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Developmental Biology

एसएच SY5Y मानव neuroblastoma सेल लाइन के भेदभाव

Published: February 17, 2016 doi: 10.3791/53193
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Huck Institutes of the Life Sciences, The Pennsylvania State University

Introduction

इन विट्रो मॉडल प्रणाली में उपयोग करने की क्षमता बहुत तंत्रिका जीव विज्ञान और न्यूरो के क्षेत्र में इजाफा किया है। संस्कृति में कोशिकाओं में प्रोटीन की कार्यक्षमता और आणविक तंत्र अंतर्निहित विशिष्ट घटना को चिह्नित करने, बीमारी और संक्रमण की विकृति को समझने के लिए, और प्रारंभिक औषधि परीक्षण आकलन करने के लिए एक कुशल मंच प्रदान करते हैं। तंत्रिका जीव विज्ञान में, सेल संस्कृति मॉडल के प्रमुख प्रकार प्राथमिक neuronal ऐसे चूहे B35 कोशिकाओं 5, न्यूरो-2A माउस कोशिकाओं 6, और चूहे PC12 कोशिकाओं 7 के रूप में चूहों और चूहों, और neuroblastoma सेल लाइनों से निकाली गई संस्कृतियों शामिल हैं। इस तरह के सेल लाइनों के उपयोग के क्षेत्र में काफी उन्नत है हालांकि, वहाँ कई confounding गैर मानव कोशिकाओं और ऊतकों को संभालने के साथ जुड़े कारक हैं। जब मनुष्य की तुलना में इन समझ प्रजाति विशेष के चयापचय की प्रक्रिया में मतभेद, रोग अभिव्यक्ति है, और रोगजनन के phenotypes शामिल हैं। यह भी ध्यान दें कि महत्वपूर्ण हैफिर से माउस और मानव जीन अभिव्यक्ति और प्रतिलेखन कारक सिगनल के बीच महत्वपूर्ण अंतर, कृंतक मॉडल की सीमाओं और समझ है जो रास्ते मूषक और मनुष्यों के बीच 8-11 संरक्षित कर रहे हैं के महत्व को उजागर कर रहे हैं। दूसरों एन तेरा -2 (NT2) मानव teratocarcinoma सेल लाइन और inducible स्टेम कोशिकाओं (IPSCs) सहित मानव neuronal सेल लाइनों का उपयोग कार्यरत है। ये सेल लाइनों में इन विट्रो मानव प्रणाली के लिए अच्छा मॉडल उपलब्ध कराते हैं। हालांकि, retinoic एसिड (आरए) न्यूरॉन्स, astrocytes के एक मिश्रित आबादी की पीढ़ी में परिणाम है, और रेडियल glial कोशिकाओं 12, एक अतिरिक्त शुद्धि कदम की जरूरत के साथ NT2 कोशिकाओं के भेदभाव न्यूरॉन्स की शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए। इसके अतिरिक्त, NT2 कोशिकाओं को एक अत्यधिक चर कुपोषण 13, कोशिकाओं के 72% में अधिक से अधिक से अधिक 60 गुणसूत्रों के साथ प्रदर्शित करता है। IPSCs अलग सेल लाइनों के बीच भेदभाव में परिवर्तनशीलता का प्रदर्शन और भेदभाव दक्षता में भिन्नता 14। यह इसलिए इन विकल्पों पूरक करने के लिए एक सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मानव न्यूरोनल सेल मॉडल है वांछनीय है।

एसएच SY5Y neuroblast कोशिकाओं की तरह माता पिता का neuroblastoma सेल लाइन एस एन श के एक subclone हैं। माता पिता का सेल लाइन एक अस्थि मज्जा बायोप्सी दोनों neuroblast की तरह है और उपकला कोशिकाओं की तरह होता है कि 15 से 1970 में तैयार की गई थी। एसएच SY5Y कोशिकाओं को एक स्थिर 47 गुणसूत्रों से मिलकर कुपोषण है, और आरए के उपयोग सहित विभिन्न तंत्र, phorbol एस्टर, और इस तरह के मस्तिष्क व्युत्पन्न के रूप में विशिष्ट Neurotrophins की एक किस्म के माध्यम से परिपक्व मानव न्यूरॉन्स में एक neuroblast की तरह राज्य से भेदभाव किया जा सकता neurotrophic कारक (BDNF)। पहले सबूत से पता चलता है कि अलग अलग तरीकों का उपयोग इस तरह के एड्रीनर्जिक, कोलीनर्जिक, और डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स 16,17 के रूप में विशिष्ट न्यूरॉन उपप्रकार के लिए चुन सकते हैं। यह बाद पहलू एसएच SY5Y कोशिकाओं तंत्रिका जीव विज्ञान के प्रयोगों की एक भीड़ के लिए उपयोगी बनाता है।

ontent "> कई अध्ययनों से उनकी undifferentiated और विभेदित राज्यों में एसएच SY5Y कोशिकाओं के बीच महत्वपूर्ण अंतर का उल्लेख किया है। जब एसएच SY5Y कोशिकाओं undifferentiated हैं, वे तेजी से पैदा और गैर-ध्रुवीकृत, बहुत कुछ, लघु प्रक्रियाओं के साथ दिखाई देते हैं। वे अक्सर बढ़ने गुच्छों में और एक्सप्रेस मार्कर अपरिपक्व न्यूरॉन्स 18,19 का संकेत है। जब भेदभाव, इन कोशिकाओं को लंबे, शाखायुक्त प्रक्रियाओं, प्रसार में कमी का विस्तार, और कुछ मामलों में फूट डालना 2,18। पूरी तरह से विभेदित एसएच SY5Y कोशिकाओं पहले एक व्यक्त करने के लिए प्रदर्शन किया गया है विकास से जुड़े प्रोटीन (जीएपी-43), न्यूरोनल नाभिक (NeuN), synaptophysin (SYN), synaptic पुटिका प्रोटीन द्वितीय (SV2), विशिष्ट न्यूरॉन enolase (एनएसई) और microtubule जुड़े प्रोटीन (एमएपी) सहित परिपक्व न्यूरॉन्स के विभिन्न मार्कर की विविधता 2,16,17,20, और जैसे glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) के रूप में 4 glial मार्करों की अभिव्यक्ति की कमी है। आगे का समर्थन है कि भेदभाव एसएच SY5Y कोशिकाओं में represeNT एक सजातीय न्यूरोनल जनसंख्या, BDNF को हटाने के सेलुलर apoptosis 4 में परिणाम है। यह पता चलता है कि भेदभाव एसएच SY5Y कोशिकाओं के अस्तित्व पौष्टिकता संबंधी कारकों, न्यूरॉन्स परिपक्व करने के लिए समान पर निर्भर है।

एसएच SY5Y कोशिकाओं के उपयोग के बाद से 1,978 subclone 3 में स्थापित किया गया था बढ़ गया है। उनके उपयोग के कुछ उदाहरण पार्किंसंस रोग 17, अल्जाइमर रोग 21, और 22 पोलियो वायरस, enterovirus 71 (EV71) सहित वायरल संक्रमण के रोगजनन 23,24 की जांच में शामिल , छोटी चेचक दाद वायरस (VZV) 1, मानव cytomegalovirus 25, और दाद सिंप्लेक्स वायरस (एचएसवी) 2,26। ऐसा नहीं है कि कई अध्ययनों से ध्यान दें करने के लिए उपयोग एसएच SY5Y कोशिकाओं उनके undifferentiated रूप में इन कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है, विशेष रूप से neurovirology 27-36 के क्षेत्र में महत्वपूर्ण है। बनाम भेदभाव एसएच SY5Y कोशिकाओं undifferentiated मनाया phenotype में अंतर whe का सवाल उठता हैवहाँ संक्रमण की प्रगति मनाया परिपक्व विभेदित न्यूरॉन्स में अलग होगा। उदाहरण के लिए, भेदभाव एसएच SY5Y कोशिकाओं बनाम undifferentiated, proliferating एसएच SY5Y कोशिकाओं है, जो सतह रिसेप्टर्स कि एचएसवी बाँध और अविभाजित एसएच SY5Y कोशिकाओं 2 पर प्रवेश मिलाना की कमी के कारण हो सकता है एचएसवी -1 तेज की एक उच्च क्षमता है। इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि जब एक प्रयोग के लिए इन विट्रो में न्यूरॉन्स के परीक्षण पर ध्यान केंद्रित डिजाइनिंग, एसएच SY5Y कोशिकाओं क्रम में विवो मॉडल के लिए अनुवाद और तुलना के लिए सबसे सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए भेदभाव किया जाना चाहिए है।

एक विश्वसनीय पद्धति के विकास के मानव neuronal संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए शोधकर्ताओं translational प्रयोगों सही है कि मानव तंत्रिका तंत्र मॉडल प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक प्रक्रिया है कि पिछले विधियों 1-4 से निकाली गई सर्वोत्तम प्रथाओं रूपरेखा बनाती है मानव न्यूरॉन्स कि भेदभाव कर रहे हैं के लिए संतुष्ट करने के लिए हैretinoic एसिड का उपयोग कर।

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Protocol

1. सामान्य विचार

  1. आवश्यक अभिकर्मकों की एक सूची के लिए सामग्री / उपकरण की तालिका देखें। सख्त सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत सभी चरणों का प्रदर्शन।
  2. सभी मीडिया तैयारी है कि FBS शामिल करने के लिए गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (hiFBS) का प्रयोग करें। गर्मी निष्क्रिय करने के लिए, 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर FBS की एक 50 मिलीलीटर विभाज्य गर्म है, हर 10 मिनट inverting (भी 1 टेबल देखें)।
    नोट: FBS के बिना गर्मी निष्क्रियता का इस्तेमाल किया जाता है, उपकला की तरह phenotype एसएच SY5Y कोशिकाओं की संस्कृतियों भर में और अधिक तेजी से प्रगति।
  3. उपयोग करने से पहले, मीडिया गर्म और एक मशीन में संतुलित करना हर कदम से पहले एक उचित पीएच संतुलन स्थापित करने के लिए अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, मीडिया के 50 मिलीलीटर लगभग एक घंटा लगता है पूरी तरह से संतुलित करने के लिए (पीएच 7, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)।
    नोट: इस प्रोटोकॉल एक दो कदम बंटवारे प्रक्रिया है कि आंशिक रूप से विभेदित एसएच SY5Y कोशिकाओं trypsinized किए जाने की आवश्यकता है और फिर से चढ़ाया उपयोग करता है। यह एक तनावपूर्ण हैइन असाधारण नाजुक कोशिकाओं के लिए प्रक्रिया। इसलिए, यह समय की एक न्यूनतम राशि के लिए trypsin में कोशिकाओं को सेते के लिए महत्वपूर्ण है। यह न्यूरॉन्स की तरजीही लिफ्ट बंद के लिए अनुमति देगा, अभी भी पकवान से जुड़ी उपकला कोशिकाओं की तरह छोड़ने।
  4. धीरे-धीरे कोशिकाओं से युक्त शंक्वाकार ट्यूब के नीचे के खिलाफ टिप के साथ एक 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक pipet के साथ भेदभाव कर कोशिकाओं के विचूर्णन प्रदर्शन करना। ऊपर और नीचे कोई एक धीमी गति से विचूर्णन प्रदर्शन करना, अधिक से अधिक पांच बार।

2. एसएच SY5Y रखरखाव संस्कृतियों के पारित

  1. विभाजन रखरखाव संस्कृतियों जब कोशिकाओं 70-80% confluency तक पहुँच चुके हैं और 10 से 15 अंश से अधिक नहीं है। संस्कृतियों आमतौर पर हर 3-5 दिनों (यह मानते हुए संस्कृतियों बंटवारे के दौरान 5 गुना से भी अधिक पतला नहीं कर रहे हैं) passaged जाने की जरूरत है।
  2. एक टी -75 कुप्पी से पारित होने की कोशिकाओं के लिए, मीडिया से दूर aspirate, तो पीबीएस 1x लगभग 10 मिलीलीटर से कुल्ला।
    नोट: हम एसएच SY5Y रखरखाव संस्कृतियों फू बंटवारे की सिफारिश नहीं है1 से rther: passaging के दौरान 5 क्योंकि यह कोशिकाओं को कम confluency के कारण मरने के लिए पैदा कर सकता है।
  3. महाप्राण पीबीएस, और फिर 2.5 मिलीलीटर 0.05% trypsin EDTA (1x) जोड़ें।
  4. इनक्यूबेटर 2-3 मिनट में सेते हैं और धीरे टिप कुप्पी की सतह से कोशिकाओं को रिहा करने के लिए।
  5. 10 मिलीलीटर बेसिक ग्रोथ मीडिया जोड़ें (2 टेबल देखें) और 1-2 बार triturate।
  6. 1,000 XG पर 2 मिनट के लिए नीचे स्पिन, महाप्राण मीडिया, तो 5 मिलीलीटर बुनियादी विकास मीडिया में गोली resuspend।
  7. T-75 फ्लास्क में सामान्य चढ़ाना के लिए 20 मिलीलीटर की कुल मात्रा में 5, या भेदभाव (धारा 5) के लिए गिनती और प्लेट: 3 के लिए 1: 1 से कोशिकाओं को पतला।

3. बर्फ़ीली एसएच SY5Y कोशिकाओं

  1. बेसिक विकास मीडिया में एसएच SY5Y neuroblastoma कोशिकाओं 5% (वी / वी) DMSO के साथ पूरक के प्रारंभिक मार्ग रुक।
  2. प्रारंभ में, 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर aliquots फ्रीज तो लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए स्थानांतरण।
    नोट: संदर्भ के लिए, एक मिला हुआ (75-85%) टी -75 फ्लास्क पांच निकलेगाठंड के लिए एसएच SY5Y कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर aliquots। इन aliquots से प्रत्येक की कुल 2-5000000 कहीं से कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए।

4. पिघलना और संस्कृति Undifferentiated एसएच SY5Y neuroblastoma कोशिकाओं

  1. बेसिक ग्रोथ मीडिया तैयार करें।
  2. तेजी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान (लगभग 2 मिनट) में जमे हुए कोशिकाओं पिघलना।
  3. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 9 मिलीलीटर बुनियादी विकास मीडिया में Resuspend कोशिकाओं, और फिर कम 1,000 x जी 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  4. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला जबकि 10 मिलीलीटर बुनियादी विकास मीडिया में pelleted कोशिकाओं, और धीरे resuspend कोशिकाओं को परेशान करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा।
  5. एक टी 25 कुप्पी या 60 मिमी 2 पकवान पर प्लेट कोशिकाओं।
  6. अगले दिन, मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए मीडिया की जगह।

5. दिवस 0: चढ़ाना भेदभाव के लिए प्रकोष्ठों

  1. भेदभाव अनुसूची के लिए चित्रा 1 देखें।
  2. 1x पीबीएस, महाप्राण साथ undifferentiated कोशिकाओं कुल्ला, और उसके बाद का उपयोग कर 1-2 मिलीलीटर गर्म trypsinize1x 0.05% trypsin EDTA।
  3. जब कोशिकाओं trypsin में हैं, एक मशीन में लगभग 3 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. 10 मिलीलीटर बेसिक ग्रोथ मीडिया जोड़कर trypsin बुझाना कुप्पी या पकवान के पक्ष कुल्ला, और धीरे 1-3 बार triturate। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब सामग्री हस्तांतरण।
  5. 1,000 XG पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, और मीडिया aspirate जबकि गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा।
  6. 5 मिलीलीटर बुनियादी विकास मीडिया में resuspend गोली और 1-3 बार triturate।
  7. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना, तो / एमएल 50,000 कोशिकाओं को बेसिक ग्रोथ मीडिया का उपयोग कर पतला।
  8. प्लेट पकवान प्रति 100,000 कोशिकाओं की कुल के लिए प्रति 35 मिमी 2 पकवान कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर और इनक्यूबेटर में वापस जगह है।

6. दिन 1: बदलें मीडिया (भेदभाव मीडिया # 1)

  1. के भेदभाव मीडिया # 1 अशेष 50 मिलीलीटर (2 टेबल देखें) और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं।
  2. जब मीडिया गरम है, यह एक मशीन में संतुलित करने की अनुमति (37डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) कम से कम एक घंटे के लिए एक उचित पीएच संतुलन का उपयोग करने से पहले स्थापित करने के लिए।
  3. Retinoic एसिड (आरए) जोड़ें तुरंत बर्तन करने के लिए मीडिया को जोड़ने से पहले गरम करने के लिए और equilibrated मीडिया (1 टेबल देखें)।
    नोट: Retinoic एसिड प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे बोतलों में संग्रहित किया जाना चाहिए
  4. धीरे पुराने मीडिया बंद aspirate और त्यागें।
  5. प्रति 35 मिमी 2 पकवान आरए के साथ जोड़े 2 मिलीलीटर भेदभाव मीडिया # 1 और इनक्यूबेटर में लौटने।

7. दिन 3: बदलें मीडिया (भेदभाव मीडिया # 1)

  1. दोहराएँ धारा 6 (चरण 1-5)

8. दिन 5: बदलें मीडिया (भेदभाव मीडिया # 1)

  1. दोहराएँ धारा 6 (चरण 1-5)

9. दिन 7: विभाजन प्रकोष्ठों 1: 1

  1. आरए गरम में जोड़ें और equilibrated भेदभाव मीडिया # 1 तुरंत बर्तन करने के लिए मीडिया को जोड़ने से पहले।
  2. धीरे पुराने मीडिया बंद aspirate और त्यागें।
  3. 200 μl जोड़ेप्रति 35 मिमी 2 पकवान 0.05% 1x Trypsin EDTA गरम और इनक्यूबेटर लगभग 2-3 मिनट या कोशिकाओं तक दिख थाली के रूप में एक माइक्रोस्कोप के नीचे देखा से उठा लिया जाता है में गर्म है।
  4. प्रति 35 मिमी 2 पकवान आरए के साथ जोड़ने के 2 मिलीलीटर भेदभाव मीडिया # 1 द्वारा trypsin बुझाना और मीडिया का उपयोग थाली से दूर neuronal कोशिकाओं शेष कुल्ला करने के लिए। फिर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए सामग्री हस्तांतरण।
    नोट: trypsinization चरणों के दौरान, एक बार में भी कई व्यंजन trypsinize नहीं है। यह सुनिश्चित करने के लिए neuronal संस्कृतियों भी लंबे समय के लिए trypsin में incubated नहीं कर रहे हैं, जो साइटोटोक्सिक हो सकता है में मदद करता है।
  5. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 10 व्यंजन से सामग्री का मिश्रण है और धीरे से ऊपर और एक 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक pipet के साथ कोई अधिक से अधिक पांच बार धीरे धीरे नीचे triturate।
  6. ताजा 35 मिमी 2 व्यंजन में अशेष 2 मिलीलीटर सेल निलंबन और इनक्यूबेटर में लौटने।

10 दिवस 8: बदलें मीडिया (भेदभाव मीडिया # 2)

  1. आरए जोड़े (देखें <strong> तालिका 1) गरम और equilibrated मीडिया तुरंत बर्तन करने के लिए मीडिया को जोड़ने से पहले करने के लिए।
  2. धीरे पुराने मीडिया बंद aspirate और त्यागें।
  3. धीरे धीरे जोड़ने के 2 एमएल भेदभाव मीडिया # 2 (2 टेबल देखें) प्रति 35 मिमी 2 पकवान और इनक्यूबेटर पर लौटने आरए के साथ। न्यूरॉन्स की अनुमति न दें समय के रूप में वे जल्दी से बाहर शुष्क कर सकते हैं की एक विस्तारित अवधि के लिए हवा से अवगत कराया जाएगा।

11. दिन 9: बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) तैयार लेपित बर्तन

  1. बर्फ पर ईसीएम समाधान की एक शीशी गला लें और पतला 1: ठंड DMEM में 100।
  2. प्रत्येक 35 मिमी 2 डिश में मिश्रण के 2 मिलीलीटर बांटना और यह सुनिश्चित डिश के पूरे आधार कवर किया जाता है।
  3. एक मशीन में प्लेस (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) 1 घंटा या रात भर के लिए।
  4. महाप्राण मिश्रण है और एक डाकू में लगभग 1 घंटे के लिए शुष्क हवा के लिए अनुमति देते हैं। अप करने के लिए 2 महीने के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर।

12. दिन 10: स्थानांतरण कोशिकाओं परईसीएम लेपित प्लेट 1: 1

  1. आरए जोड़े तुरंत बर्तन करने के लिए मीडिया को जोड़ने से पहले गरम करने के लिए और equilibrated मीडिया (1 टेबल देखें)।
  2. धीरे मीडिया से दूर aspirate और त्यागें।
  3. प्रत्येक 35 मिमी 2 डिश के लिए trypsin गरम 200 μl जोड़ें और लगभग 1-2 मिनट के लिए या जब तक न्यूरॉन्स दिख रूप में एक माइक्रोस्कोप के नीचे देखा पकवान से उठा रहे हैं कमरे के तापमान पर सेते दें।
    नोट: कमरे के तापमान पर इस trypsinization कदम निष्पादित के रूप में तो नहीं trypsin के साथ न्यूरॉन्स ज्यादा सेते हैं और नुकसान होता है। न्यूरॉन्स प्लेटों इस स्तर पर उपकला कोशिकाओं की तरह तुलना में बहुत तेजी से जारी है।
  4. प्रति 35 मिमी 2 पकवान जोड़ने 2 मिलीलीटर भेदभाव मीडिया # 2 द्वारा trypsin बुझा लेते हैं और थाली से दूर neuronal कोशिकाओं शेष कुल्ला करने के लिए मीडिया का उपयोग करें। फिर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए सामग्री हस्तांतरण।
  5. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 10 व्यंजन से सामग्री का मिश्रण है और धीरे से ऊपर और साथ कोई और अधिक से अधिक पांच बार धीरे धीरे नीचे triturateएक 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक pipet।
  6. ईसीएम लेपित 35 मिमी 2 बर्तन में 2 मिलीलीटर सेल निलंबन बांटना और इनक्यूबेटर में लौटने।

13. 11 दिन: बदलें मीडिया (भेदभाव मीडिया # 3)

  1. आरए जोड़े तुरंत बर्तन करने के लिए मीडिया को जोड़ने से पहले गरम करने के लिए और equilibrated मीडिया (1 टेबल देखें)।
  2. धीरे पुराने मीडिया बंद aspirate और त्यागें।
  3. धीरे-धीरे बढ़कर 35 मिमी 2 पकवान आरए के साथ जोड़ने के 2 मिलीलीटर भेदभाव मीडिया # 3 (2 टेबल देखें) और इनक्यूबेटर में लौटने। न्यूरॉन्स की अनुमति न दें समय की एक विस्तारित अवधि के लिए हवा से अवगत कराया जाएगा।

14. 14 दिन: बदलें मीडिया (भेदभाव मीडिया # 3)

  1. दोहराएँ धारा 13 (कदम 1-3)

15. 17 दिन: अंतिम मीडिया बदलें (भेदभाव मीडिया # 3)

  1. दोहराएँ धारा 13 (कदम 1-3)

16. दिन 18: का प्रयोग करने के लिए तैयार Neuronal संस्कृति

  1. ताजा डिफ के लिए मीडिया बदलेंerentiation मीडिया # 3 आरए के साथ हर 3 दिन न्यूरॉन स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए।
    नोट: प्रकोष्ठों न्यूरॉन्स में भेदभाव किया जाना चाहिए और एक neuronal phenotype दिखा रहे हैं। संस्कृतियों आमतौर पर टर्मिनल भेदभाव निम्नलिखित अप करने के लिए 14 दिनों के लिए स्थिर रहे हैं, हालांकि न्यूरॉन व्यवहार्यता की अवधि के भेदभाव के शुरू में undifferentiated कोशिकाओं के पारित होने पर निर्भर करता है। उच्चतर पारित होने संख्या एक छोटी उपयोगी जीवन भर के साथ अलग-अलग न्यूरॉन्स निकलेगा।

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Representative Results

वर्तमान में, वहाँ तंत्रिका जीव विज्ञान और neurovirology के क्षेत्र में इस तरह के कई उदाहरण हैं इष्टतम वायरल तेज हैं कि 2 के रूप में जहां undifferentiated एसएच SY5Y कोशिकाओं मानव न्यूरॉन्स 27-36, और महत्वपूर्ण बात, undifferentiated कोशिकाओं की कमी हो सकती phenotypes के लिए एक कार्यात्मक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है सटीक व्याख्या के लिए आवश्यक है। यह महत्वपूर्ण है कि जब एसएच SY5Y कोशिकाओं का उपयोग या किसी अन्य के लिए इन विट्रो न्यूरोनल प्रणाली, कोशिकाओं को उचित रूप से न्यूरॉन्स में, क्रम में डेटा है कि क्या इन विवो में न्यूरॉन्स में होने वाली हो सकता है का सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व है प्राप्त करने के लिए संभव में भेदभाव कर रहे हैं। ऊपर प्रोटोकॉल पैदावार अत्यधिक व्यवहार्य, समरूप, विभेदित न्यूरोनल 18 दिनों के भीतर संस्कृतियों, कि बाद में जैव रासायनिक और इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का विश्लेषण करती है। अविभाजित एसएच SY5Y neuroblastoma कोशिकाओं, एक बड़े, फ्लैट, उपकला-तरह कई छोटे प्रक्रियाओं जावक का विस्तार (2A चित्रा) के साथ phenotype प्रदर्शित करते हुए अलग-अलग सेलरों कई neuritic अनुमानों कि आसपास की कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) के लिए कनेक्ट के पास है। यह महत्वपूर्ण है कि जब एसएच SY5Y कोशिकाओं फर्क, कोशिकाओं trypsin के साथ समय की एक न्यूनतम अवधि के लिए सुनिश्चित करें कि केवल न्यूरॉन्स पकवान से जारी कर रहे हैं incubated हैं। इस अविभाजित उपकला कोशिकाओं है कि अन्यथा विभेदित न्यूरोनल सेल की आबादी को दूषित होगा पीछे छोड़ देता है। पूरी तरह से भेदभाव किया एसएच SY5Y कोशिकाओं के न्यूरोनल विशेषताओं जैसे शास्त्रीय न्यूरोनल मार्कर (चित्रा 3) के immunofluorescence पता लगाने के रूप तकनीकों से प्रदर्शन कर रहे हैं।

एसएच SY5Y कोशिकाओं भेदभाव के दौरान अलग phenotypes की एक किस्म का प्रदर्शन और यह उन है कि जोर दिया जाता है से स्वस्थ न्यूरॉन्स की पहचान करने में सक्षम होना करने के लिए महत्वपूर्ण है। भेदभाव दिन 1 पर, भेदभाव मीडिया की # 1 शुरूआत से पहले, कोशिकाओं छोटी, ठूंठदार प्रक्रियाओं (चित्रा -4 ए) के साथ एक फ्लैट, मुकर phenotype है।सीरम अभाव के 5 दिनों के बाद, एसएच SY5Y कोशिकाओं अब अनुमानों को विकसित करने और एक अधिक न्यूरोनल phenotype (चित्रा 4 बी) प्रदर्शित करने के लिए शुरू करते हैं। Passaging एसएच SY5Y कोशिकाओं के लिए एक कठोर प्रक्रिया है, और दिनों के तुरंत बाद passaging पर, कोशिकाओं अस्वस्थ दिखाई देते हैं। यह सेल शरीर clumping और कम, छोटे प्रक्रियाओं की उपस्थिति इसका सबूत है। (छवियों से पहले देखें: आंकड़े 4C और 4E, और छवियों के बाद: आंकड़े 4D और 4F)। लगभग 48 घंटा एक विभाजन के बाद, कोशिकाओं को ठीक करने के लिए दिखाई देते हैं, और पूरी तरह से परिपक्व, विभेदित न्यूरॉन्स 18 दिन (चित्रा 2 बी) पर प्राप्त कर रहे हैं। यह सेल शरीर clumping में कमी, और कई पतली के विस्तार इसका सबूत है, neuritic प्रक्रियाओं है कि अक्सर पड़ोसी कोशिकाओं से कनेक्ट branched।

कारक है कि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और व्यवहार्य neuronal संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं का उपयोग शामिल है गर्मी निष्क्रिय FBS, trypsin ऊष्मायन को कमसमय, और कोमल विचूर्णन। महत्वपूर्ण बात है, इस प्रोटोकॉल hiFBS के विभिन्न सांद्रता, जिससे कोशिकाओं के लिए एक सीरम की कमी से जूझ रहे राज्य में एक सज्जन संक्रमण बनाने के साथ चार अलग-अलग मीडिया योगों के उपयोग का विवरण। परिपक्व एसएच SY5Y कोशिकाओं को स्वस्थ हैं, वे कई अनुमानों कि आसपास के न्यूरॉन्स (चित्रा 5 ए) से कनेक्ट प्रदर्शित करता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक विशिष्ट उपकला phenotype neuronal संस्कृतियों से आगे निकल जाएगा अगर वे भेदभाव प्रक्रिया (चित्रा 5 ब) के दौरान mishandled रहे हैं। इसके अलावा, यदि न्यूरॉन्स मरने के लिए शुरू, neurites वापस लेना होगा, सेल निकायों साथ पेड़ों का झुरमुट और दौर शुरू हो जाएगा, और neurite अध: पतन से मलबे में और सेल प्रक्रियाओं के आसपास जमा करने के लिए शुरू कर देंगे। इस प्रक्रिया को क्या आंकड़े 5C और 5 डी में प्रदर्शन किया है करने के लिए समान है। चित्रा 5C पोषक तत्व और पर्यावरण के अभाव निम्नलिखित कोशिका मृत्यु का एक और अधिक प्राकृतिक प्रगति से पता चलता है, जबकिचित्रा 5 डी एक एचएसवी -1 तनाव, कोस, 10 6 PFU के (MOI) संक्रमण की बहुलता पर साथ भेदभाव एसएच SY5Y न्यूरॉन्स 4 घंटा के बाद संक्रमण से पता चलता है। इस प्रोटोकॉल को अच्छी तरह से न्यूरॉन्स की प्रयोगशाला और पैदावार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सजातीय आबादी है, जो नीचे की ओर विश्लेषण करती है और प्रयोग के लिए आवश्यक हैं में अनुकूलित किया गया है।

आकृति 1
चित्रा 1:। भेदभाव प्रक्रिया की समय सारिणी भेदभाव प्रक्रिया 11 कदम एक 18 दिन की अवधि के पाठ्यक्रम पर बाहर फैल के होते हैं। भेदभाव प्रोटोकॉल (0 दिन) के पहले दिन 25,000 और 100,000 के बीच कोशिकाओं uncoated 35 मिमी व्यंजन पर चढ़ाया जाता है। 1 दिन, 3, और 5 पर, पुराने मीडिया निकाल दिया जाता है और भेदभाव मीडिया # 1 लागू किया जाता है। में भेदभाव मीडिया # 1 uncoated 35 मिमी व्यंजन पर 1: 7 दिन, कोशिकाओं 1 विभाजित कर रहे हैं। 8 दिन, मीडिया भेदभाव करने के लिए बदल गया हैमीडिया # 2, और 10 दिन पर, कोशिकाओं को फिर से विभाजित कर रहे हैं 1: 1, लेकिन भेदभाव मीडिया में # 2 ईसीएम लेपित 35 मिमी व्यंजन पर इस बार। दिन 11, 14, और 17 पर, पुराने मीडिया निकाल दिया जाता है और भेदभाव मीडिया # 3 लागू किया जाता है। 18 दिन, विभेदित न्यूरॉन्स बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उपयोग करने के लिए तैयार हैं।

चित्र 2
चित्रा 2:। Undifferentiated और विभेदित एसएच SY5Y कोशिकाओं की रूपात्मक उपस्थिति (ए) Undifferentiated एसएच SY5Y कोशिकाओं जबकि (बी) के भेदभाव एसएच SY5Y न्यूरॉन्स व्यापक और लम्बी neuritic अनुमानों का प्रदर्शन कुछ अनुमानों के साथ एक फ्लैट phenotype है। छवियाँ एक औंधा epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग 20X बढ़ाई चरण में प्राप्त किया गया।

चित्र तीन
चित्र तीन:मार्करों के neuronal भेदभाव। इम्यूनोफ्लोरेसेंस पूरी तरह से भेदभाव किया एसएच SY5Y कोशिकाओं के न्यूरोनल सुविधाओं illuminates। (ए) विरोधी SMI31 (हरा) neurites की व्यापक नेटवर्क में फॉस्फोरिलेटेड neurofilament एच दाग। (बी) विरोधी MAP2 (लाल) microtubule जुड़े प्रोटीन 2, न्यूरोनल सोमा और neurites के समीपस्थ भाग खुलासा लेबल। प्रत्येक immunofluorescence पैनल के लिए इसी चरण छवि सही करने के लिए दिखाया गया है। छवियाँ एक औंधा epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग 10X बढ़ाई प्राप्त किया गया। स्केल पट्टी, 100 माइक्रोन।

चित्रा 4
चित्रा 4: भेदभाव प्रोटोकॉल का मध्यवर्ती कदम (ए) भेदभाव के दिन 1।। प्रकोष्ठों कम अनुमानों के साथ एक मुकर phenotype बनाए रखें। (बी) के भेदभाव के दिन 5। प्रकोष्ठों 5 दिन के लिए खुल गया हैसीरम अभाव के एस (भेदभाव मीडिया # 1)। जीवित कोशिकाओं बढ़ाना और अब प्रक्रियाओं है कि पड़ोसी की कोशिकाओं के साथ कनेक्ट आकार लेने लगते हैं। (सी) भेदभाव को विभाजित करने के लिए पहले के दिन 7। प्रकोष्ठों, लंबी प्रक्रियाओं की उच्च संख्या का प्रदर्शन एक उपकला की तरह phenotype का प्रदर्शन कोशिकाओं की कम संख्या के साथ। (डी) दिवस भेदभाव के 8, एक दिन पहले पारित होने के बाद। बंटवारे के बाद, सेल निकायों फार्म झुरमुटों और प्रक्रियाओं passaging प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में कम दिखाई देते हैं। (ई) भेदभाव के दिन 10, पूर्व ईसीएम लेपित प्लेटों पर विभाजित करने के लिए। प्रकोष्ठों अब प्रक्रियाओं है कि पास के कोशिकाओं के साथ कनेक्शन बनाने प्रदर्शित करता है। सेल शरीर क्लस्टरिंग भी स्पष्ट है। (एफ) दिवस भेदभाव के 11, दूसरे विभाजन के बाद एक दिन। प्रकोष्ठों दूसरे पारित होने के बाद जोर दिया जाता है और कई न्यूरॉन्स अंततः खो रहे हैं। हालांकि, शेष आबादी, व्यवहार्य समरूप है, और phenotype में न्यूरोनल है। सेल निकायों एल उत्पादनarger समूहों और प्रक्रियाओं समूहों के आधार से फेंकना शुरू करते हैं।

चित्रा 5
चित्रा 5:। उपकला अतिवृद्धि और neuronal मौत - भेदभाव प्रक्रिया के दो विकल्प परिणामों (ए) स्वस्थ, परिपक्व एसएच SY5Y न्यूरॉन्स axonal फैलाना पड़ोसी कोशिकाओं को जोड़ने के अनुमानों प्रदर्शित करता है। (बी) के कुछ उदाहरणों में, एक अधिक उपकला की तरह phenotype के साथ कोशिकाओं के रखरखाव संस्कृतियों से आगे निकल। उपकला कोशिकाओं की तरह के इस ओवर-आबादी रखरखाव संस्कृतियों का निराला passaging के कारण हो सकता है। इन संस्कृतियों, खारिज किया जाना चाहिए के रूप में उपकला कोशिकाओं की तरह न्यूरॉन्स की संख्या से बढ़ना जारी रहेगा। तीर उपकला कोशिकाओं की तरह निरूपित। (सी) जब एसएच SY5Y कोशिकाओं अस्वस्थ हैं और मरने के लिए शुरू, सेल निकायों दौर और प्रक्रियाओं को नीचा दिखाना, मलबे का एक महत्वपूर्ण राशि पैदा होता है। (डी 6 के (MOI) संक्रमण की बहुलता पर दाद सिंप्लेक्स वायरस 1 (एचएसवी -1) कोस के एक तनाव के साथ संक्रमण के बाद PFU।

अंग विवरण भण्डार अनुदेश
10 माइक्रोन आरए सब पार retinoic एसिड 5 मिमी 33.3 मिलीलीटर 95% EtOH में 50 मिलीग्राम आरए Resuspend। आरए गर्मी, प्रकाश, और हवा के प्रति संवेदनशील है। 6 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे बोतल और दुकान में रखें। 1 पर प्रयोग करें: 500 कमजोर पड़ने और भेदभाव मीडिया तुरंत उपयोग करने से पहले में पतला
(३००.४४ जी / मोल)
1x B-27 B-27 अनुपूरक 50x -80 डिग्री सेल्सियस पर एकल उपयोग 1 मिलीलीटर aliquots में 1-10 मिलीलीटर की बोतल और विभाज्य शेष और दुकान गला लें। स्टोर में 10 मिलीलीटर की बोतल -20 डिग्री सेल्सियस पर
20 मिमी KCl पोटेशियम क्लोराइड 1 एम 18.6 जी KCl और बाँझ फिल्टर करने के लिए 250 मिलीलीटर पानी जोड़ें। कमरे के तापमान पर रखो
(७४.५५ जी / मोल)
2 मिमी DB शिविर dibutyryl चक्रीय एएमपी 1 एम 2.04 मिलीलीटर पानी छ 1 DB शिविर जोड़कर पूरी बोतल Resuspend। प्रकाश और नमी के प्रति संवेदनशील। पर या तो -20 डिग्री सेल्सियस या 100 या 200 μl μl की aliquots में स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस
(४९१.३७ जी / मोल)
50 एनजी / एमएल BDNF मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक (BDNF) - अपकेंद्रित्र शीशी नीचे करने के लिए पाउडर पाने के लिए।60; 1 मिलीलीटर Neurobasal में resuspend 10 माइक्रोग्राम शीशी + 1x B27 या 5 0.5 मिलीलीटर Neurobasal + 1x B27 में माइक्रोग्राम प्रति शीशी 10 माइक्रोग्राम / एमएल पाने के लिए। 200 कमजोर पड़ने: 1 पर प्रयोग करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर में काम कर aliquots (पूर्व: 250 μl)
hiFBS गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम - अशेष 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में FBS thawed। 30 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में 56 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी। निकालें और -20 डिग्री सेल्सियस पर काम कर aliquots फ्रीज

तालिका 1: स्टॉक समाधान और घटकों।

बेसिक ग्रोथ मीडिया
अंग 500 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम घोला
EMEM 415 मिलीलीटर EMEM
15% hiFBS 75 मिलीलीटर hiFBS
1x पेन / Strep 5 मिलीलीटर पेन / Strep 1: 100
2 मिमी glutamine 5 मिलीलीटर Glutamine 1: 100
* 6 सप्ताह के लिए अधिकतम रखें
भेदभाव मीडिया # 1
अंग 50 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम घोला
EMEM 48 मिलीलीटर EMEM
2.5% hiFBS 1.3 मिलीलीटर hiFBS
1x पेन / Strep 500 μl पेन / Strep 1: 100
2 मिमी glutamine 500 μl Glutamine 1: 100
10 माइक्रोन आरए 100 μl आरए (5 मिमी शेयर) 1: 500
* रखें 2 सप्ताह के लिए अधिकतम और आरए तुरंत पहले जोड़नेउपयोग करने के लिए
* अतिरिक्त मीडिया एक बार आरए जोड़ा जाता है न रखें - आरए अस्थिर है
भेदभाव मीडिया # 2
अंग 50 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम घोला
EMEM 49 मिलीलीटर EMEM
1% hiFBS 500 μl hiFBS
1x पेन / Strep 500 μl पेन / Strep 1: 100
2 मिमी glutamine 500 μl Glutamine 1: 100
10 माइक्रोन आरए 100 μl आरए (5 मिमी शेयर) 1: 500
* रखें 2 सप्ताह के लिए अधिकतम और जोड़ने आरए तुरंत उपयोग करने से पहले
* पर अतिरिक्त मीडिया न रखेंसीई आरए जोड़ा जाता है - आरए अस्थिर है
भेदभाव मीडिया # 3
अंग 50 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम घोला
Neurobasal 47 मिलीलीटर Neurobasal
1x B-27 1 मिलीलीटर बी 27 (50X शेयर) 01:50
20 मिमी KCl 1 मिलीलीटर KCl (1 एम स्टॉक) 01:50
1x पेन / Strep 500 μl पेन / Strep 1: 100
2 मिमी GlutamaxI 500 μl GlutamaxI (100x शेयर) 1: 100
50 एनजी / एमएल BDNF 250 μl BDNF शेयर (10 माइक्रोग्राम / एमएल) 1: 200
2 मिमी dibutyryl चक्रीय एएमपी (DB-शिविर) 100 μl DB-शिविर (1 एम स्टॉक) 1: 500
10 माइक्रोन आरए 100 μl आरए (5 मिमी शेयर) 1: 500
* रखें 2 सप्ताह के लिए अधिकतम और जोड़ने आरए तुरंत उपयोग करने से पहले
* अतिरिक्त मीडिया एक बार आरए जोड़ा जाता है न रखें - आरए अस्थिर है

तालिका 2: मीडिया व्यंजनों।

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Discussion

ऊपर प्रोटोकॉल एक सीधा और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि समरूप और व्यवहार्य मानव neuronal संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल की तकनीक और तरीकों कि कई पहले प्रकाशित तरीकों 1-4 और उद्देश्य को एकीकृत प्रत्येक के सर्वोत्तम प्रथाओं चित्रित करने के लिए इस्तेमाल करता है। एसएच SY5Y कोशिकाओं के भेदभाव क्रमिक सीरम अभाव पर निर्भर करता है; retinoic एसिड, neurotrophic कारकों और बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के अलावा; और धारावाहिक बंटवारे भेदभाव परिपक्व पक्षपाती न्यूरॉन्स के लिए चयन करने के लिए। यह सेल लाइन पक्षपाती और निलंबित कोशिकाओं के एक विषम जनसंख्या के रूप में शुरू होता है। इस प्रोटोकॉल passaging या मीडिया बदलने से पहले पीबीएस washes रोक से दोनों आबादी की रक्षा करना है, लेकिन निलंबित कोशिकाओं के कुछ नुकसान मृत उपकला कोशिकाओं को हटाने की अनुमति आवश्यक है। प्रस्तुत विधि आगे प्रयोग के लिए विभेदित मानव एसएच SY5Y न्यूरॉन्स की एक सजातीय जनसंख्या पैदा करता है।

हालांकि otheआर एजेंट एक कोलीनर्जिक या एड्रीनर्जिक phenotype 16,17 में न्यूरॉन्स के भेदभाव का मार्गदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, आरए के उपयोग के अंतर करने के लिए एसएच SY5Y कोशिकाओं पहले से इस्तेमाल किया गया है एक डोपामिनर्जिक phenotype 37,38 के साथ न्यूरॉन्स का उत्पादन। आरए के अलावा G0 / G1 के बाहर कोशिका चक्र प्रगति को गिरफ्तार करने सहित तंत्र के एक नंबर के माध्यम से सेलुलर भेदभाव प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है, cyclin निर्भर kinase (CDK) अवरोधकों P21 और p27 Kip1 और विरोधी apoptotic प्रोटीन बीसीएल की अभिव्यक्ति में वृद्धि -2 और बीसीएल एक्सएल, और PI3K / AKT गतिविधि है जो neurite विकास और भेदभाव 39 में एक भूमिका निभाता बढ़ाने।

यह जरूरी भर में इस प्रोटोकॉल का निष्पादन, कोमल और बाँझ से निपटने की तकनीक का उपयोग करने के लिए के रूप में एसएच SY5Y कोशिकाओं अचानक परिवर्तन करने के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं। यह इस संवेदनशीलता कि क्रमिक सीरम अभाव प्रोटोकॉल प्रोटोकॉल मेड में तेजी से परिवर्तन करने की आवश्यकता है कि अधिक पसंद है की वजह से हैआइए रचना। जब दिन 7 और 10 के आधार पर कोशिकाओं के बंटवारे, यह समय की राशि है कि आंशिक रूप से भेदभाव कर न्यूरॉन्स trypsin में खर्च कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस हानिकारक न्यूरॉन्स की संभावना कम कर देता है और उपकला कोशिकाओं की तुलना में न्यूरॉन्स, जो लंबे समय तक लेने को अलग करने के तरजीही रिहाई को बढ़ावा देता है। यह कोशिकाओं का एक और अधिक सजातीय न्यूरोनल आबादी की स्थापना की और proliferating और undifferentiated उपकला कोशिकाओं के साथ प्रदूषण को कम करने के लिए मदद करता है। यह भी संस्कृति और एसएच SY5Y कोशिकाओं नियमित रूप से और नहीं बदला जाना चाहिए अनिश्चित काल के लिए रखा जाना के भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों नोट करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, बेसिक ग्रोथ मीडिया 6 सप्ताह तक रखा जा सकता है, जबकि भेदभाव मीडिया केवल 2 सप्ताह तक रखा जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करता है इस तरह के dbcAMP और BDNF के रूप में अभिकर्मकों ताजा और स्थिर रहे हैं। इसके अतिरिक्त, तैयार आरए केवल अप करने के लिए 6 सप्ताह के लिए और अंधेरे में संग्रहित किया जाना चाहिए एक ताजा बैच बनाया जाना चाहिए पहले। हम w न्यूरोनल परिणामों में से अधिक से अधिक स्थिरता मनायाइन सावधानियों ith।

एक बार कोशिकाओं परिपक्व न्यूरॉन्स में भेदभाव किया गया है, वे करने के लिए 2 सप्ताह के बाद टर्मिनल भेदभाव के लिए बनाए रखा है और प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। टर्मिनल भेदभाव के बाद, मीडिया हर 3-4 दिनों परिवर्तित किया जाना चाहिए (भेदभाव मीडिया 3 #)। विभेदित न्यूरॉन्स के विपरीत, रखरखाव undifferentiated एसएच SY5Y सेल संस्कृतियों युक्त बोतल नियमित passaging के साथ कई हफ्तों से अधिक रखा जा सकता है। इसे रोकने के लिए नियमित रूप से पारित होने के रखरखाव संस्कृतियों के लिए महत्वपूर्ण है, अधिक आबादी उपकला कोशिकाओं की तरह है कि अब कोई न्यूरॉन्स में फर्क करने में सक्षम हैं के। जब इन कोशिकाओं न्यूरो क्षमता के साथ उन की संख्या से बढ़ना, सीरम भुखमरी कोशिका मृत्यु की आय से अधिक मात्रा के कारण होगा। Undifferentiated संस्कृतियों केवल लगभग 15 अंश तक के लिए बनाए रखा जा सकता है। एक बार जब संस्कृति 15 मार्ग के आसपास पार कर गया है, undifferentiated कोशिकाओं को मरने के लिए शुरू करते हैं और किसी न किसी प्रकार, अस्वस्थ भूमिका है। इसके अतिरिक्त, एडवेंचर्सउच्च पारित होने एसएच SY5Y कोशिकाओं के tiation अधिक कठिन है के रूप में कम कोशिकाओं प्रत्येक विभाजन बच जाएगा, और उन है कि अक्सर दोनों सेल निकायों और एक्सोन कुल, बाद के विश्लेषण और अधिक कठिन बना रही है।

वहाँ भेदभाव प्रक्रिया कई कोशिकाओं खो रहे हैं या बंटवारे की प्रक्रिया जीवित नहीं है के रूप में के दौरान सेल नंबर में एक विशिष्ट कमी है। इसलिए, किसी भी प्रयोग भेदभाव एसएच SY5Y कोशिकाओं को शामिल की शुरुआत में, एक ~ के लिए न्यूरॉन्स की 30-40% हानि खाते हैं और यह सुनिश्चित कोशिकाओं का एक उचित संख्या के शुरू में चढ़ाया जाता है वांछित उपज प्राप्त करने के लिए करना चाहिए। जबकि 100,000 चढ़ाना कोशिकाओं को स्वस्थ, परिपक्व एसएच SY5Y न्यूरॉन्स के बहुत पैदा करता है, कम या बड़ी संख्या में शुरू में प्रयोगात्मक जरूरत के आधार पर चढ़ाया जा सकता है।

यह स्पष्ट है कि पूरी तरह से विभेदित एसएच SY5Y न्यूरॉन्स परिपक्व मानव विवो में पाया की तुलना में न्यूरॉन्स की एक करीब सन्निकटन प्रदान करते हैं उनकी undifferentiated पूर्वज सेल समकक्षों (चित्रा 2)। इन न्यूरॉन्स neurotropic वायरस के अध्ययन के लिए उनकी तंत्रिका जीव विज्ञान के भविष्य के अभिलक्षण के लिए एक लाभप्रद मॉडल प्रदान करेगा, या न्यूरॉन्स में कीमोथेरेपी विषाक्तता के लिए स्क्रीन करने के लिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
B-27 ThermoFisher Scientific 17504-044 See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Sigma SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) Sigma D0627 See Table 1 for preparation
DMSO ATCC 4-X -
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) Sigma M5650 -
Fetal Bovine Serum (FBS)  Hyclone SH30071.03 See Table 1 for preparation
GlutamaxI Life Technologies 35050-061 -
Glutamine Hyclone SH30034.01 -
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-1 See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution Sigma E0282 See step 11 of the protocol
Neurobasal Life Technologies 21103-049 -
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Life Technologies 15140-122 -
Retinoic acid (RA) Sigma R2625 Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells ATCC CRL-2266 -
0.5% Trypsin + EDTA Life Technologies 15400-054 -
Falcon 35 mm TC dishes Falcon (A Corning Brand) 353001 -

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References

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एसएच SY5Y मानव neuroblastoma सेल लाइन के भेदभाव
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Shipley, M. M., Mangold, C. A.,… More

Shipley, M. M., Mangold, C. A., Szpara, M. L. Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line. J. Vis. Exp. (108), e53193, doi:10.3791/53193 (2016).

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