-350 (2011).
- Wampfler, J., et al. Determining the optimal numbers of cores based on tissue microarray antibody assessment in non-small cell lung cancer. J Cancer Sci. Ther. 3, 120-124 (2011).
- Quagliata, L., Schlageter, M., Quintavalle, C., Tornillo, L., Terracciano, L. M. Identification of new players in hepatocarcinogenesis: Limits and opportunities of using tissue microarray (TMA). Microarray. 3, 91-102 (2014).
- Miettinen, M. A simple method for generating multitissue blocks without special equipment. Immunohistochem. Mol. Morphol. 20 (4), 410-412 (2012).
- Jones, M., Calabresdi, P. Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing. BioTechniques. 42, 569-570 (2007).
- Carson, F., Hladik, C. Histotechnology: A Self-Instructional Text. , 3rd ed, American Society for Clinical Pathology Press. Chicago, IL. (2009).
- Suvarna, S., Layton, C., Bancroft, J. Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed. , 7th ed, Churchill Livingstone Elsevier Ltd. London, UK. (2013).
