Abstract
La vigilancia de los virus de la gripe A en cerdos es fundamental para la salud humana y animal debido a la influenza A virus evoluciona rápidamente en poblaciones porcinas y las nuevas cepas están surgiendo continuamente. Los cerdos son capaces de ser infectados por diversos linajes del virus de la gripe A haciéndolos anfitriones importantes para la aparición y el mantenimiento de la nueva influenza A cepas del virus. Muestreo cerdos en diversos entornos, como las granjas comerciales de cerdos, ferias agrícolas y mercados de animales vivos es importante proporcionar una visión completa de las cepas circulantes de IAV. La técnica actual estándar de oro ante mortem de muestreo (es decir, colección de hisopos nasales) es mano de obra intensiva, ya que requiere la restricción física de los cerdos. Toallitas nasales implican frotar un trozo de tela a través del hocico del cerdo con mínima o ninguna restricción del animal. La nasal limpie procedimiento es sencillo de realizar y no requiere personal con veterinaria profesional o capacitación manejo de animales. While ligeramente menos sensible que hisopos nasales, las tasas de detección de virus y de aislamiento son adecuados para hacer nasal limpia una alternativa viable para el muestreo de los cerdos individuales cuando se requieren métodos de muestreo de baja tensión. El protocolo de procedimiento describe los pasos necesarios para cobrar una nasal viable limpie de un cerdo individual.
Introduction
Los virus de influenza A (IAV) causan enfermedades respiratorias en muchas especies, incluyendo aves domésticas, cerdos y seres humanos. Debido al reordenamiento del genoma segmentado IAV rápida evolución viral puede ocurrir y nuevas cepas IAV surgir con frecuencia. Cerdos son una especie que puede servir como un recipiente de mezcla para la redistribución de los virus de este tipo a partir de múltiples especies huésped. 1 Actualmente hay tres subtipos principales de IAV comúnmente circulan entre los cerdos de América del Norte (H1N1, H1N2, H3N2), pero múltiples introducciones IAV de los seres humanos tienen llevó a una extensa diversidad IAV dentro de esos subtipos. 2 La rápida evolución de virus de este tipo que infectan cerdos ha sido evidente desde 1998 cuando un triple recombinante IAV que contiene segmentos de genes de virus humanos, aviares y porcinos 3 se generalizó entre los cerdos en los Estados Unidos. 4 El gen interno segmentos de esa IAV triple recombinante siguen siendo muy frecuente entre los virus de este tipo actualmente infectan a los cerdos. 5
"> A nivel mundial, IAV es una causa importante de enfermedad respiratoria en cerdos en la que los signos clínicos típicos incluyen fiebre, anorexia, letargo, tos, dificultad para respirar, estornudos, secreción nasal y poco aumento de peso. IAV puede ser particularmente costosa para sembrar fincas donde reproductiva fracaso debido a la fiebre inducida IAV y lechones débiles nacido se han documentado. 6,7 Dentro de los Estados Unidos, IAV se detecta comúnmente en piaras comerciales y la amplia diversidad antigénica y genómica y la evolución continua entre IAV porcina infectar ha dificultado el control de este virus 8-11.Problemas de salud pública acerca de la aparición de una cepa IAV pandemia resultante de reordenamiento en el cerdo se dio cuenta en 2009 cuando una IAV porcina linaje que contiene segmentos de genes del linaje porcina norteamericana-triple recombinante y el linaje porcina aviar-como Eurasia causó una pandemia mundial en los seres humanos. 12 El virus pandémico (A (H1N1) pdm09) tiene desderedistribución génica con porcina endémica IAV cepas 13,14 y algunas de estas cepas recién reordenadas se han transmitido de nuevo a los seres humanos. 15 La frecuencia de eventos de reordenamiento y la aparición de nuevas cepas IAV con potencial pandémico hace que la vigilancia activa de los virus circulantes IAV en cerdos imprescindible, sobre todo en la interfase porcina humano.
La interfaz porcina humana es importante para interespecies bidireccional transmisión de IAV. De humano a los cerdos de transmisión que ocurre en la producción porcina comercial es responsable de una gran cantidad de IAV diversidad actualmente presente en la población porcina. Ferias agrícolas son los parámetros más importantes para el comingling de las personas y los cerdos en los Estados Unidos y son conocidos sitios para la transmisión zoonótica de IAV. 15-21 En 2012, durante el brote de una variante H3N2 IAV, el 93% de los casos reportados asistencia a una feria agrícola en los días antes de la aparición de la enfermedad. 15 Análisis genómicode los aislamientos virales de cerdos de exhibición frente a las cepas humanas confirmado la transmisión zoonótica. porcina 21 Exposición infectado con IAV menudo no muestran signos clínicos de la enfermedad, 21-23 que indican la necesidad de pruebas diagnósticas directas.
El muestreo de los cerdos visiblemente enfermos por sí sola no identificar con éxito prevalencia IAV en los cerdos y no puede ser invocada para identificar nuevas cepas de IAV emergentes entre los cerdos. La vigilancia activa es absolutamente necesario para la detección de cepas emergentes de IAV en cerdos y para evaluar su amenaza tanto para los cerdos y la salud pública. La mayoría de las actividades de vigilancia IAV son voluntarios y por lo tanto se necesitan métodos mínimamente perturbadores. Los tres principales procedimientos de recogida de muestras ante mortem para IAV infectar cerdos son: hisopos nasales, fluidos orales, nasales y toallitas. Las recomendaciones actuales para el muestreo de los cerdos individuales para detectar lista IAV la inserción de fibra sintética con punta de hisopos en las fosas nasales como el método preferidopara recoger las secreciones nasales y células epiteliales. 24,25 Debido a que los cerdos pueden tratar de evitar este procedimiento, un equipo de personal capacitado debe contener cerdos ya sea manualmente o con una trampa en función del tamaño del animal. 26 El proceso de retención es laboriosa para el personal y estresante para los cerdos. Además, porcina exposiciones suelen participar en varias competiciones en una feria por lo que la percepción de estrés añadido en un animal de la competencia puede hacer que los propietarios resistente a los esfuerzos de vigilancia.
Con probabilidades de detección IAV que van desde 80-100% en IAV rebaños infectados, fluidos orales se han convertido en una alternativa popular a hisopos nasales para la detección molecular de IAV en las poblaciones de la especie porcina. 27,28 Además, los fluidos orales pueden proporcionar una ventana más amplia de detección IAV de hisopos nasales después de la infección inicial. Sin embargo, el aislamiento a partir de fluidos orales IAV ha sido problemático con sólo el 50% de los intentos de aislamiento del virus resultante en IAV recuperación. 29
El uso de toallitas nasales en lugar de hisopos nasales durante la vigilancia IAV en cerdos supera las limitaciones descritas anteriormente. Toallitas nasales no requieren el uso de una trampa de restricción y se puede realizar sin hacer hincapié en los animales o los testigos del procedimiento. Es necesaria una formación técnica mínima para recoger trapos nasales, lo que permite a los profesionales no veterinarios, incluidos los propietarios de cerdos, para recoger las muestras de vigilancia. Toallitas nasales fueron previamente en comparación con hisopos nasales para la detección y el aislamiento de virus de influenza A 30 y el protocolo detallado para este método no invasivo de muestreo se describe a continuación.
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Protocol
Todos los cerdos utilizados en la recogida de los siguientes datos estaban protegidos bajo el Comité de Animales Institucional de Cuidado y Uso Universidad Estatal de Ohio (uso de animales número de protocolo 2009A0134-R1).
1. Preparación de Viral Medio de Transporte y Recogida de muestras Viales
- Añadir 37 g de Brain Heart Infusion a 900 ml de agua purificada y mezclar bien con una barra de agitación y un agitador magnético mientras se calienta a 70 ° C para disolver completamente el polvo.
- Autoclave el caldo a 121 ° C durante 15 min. Dejar enfriar en la mesa de trabajo hasta que el caldo alcanza la temperatura ambiente. Refrigerar a 4 ° C durante la noche si es necesario.
- Disolver, mediante la mezcla con una barra de agitación magnética, 6,02 g de sal sódica de penicilina G y 10 g de sulfato de estreptomicina en 50 ml de agua purificada a temperatura ambiente. Añadir agua purificada adicional para llevar el volumen total a 100 ml. Filtrar la solución a través de una membrana de polietersulfona 0,22 m en un frasco estéril.
- Agregar asépticamente la solución de penicilina y estreptomicina filtrada en el enfriado caldo de infusión de cerebro y corazón y mezclar bien (barra de agitación o remolino matraz a mano) para hacer que el medio de transporte viral.
- Asépticamente probar el pH del medio de transporte viral; si es necesario, ajustar el pH a 7,4 ± 0,2 utilizando HCl o NaOH.
- Realizar pruebas de control de calidad sobre el medio de transporte viral mediante pruebas de influenza A virus proteína de la matriz por RT-PCR, como se describe por Zhang y Harmon. 22
- Dispense 5 ml del medio de transporte viral en botellas de polietileno de alta densidad estériles con capacidad de 8 ml. Etiquetar los viales para su uso en el campo.
- Guarde los viales listos para su uso en la crio-cajas estándar a -20 ° C hasta el momento de recogida de muestras.
2. Recolección de Nasal Wipes desde porcina
- Descongele el número adecuado de viales inmediatamente anteriores a la recogida de muestras; Se necesitará un vial por cerdo muestreado. Deshielo en la sala detemperatura tarda aproximadamente 30-45 min. Mantener los viales descongelados fresco en bolsas de hielo hasta su uso.
- Don equipo de protección personal adecuado como dictados por la situación (por ejemplo, overoles, cubrebotas, respiradores, tapones para los oídos, etc.).
- Entrar en el área de los animales. Si es necesario, limitar el cerdo a un área pequeña pero sin frenar. No despertar descansando animales.
- Póngase un par de guantes de examen desechables. Tenga cuidado de no contaminar los guantes por los cerdos que tocan, personas u objetos inanimados.
- Utilice una mano enguantada para eliminar unas estériles de 5,08 cm x 5,08 cm (2 pulg. X 2 pulg.) De gasa de algodón de su envoltorio. Gasas estériles deben utilizarse siempre que sea posible. Almohadillas de gasa individualmente envueltos son más convenientes de utilizar que aquellos envuelto con dos almohadillas de gasa por paquete.
- Sostenga la almohadilla de gasa de algodón con las yemas de los dedos de una mano la exposición tanto de la almohadilla como sea posible para el muestreo.
- Limpie la almohadilla de gasa a través de hocico de cerdo, teniendoun cuidado especial para entrar en los orificios nasales externos si es posible. Recoger las secreciones nasales visibles (aproximadamente 1 ml) con la misma gasa.
- Utilizando la misma mano, doblar la almohadilla de gasa sobre sí misma para facilitar la colocación en el vial que contiene el medio de transporte viral.
- Utilizando el otro lado, quitar el tapón del vial y colocar la almohadilla de gasa plegada en el vial. Volver a tapar el vial y agitar el vial para asegurar el mezclado de la almohadilla de gasa y medio de transporte viral.
- Quítese los guantes y colóquelos en un recipiente apropiado. Cambie los guantes entre cada cerdo.
- Compruebe el identificador de vial. Número de registro de identificación de cerdos, la edad, el sexo, los signos clínicos, y otras notas que se consideren necesarias por el investigador.
- Enfríe las muestras inmediatamente después de la recolección. Considere hacer alícuotas de la muestra antes de la congelación para evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación. Tan pronto como sea posible después de la recolección, colocar las muestras en hielo seco para el transporte al laboratorio. Guarde los viales a -80° C hasta que se inicia la prueba.
3. Detección del Virus de la Influenza Nucleic Acid
- Descongele las muestras en un baño de grano seco de 37 ° C durante 5 minutos y luego terminar la descongelación de las muestras en la mesa de trabajo a temperatura ambiente durante 20 a 30 min. La adición simultánea de varios viales a las perlas hará que el baño para calentar; se debe tener precaución para no sobrecalentarse los viales.
- Quite 100 l de medio de transporte viral para la extracción de RNA.
- Use un alto rendimiento (formato de placa de 96) plataforma de perla magnética para la extracción de ARN a partir de un gran número de muestras. 31
- Utilice ensayos de PCR transcriptasa inversa en tiempo real para la detección rápida de la influenza A virus. 31
4. Aislamiento de Virus de la Influenza de nasales Wipes
- Descongelar las muestras como se ha descrito anteriormente en la Sección 3.1
- Tratar muestras descongeladas con sulfato de gentamicina (1000g / ml), anfotericina B (22,5 g / ml), y sulfato de kanamicina (325 mg / ml).
- Inocular en Madin-Darby de riñón canino (MDCK) las células epiteliales como se describió anteriormente. 32
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Representative Results
El uso exitoso de este método produce RT-PCR resulta que, acompañado con el uso de un control interno durante la extracción de RNA y RT-PCR, se muestran muestras no contenían inhibidores de PCR de cualquier residuo ambiental recogió durante el muestreo. Después de la inoculación de la muestra, los pozos de aislamiento del virus deben estar libres de escombros ambiental visible de la muestra. Existe un acuerdo razonable entre los resultados de RT-PCR y los resultados de aislamiento de virus con el entendimiento de que la PCR a menudo produce una mayor tasa positiva IAV que el aislamiento de virus porque PCR detecta ácido nucleico viral, no necesariamente virus viable.
Los resultados muestran que las toallitas nasales son una alternativa útil a los hisopos nasales, que son la técnica de muestreo estándar de oro actual de IAV. Edwards et al. Realizó una comparación de toallitas hocico y los hisopos nasales que fueron recogidas de cerdos en las ferias agrícolas en los Estados Unidos durante el año 2013. En ese estudio, los cerdos se muestrearon con tanto nasalhisopos nasales y toallitas húmedas y las muestras se prueba en paralelo con RT-PCR y el aislamiento del virus. Edwards et al. informó la concordancia, tanto para la detección y aislamiento de IAV por RT-PCR y aislamiento del virus en cultivos celulares se demostró mediante la comparación del 553 hisopo nasal emparejado y nasal limpie muestras. 30 De estas muestras analizadas, el 93,5% (517/553) de resultados de ensayos de RT-PCR estaban de acuerdo (Tabla 1) y 92,4% (511/553) estaban de acuerdo utilizando el aislamiento del virus en las células MDCK (tabla 2). 21 La sensibilidad RT-PCR estimado para toallitas nasales en comparación con hisopos nasales estaba 92,9% y el estimado IAV sensibilidad de aislamiento para toallitas nasales en comparación con hisopos nasales fue 82,9%. Edwards et al., Anteriormente observó que las toallitas nasales que fueron positivas tanto por RT-PCR y el aislamiento del virus en promedio un valor inferior Ct (24,32) que las toallitas nasales que fueron positivas por RT-PCR, pero negativos para el aislamiento del virus (Ct = 31,96). 21
Tabla 1: detección de RT-PCR del virus de influenza A partir de hisopos nasales y toallitas hocico recogidas de cerdos en 29 ferias del condado (de Edwards et al (2014) Utilidad del hocico toallita muestras para la influenza A de vigilancia del virus en las poblaciones de cerdos de exhibición de la influenza y.. Otros virus respiratorios 8 (5), 574-579.
Tabla 2: Aislamiento del virus de influenza A partir de hisopos nasales y toallitas hocico recogidas de cerdos en 29 ferias del condado (de Edwards et al (2014) Utilidad del hocico limpie muestras para la influenza A de vigilancia del virus en las poblaciones de cerdos de exhibición de la influenza y otros virus respiratorios.. 8 (5), 574 a 579).
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Discussion
La recolección de muestras de cerdos utilizando hisopos nasales de poliéster con punta ha demostrado ser útil en la realización de la vigilancia IAV; Sin embargo, el uso del procedimiento de hisopo nasal dificulta los esfuerzos de vigilancia debido al uso requerido de un lazo a la moderación. Toallitas nasales representan un refinamiento de las técnicas de muestreo porcina actuales para minimizar el estrés en las personas y cerdos durante la recogida de muestras. Mientras que el método ha sido desarrollado y validado para cerdos en entornos exposición, se puede aplicar fácilmente a otras situaciones en las que es necesaria la detección ante-mortem de IAV en los cerdos (es decir, porcina comercial, mercados de animales vivos, la investigación biomédica, etc.)
Como se señaló anteriormente, el principal motor de esta técnica de muestreo ha sido la población porcina exposición. Durante las ferias agrícolas, propietarios de cerdos compiten para ganar premios financieros y notoriedad basado en la composición general del cerdo. La evidencia anecdótica indica que si un cerdo no muestra bien, orespectiv os dueños pueden atribuirlo a nivel de estrés de los cerdos durante la moderación y la recogida de muestras. Toallitas nasales son útiles para los esfuerzos de vigilancia que involucran animales individuales de muestreo en entornos que requieren baja tensión animal. La capacidad de evitar atrapar y cerdos visiblemente angustiantes mientras se realiza la nasal limpie técnica ha mejorado la aceptación pública de los esfuerzos de vigilancia IAV en cerdos de exhibición. 33 La naturaleza de bajo estrés del nasal limpie método también hace que sea muy adecuado para las granjas porcinas comerciales. Además, el nasal limpie método puede ayudar a reducir los costos, ya que requiere menos personal y no obliga a la formación especializada.
Además de hisopos nasales, otra forma de uso general de la detección de patógenos en cerdos comercial consiste en permitir que los cerdos que se alojan juntos para masticar en una cuerda de algodón que se ha colocado en su pluma. Depositan fluidos orales que se pueden recoger de la cuerda. 27,34,35 Oral produ acumulación de líquidoresultados ces que están basados en las muestras obtenidas de un grupo de animales y tiene limitaciones para la prevalencia de patógenos de transmisión o estudios. Además, el aislamiento IAV a partir de fluidos orales ha sido pobre. 29 Los fluidos orales se han utilizado durante porcina individual, pero el tiempo requerido para colgar las cuerdas y para los cerdos a saturar las cuerdas puede ser ineficiente de los recursos de personal. 36 El uso de toallitas nasales permite la evaluación rápida de animales individuales. La capacidad de detectar y aislar tanto IAV de toallitas nasales ofrece una clara ventaja sobre los fluidos orales. Al igual que otros métodos de muestreo, toallitas nasales pueden ser más eficaces en la eliminación viral alta.
Hay algunas limitaciones asociadas con el nasal trapo método que se debe considerar antes de implementar el procedimiento. Los cerdos son animales curiosos que la raíz con sus hocicos. A menudo hay más desechos recogidos en una nasal limpie, en comparación con hisopos nasales, debido al ambiente húmedo, suciola toallita contactos en el exterior del hocico de cerdo. El contacto entre el sustrato y nasal limpie el cerdo se limita a una superficie más externa de las vías respiratorias de hisopos nasales, una situación que a menudo resulta en la deposición no intencional de los desechos del medio ambiente (es decir, ropa de cama, alimentación, estiércol, etc.) en la nasal toallitas. Estos contaminantes ambientales pueden inhibir la PCR o causar toxicidad celular durante los intentos de aislamiento viral. La limpieza del lugar de muestreo y los niveles de residuos del medio ambiente puede necesitar ser evaluado antes de proceder con la nariz limpie protocolos. La ocurrencia de la contaminación ambiental de toallitas nasales también significa que IAV detectarse con este método no puede haber sido derramada por el animal probado, sino que más bien estaba presente en el medio ambiente. Mientras que la capacidad de atribuir una IAV aislar a un animal particular puede no ser una preocupación para las actividades de vigilancia o de diagnóstico basado manada, esto puede ser una limitación a considerar para tr laboratorio basadoestudios ansmission.
Otra cuestión que debe abordarse antes de elegir este método es el aumento de espacio de almacenamiento y transporte que un gran número de muestras nasales limpie requerirán. Los viales utilizados para toallitas son mucho más grandes que los viales de almacenamiento de 2 ml criogénicos estándar utilizados para el almacenamiento de hisopo nasal y tomarán aproximadamente tres a cuatro veces más espacio en el congelador para el almacenamiento a largo plazo y en el espacio más fresco para el transporte al laboratorio. Almacenamiento de muestras durante largos períodos de tiempo a temperatura ambiente, bajo refrigeración o congelación-descongelación de las muestras será todo el resultado en una disminución de la viabilidad del virus. Un cuidado especial debe ser tomado al descongelar estas muestras. Debido a que la gasa absorbe gran parte del medio de transporte viral, las muestras se sobrecaliente rápidamente en un baño de grano seco. Sobrecalentamiento inadvertidamente las muestras durante el proceso de descongelación también puede resultar en una disminución de la viabilidad del virus. También, debido a la disminución de la recuperación IAV in vitro a partir toallitas compared a hisopos, se recomienda que no nasal toallitas ser utilizado en situaciones que requieren alta sensibilidad para la recuperación de virus viable. 30
El uso exitoso de la vigilancia IAV en los cerdos por la nasal limpie método puede resultar en una mayor facilidad de muestreo, mayor aceptación de los esfuerzos de vigilancia, y menos estrés en los animales. En el futuro, puede ser útil para el muestreo de los cerdos al entrar a una feria o para pruebas de bajo estrés de los cerdos individuales en piaras de cerdos comerciales. Este método podría ser investigado para su uso detectar otros patógenos respiratorios en cerdos. Debido porcina desempeñan un papel fundamental en la aparición de nuevas cepas IAV, continuó la vigilancia activa de IAV en los cerdos es crítica. Como tal, este método puede ayudar en la detección y epidemiológica investigación de cepas emergentes de nuevos virus de este tipo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BBL Brain Heart Infusion | Becton, Dickinson and Company | 211059 | |
| Penicillin G Sodium Salt | MP Biomedicals, LLC | 021194537 | 1500 u/mg |
| Streptomycin Sulfate | AMRESCO LLC | 0382 | |
| Gentamicin Solution | Mediatech, Inc. | 30-005-CR | 50 mg/ml |
| Amphotericin B Solution | Fisher | S 24 25 | 250 ug/ml |
| Kanamycin Sulfate | Teknova | K2105 | 5000 ug/ml |
| TPP Rapid Filtermax System | TPP Techno Plastic Products AG | 99150 | |
| Nalgen Diagnostic Bottles | Thermo Scientific | 342002-9025 | HDPE with white PP closure |
| Dermacea Gauze Sponge, 8 ply | Covidien | 441211 | 5.08 cm × 5.08 cm (2 in. × 2 in) |
| Nitrile Exam Gloves | Saftey Choice | 19-170-010 (A-D) |
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