Abstract
Vigilância de vírus da gripe A em suínos é fundamental para a saúde humana e animal, porque o vírus influenza A evolui rapidamente em populações de suínos e novas estirpes estão surgindo continuamente. Suínos são capazes de ser infectado por diversas linhagens do vírus influenza A, tornando-os anfitriões importantes para o surgimento e manutenção da nova gripe A estirpes de vírus. Amostragem suínos em diversas configurações, como granjas comerciais de suínos, feiras e mercados agrícolas, de animais vivos é importante para fornecer uma visão abrangente das cepas que circulam atualmente IAV. O ante-mortem técnica de amostragem padrão-ouro atual (ou seja, coleta de swab nasal) é trabalhoso porque exige contenção física dos porcos. Toalhetes nasais envolvem esfregando um pedaço de tecido em todo o focinho do porco com o mínimo de retenção do animal. A nasal limpe procedimento é simples de executar e não requer pessoal com formação profissional ou veterinária manipulação animal. While ligeiramente menos sensível do que swab nasal, as taxas de detecção e isolamento do vírus são suficientes para fazer nasal limpa uma alternativa viável para a amostragem de suínos individuais quando são necessários métodos de amostragem de baixa tensão. O protocolo de processo descreve as etapas necessárias para coletar uma nasal viável limpe a partir de um porco individual.
Introduction
Os vírus influenza A (IAV) causam doenças respiratórias em muitas espécies, incluindo aves domésticas, suínos e seres humanos. Devido ao rearranjo da evolução viral rápida segmentado genoma IAV pode ocorrer e novas cepas IAV frequentemente surgem. Suína são uma espécie que pode servir como um recipiente de mistura para rearranjo de iAVS a partir de múltiplas espécies hospedeiras. 1 Atualmente, existem três principais subtipos de IAV normalmente circulam entre os porcos da América do Norte (H1N1, H1N2, H3N2), mas várias introduções IAV de seres humanos têm levou a extensa diversidade IAV dentro desses subtipos. 2 evolução rápida da iAVS infectam suínos tem sido evidente desde 1998, quando um recombinante triplo IAV contendo segmentos de genes de vírus humanos, aviários e suínos 3 tornou-se difundido entre os porcos nos Estados Unidos. 4 O gene interno segmentos de que IAV recombinado triplo permanecem altamente prevalente entre iAVS atualmente infectando porcos. 5
"> Em todo o mundo, IAV é uma importante causa de doenças respiratórias em suínos em que os sinais clínicos típicos incluem febre, anorexia, letargia, tosse, dificuldade para respirar, espirros, corrimento nasal e pouco ganho de peso. IAV pode ser particularmente caro para semear fazendas onde reprodutiva falha devido a febre IAV induzida e leitões fracos-nascido foram documentados 6,7. Nos Estados Unidos, IAV é comumente detectada em rebanhos suínos comerciais e extensa diversidade antigênica e genômica e evolução contínua entre IAV suína infectar tem dificultado o controle deste vírus 8-11.Preocupações de saúde pública sobre a emergência de uma estirpe IAV pandemia resultante do rearranjo em suínos foram realizados em 2009, quando um IAV suína-linhagem contendo segmentos de genes da linhagem suína norte-americana triple-reassortant e da linhagem suína aviária do tipo Eurasian causou uma pandemia mundial em humanos 12. A pandemia do vírus (A (H1N1) pdm09), desde então,rearranjado com suínos endêmica IAV estirpes 13,14 e algumas destas estirpes recentemente rearranjado foram transmitidos de volta para os seres humanos. 15 A freqüência de eventos de rearranjo e surgimento de novas cepas IAV com potencial pandêmico faz a vigilância ativa de vírus circulando IAV em suínos imperativo, especialmente na interface suína-humano.
A interface suína-humano é importante para a transmissão bi-direcional interespécies do IAV. Humano-a-suína transmissão que ocorrem na produção suína comercial é responsável por uma grande quantidade de diversidade IAV actualmente presente na população de porcos. Feiras agrícolas são os maiores configurações para o comingling de pessoas e suína nos Estados Unidos e são locais para a transmissão zoonótica do IAV 15-21. Em 2012 conhecido, durante o surto de uma variante H3N2 IAV, 93% dos casos relatados no atendimento uma feira agrícola nos dias 15 Análise Genômica antes do início da doença.dos isolados virais de suínos de exposição em comparação com isolados humanos confirmaram transmissão zoonótica. suína 21 Exposição infectado com IAV muitas vezes não mostram sinais clínicos da doença, 21-23, indicando a necessidade de testes de diagnóstico diretos.
Amostragem de suínos visivelmente doente por si só não irá identificar com sucesso prevalência IAV em suínos e não pode ser invocado para identificar novas cepas de IAV emergentes entre suína. A vigilância ativa é absolutamente necessário para a detecção de estirpes emergentes da IAV nos suínos e para avaliar sua ameaça tanto para suínos e de saúde pública. A maioria das actividades de fiscalização do IAV são voluntárias e, portanto, são necessários métodos minimamente perturbadoras. Os três principais procedimentos de coleta de amostra ante-mortem para IAV infectar suínos são: swab nasal, fluidos orais e nasais toalhetes. As actuais recomendações para a amostragem suína indivíduo para detectar a inserção lista IAV-de fibra sintética com ponta cotonetes nas narinas como o método preferidopara recolher secreções nasais e células epiteliais. 24,25 Porque os porcos podem tentar evitar este procedimento, uma equipe de pessoal treinado deve conter suínos manualmente ou com um laço, dependendo do tamanho do animal. 26 O processo de contenção é trabalhoso para o pessoal e estressante para os porcos. Além disso, exposição suína estão freqüentemente envolvidos em várias competições em uma feira de modo a percepção de stress em um animal de competição pode fazer proprietários resistente aos esforços de vigilância.
Com probabilidades de detecção IAV que variam de 80-100% em IAV rebanhos infectados, fluidos orais tornaram-se uma alternativa popular para nasal swabs para a detecção molecular do IAV em populações de suínos. 27,28 Além disso, líquidos orais podem fornecer uma janela mais ampla de IAV detecção de swab nasal após a infecção inicial. No entanto, IAV isolamento a partir de fluidos orais tem sido problemática com apenas 50% das tentativas de isolamento de vírus, resultando em IAV recuperação. 29
Usando toalhetes nasais em vez de swab nasal durante a vigilância IAV em suínos supera as limitações descritas acima. Toalhetes nasais não requerem o uso de uma armadilha de restrição e pode ser realizada sem perturbar os animais testemunhas ou do procedimento. Treinamento técnico mínimo é necessário para coletar limpezas nasais, que permite que os profissionais não-veterinários, incluindo os proprietários de suínos, para recolher as amostras de vigilância. Toalhetes nasais foram comparadas anteriormente para esfregaços nasais para a detecção e isolamento de vírus influenza A e 30 do protocolo detalhado para este método não-invasivo de amostragem é descrito abaixo.
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Protocol
Todos os suínos utilizados na coleta dos seguintes dados estavam protegidos sob O Comitê Animal Care Institucional e Use Ohio State University (uso de animais protocolo número 2009A0134-R1).
1. Preparação de Transporte Viral Médio e Coleta de Amostras Vials
- Adicionar 37 g de Brain Heart Infusion a 900 ml de água purificada e misturar cuidadosamente com uma vareta de agitação e um agitador magnético, enquanto se aquece a 70 ° C para dissolver completamente o pó.
- Autoclave o caldo a 121 ° C durante 15 min. Legal na bancada até que o caldo atingir a temperatura ambiente. Refrigerar a 4 ° C durante a noite se necessário.
- Dissolve-se, por mistura com uma vareta de agitação magnética, 6,02 g de sal de sódio da penicilina G e 10 g de sulfato de estreptomicina em 50 ml de água purificada, à temperatura ambiente. Adiciona-se água purificada adicional para levar o volume total a 100 ml. Filtrar a solução através de uma membrana de polietersulfona de 0,22 um para um frasco estéril.
- Adicionar assepticamente a penicilina filtrada e estreptomicina solução para o resfriado Brain Heart Infusion caldo e misture bem (barra de agitação ou redemoinho frasco à mão) para fazer o meio de transporte viral.
- Assepticamente testar o pH do meio de transporte viral; se necessário, ajustar o pH para 7,4 ± 0,2 com HCl ou NaOH.
- Realizar testes de controlo de qualidade sobre o meio de transporte viral por meio de testes para influenza A proteína da matriz do vírus por TRr-PCR, tal como descrito por Zhang e Harmon. 22
- Dispensar 5 ml do meio de transporte viral em frascos de polietileno de alta densidade estéreis com a capacidade de 8 ml. Rotular os tubos de ensaio para utilização no campo.
- Armazenar os frascos prontos para uso em caixas padrão crio a -20 ° C até a coleta de amostras.
2. Recolha de Nasal Wipes de suínos
- Descongele o número apropriado de frascos imediatamente antes da coleta da amostra; será necessário um frasco para injectáveis por suíno amostrados. Descongelamento na salatemperatura leva aproximadamente 30-45 min. Manter os tubos descongelados arrefecer em blocos de gelo até o uso.
- Don equipamento de proteção individual como ditadas pela situação (por exemplo, fato-macaco, capas para botas, máscara, protetor auricular, etc.).
- Entre na área de animal. Se necessário, limitar o porco a uma pequena área mas não conter. Não despertar descansando animais.
- Coloque em um par de luvas de exame descartáveis. Tome cuidado para não contaminar as luvas por porcos tocando, pessoas ou objetos inanimados.
- Use uma mão enluvada para remover um estéreis 5,08 cm x 5,08 cm (2 pol. X 2 pol.) Gaze de algodão de sua embalagem. Compressas de gaze estéreis deve ser usada sempre que possível. Compressas de gaze embrulhados individualmente são mais convenientes de usar do que aqueles envolvidos com duas almofadas de gaze por pacote.
- Segure a gaze de algodão com as pontas dos dedos de uma mão expor tanto da almofada possível para amostragem.
- Limpe a gaze em todo o focinho do porco, tendocuidado extra para entrar nas narinas externas, se possível. Recolhe secreções nasais visíveis (aproximadamente 1 ml) com a mesma almofada de gaze.
- Usando o mesmo lado, dobre a compressa de gaze sobre si mesmo para facilitar a colocação no frasco contendo meio de transporte viral.
- Utilizando outro lado, remover a tampa do frasco e colocar a almofada de gaze dobrada para dentro do frasco. Recapitular o frasco e agite o frasco para garantir a mistura do compressa de gaze e meio de transporte viral.
- Retire as luvas e coloque em um recipiente apropriado. Mudar de luvas entre cada porco.
- Verificar o identificador do frasco. Número recorde de identificação porco, idade, sexo, sinais clínicos, e outras notas consideradas necessárias ao investigador.
- Refrigere as amostras imediatamente após a coleta. Considere fazer alíquotas da amostra antes de congelar para evitar múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento. Tão rapidamente quanto possível após a colheita, colocar as amostras em gelo seco durante o transporte para o laboratório. Armazenar os tubos a -80° C até que o teste é iniciado.
3. Detecção do vírus influenza A Ácido Nucleico
- Descongelar as amostras num banho de grânulo seco 37 ° C durante 5 min e em seguida terminar o descongelamento das amostras no cimo da bancada à temperatura ambiente durante 20-30 min. A adição simultânea de vários frascos para os grânulos irá fazer com que o banho ao calor; recomenda-se precaução, para não superaquecer os frascos.
- Retirar 100 ml de meio de transporte viral para extração de RNA.
- Usar um de alto rendimento (96 formato de placa de poço) plataforma esférulas magnéticas para a extracção de ARN a partir de um grande número de amostras. 31
- Use em tempo real PCR transcriptase reversa para a influenza A detecção rápida do vírus. 31
4. O isolamento do vírus influenza A partir nasais Wipes
- Descongelar as amostras tal como descrito acima na Secção 3.1
- Trate amostras descongeladas com sulfato de gentamicina (1000ug / ml), anfotericina B (22,5 ug / ml), e sulfato de canamicina (325 ng / mL).
- Inocular em Madin-Darby de rim canino (MDCK) células epiteliais como descrito anteriormente. 32
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Representative Results
A utilização bem sucedida deste método produz TRr-PCR resulta que, acompanhada com a utilização de um controlo interno durante a extracção de ARN e TRr-PCR, mostram amostras não contêm inibidores de PCR a partir de quaisquer detritos apanhados ambiente durante a amostragem. Após a inoculação de exemplo, os poços de isolamento de vírus deve ser livre de detritos ambientais visível a partir da amostra. Há um consenso razoável entre os resultados rRT-PCR e os resultados de isolamento de vírus com o entendimento de que a PCR muitas vezes produz uma taxa positiva mais elevada do que IAV isolamento do vírus porque PCR detecta ácido nucleico viral, vírus não necessariamente viável.
Os resultados mostram que toalhetes nasais são uma alternativa útil para nasal swabs, que são a técnica de amostragem atual padrão ouro para IAV. Edwards et al. Realizada uma comparação de toalhetes focinho e swab nasal que foram coletadas a partir de suínos em feiras agrícolas nos Estados Unidos durante 2013. Nesse estudo, os porcos foram amostradas com tanto nasalesfregaços nasais e os toalhetes e as amostras foram testadas em paralelo com TRr-PCR e isolamento do vírus. Edwards et al. relataram a concordância tanto para a detecção e isolamento de IAV por TRr-PCR e isolamento do vírus em cultura de células foi demonstrada pela comparação da secreção nasal emparelhado 553 e nasal limpar amostras. Destas 30 amostras testadas, 93,5% (517/553) dos resultados do teste de PCR-TRr estavam em concordância (Tabela 1) e 92,4% (511/553) estavam de acordo com o isolamento do vírus em células MDCK (Tabela 2). 21 A sensibilidade estimada TRr-PCR para toalhetes nasais em comparação com esfregaços nasais era 92,9% ea sensibilidade isolamento IAV estimado para limpezas nasais em comparação com swab nasal foi de 82,9%. Edwards et ai., Previamente notado que toalhetes nasais que eram positivos tanto por TRr-PCR e isolamento do vírus em média um valor inferior Ct (24,32) de toalhetes nasais que eram positivas por PCR-TRr mas negativa para isolamento do vírus (Ct = 31,96). 21
Tabela 1: detecção rRT-PCR do vírus influenza A em esfregaços nasais e lenços focinho coletadas de suínos em 29 feiras (a partir de Edwards et al (2014) Utilitário de focinho limpe amostras de influenza A vigilância do vírus em populações de suínos de exposições Influenza e.. Outros Vírus Respiratórios 8 (5), 574-579.
Tabela 2: Isolamento do vírus influenza A em esfregaços nasais e lenços focinho coletadas de suínos em 29 feiras (a partir de Edwards et al (2014) Utilitário de focinho limpe amostras de influenza A vigilância do vírus em populações de suínos de exposições Influenza e outros vírus respiratórios.. 8 (5), 574-579.)
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Discussion
Coleta de amostras de suínos utilizando swab nasal com ponta de poliéster tem se mostrado útil para conduzir a vigilância IAV; no entanto, a utilização do procedimento de swab nasal dificulta os esforços de vigilância devido ao uso obrigatório de um laço à contenção. Toalhetes nasais representam um refinamento de técnicas de amostragem suína atuais para minimizar o estresse sobre as pessoas e suínos durante a coleta de amostra. Enquanto o método tem sido desenvolvido e validado para exposição em ambientes de suínos, ele pode ser facilmente aplicado a outras situações em que é necessária a detecção ante mortem de IAV em suínos (isto é, suína comercial, mercados de animais vivos, a investigação biomédica, etc.)
Como observado acima, o principal responsável por esta técnica de amostragem foi a população exposição suína. Durante as feiras agrícolas, proprietários de suínos competir para ganhar prêmios em dinheiro e notoriedade com base na composição total do porco. A evidência anedótica indica que, se um porco não mostra bem, owners pode atribuí-la a nível de estresse do porco durante a contenção e coleta da amostra. Toalhetes nasais são úteis para os esforços de vigilância que envolvam animais individuais de amostragem em ambientes que requerem baixo estresse animal. A capacidade de evitar snaring e porcos visivelmente angustiantes durante a realização da nasal limpe técnica melhorou a aceitação pública dos esforços de vigilância IAV em exposição suína. 33 A natureza de baixo estresse do nasal limpe método também o torna adequado para granjas comerciais. Além disso, o nasal limpe método pode ajudar a reduzir custos, pois requer menos pessoal e não exige formação especializada.
Além nasal swabs, outra forma comumente utilizada de detecção de patógenos em suínos comercial envolve permitindo que os porcos que estão alojados em conjunto para mastigar em uma corda de algodão que foi colocado em sua pena. Depositam fluidos orais que podem ser coletados a partir da corda. 27,34,35 Oral coleção produ fluidoces resultados que são baseados em amostras coletadas de um grupo de animais e tem limitações para estudos de prevalência ou de transmissão do patógeno. Além disso, IAV isolamento a partir de fluidos orais tem sido fraca. 29 fluidos orais, têm sido utilizados para suínos individual, mas o tempo necessário para travar os cabos e para os porcos para saturar as cordas podem ser ineficientes para recursos de pessoal. 36 Utilizando toalhetes nasal permite a avaliação rápida de animais individuais. A capacidade de detectar e isolar IAV de toalhetes nasais fornece uma vantagem distinta sobre fluidos orais. Como outros métodos de amostragem, toalhetes nasais pode ser mais eficaz durante a excreção viral pico.
Existem algumas limitações associadas com o nasal wipe método que deve ser considerado antes de implementar o procedimento. Os porcos são animais curiosos que Raiz com seus focinhos. Muitas vezes, há mais detritos recolhidos num limpe nasal, em comparação com esfregaços nasais, por causa do ambiente húmido, sujoa limpar os contatos no exterior do focinho de porco. O contacto entre o substrato e nasal limpar o porco é restrita a uma superfície mais externa do tracto respiratório de esfregaços nasais, uma situação que muitas vezes resulta na deposição de detritos não intencional do ambiente (isto é, roupa de cama, alimentos para animais, etc.) na nasal toalhetes. Estes contaminantes ambientais podem causar ou inibir a PCR toxicidade celular durante as tentativas de isolamento viral. A limpeza do local de amostragem e os níveis de detritos ambientais podem precisar de ser avaliada antes de prosseguir com nasal limpe protocolos. A ocorrência de contaminação do ambiente de toalhetes nasais também significa que IAV detectado com este método não podem ter sido derramado pelo animal testado, mas estava presente no meio ambiente. Embora a capacidade de atribuir um IAV isolar a um animal particular pode não ser uma preocupação para as actividades de vigilância ou diagnósticos com base rebanho, esta pode ser uma limitação a considerar para laboratório baseado trestudos ansmission.
Outra questão que tem de ser resolvida antes de escolher este método é o maior espaço de armazenamento e transporte que grandes números de amostras nasal limpe vai exigir. Os frascos utilizados para limpezas são muito maiores do que os frascos de armazenamento de 2 ml criogênicos utilizados como padrão para armazenamento de swab nasal e vai demorar cerca de três a quatro vezes mais espaço no freezer para armazenamento de longo prazo e espaço mais frio para o transporte de volta para o laboratório. Armazenar amostras por longos períodos de tempo à temperatura ambiente, sob refrigeração ou congelamento-descongelamento das amostras será resultam em uma diminuição da viabilidade do vírus. Cuidado extra deve ser tomado quando descongelar essas amostras. Porque a gaze absorve grande parte do meio de transporte viral, amostras irá superaquecer rapidamente em um banho de talão seco. Inadvertidamente o sobreaquecimento das amostras durante o processo de descongelação, também pode resultar numa diminuição da viabilidade do vírus. Além disso, devido à diminuição da recuperação IAV in vitro a partir de toalhetes compared de esfregaços, é recomendado que não nasal toalhetes ser utilizada em situações que requerem elevada sensibilidade para a recuperação de vírus viáveis. 30
O uso bem sucedido da vigilância IAV em suínos pela nasal limpe método pode resultar em uma maior facilidade de amostragem, maior aceitação dos esforços de vigilância, e menos stress nos animais. No futuro, pode ser útil para a amostragem de suínos a partir da entrada a uma feira ou para o teste de baixa tensão de suínos individuais em rebanhos suínos comerciais. Este método poderia ser investigado para utilização detecção de outros patogénios respiratórios em suínos. Porque suína desempenham um papel fundamental no surgimento de cepas IAV novos, continuou vigilância ativa para IAV em suínos é crítica. Como tal, este método pode auxiliar na detecção e investigação epidemiológica de estirpes emergentes de novos IAVS.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BBL Brain Heart Infusion | Becton, Dickinson and Company | 211059 | |
| Penicillin G Sodium Salt | MP Biomedicals, LLC | 021194537 | 1500 u/mg |
| Streptomycin Sulfate | AMRESCO LLC | 0382 | |
| Gentamicin Solution | Mediatech, Inc. | 30-005-CR | 50 mg/ml |
| Amphotericin B Solution | Fisher | S 24 25 | 250 ug/ml |
| Kanamycin Sulfate | Teknova | K2105 | 5000 ug/ml |
| TPP Rapid Filtermax System | TPP Techno Plastic Products AG | 99150 | |
| Nalgen Diagnostic Bottles | Thermo Scientific | 342002-9025 | HDPE with white PP closure |
| Dermacea Gauze Sponge, 8 ply | Covidien | 441211 | 5.08 cm × 5.08 cm (2 in. × 2 in) |
| Nitrile Exam Gloves | Saftey Choice | 19-170-010 (A-D) |
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