Summary
Здесь мы предлагаем воспроизводимый метод для изучения нейрогенез с использованием анализа нейросфера, полученную из целого мозга или от или конечного мозга, tectal или мозжечка областей взрослых данио мозга. Кроме того, мы опишем процедуру манипулировать экспрессии генов в данио нейросферах.
Introduction
Млекопитающие нервные стволовые клетки (NSC , ) были охарактеризованы в пробирке их способности расти в свободно плавающих культур как кластеры делящиеся клетки называются нейросферы 1. В присутствии эпидермального фактора роста (EGF) и фактор роста фибробластов (FGF), NSC , делят либо симметрично , чтобы генерировать самообновлению NSCs, или асимметрично , чтобы генерировать два разных дочерних клеток, то есть., Дифференцирующим клеток - предшественников и новый НСК. Поэтому нейросфера культуры представляют собой смесь нервных стволовых клеток / клеток- предшественников и более дифференцированных нервных клеток 2-4 NSC , может, тем не менее, следует отличать от других типов клеток нейросфера двумя специфическими свойствами:. Они показывают долгосрочное самообновление в FREE- плавающей культур , и они могут дифференцироваться во все нейронных клеточных клонов (то есть, нейроны, астроциты и олигодендроциты) после снятия факторов роста и адгезии к внеклеточного матрикса подложках. В MAMMALS, система нейросфера культура была первая система в пробирке используется для демонстрации присутствия NSCs во взрослом мозге и остается наиболее часто используемым инструментом для анализа пролиферации, способность самообновления и мультипотентность нервных стволовых клеток и клеток - предшественников. Поэтому, несмотря на то, сфера формирования анализы страдают от некоторых недостатков и ограничений 4, эта система культуры является ценным для оценки потенциала клетки , чтобы вести себя как стволовые клетки при извлечении его из своей ниши в естественных условиях 4 и играет важную роль в определении ключевых регуляторов НСК самообновлению и клеточной судьбы определения 5-7.
В отличие от млекопитающих, которые имеют ограниченный нейрогенез, данио конститутивно производят новые нейроны вдоль всей оси мозга на протяжении всей их жизни. Данио мозг взрослого человека показывает множественные нейрогенные нишах укрывательство нервных стволовых / клеток-предшественников делает Zebrafish мощную модель организма для понимания тон стволовых активность клеток в головном мозге, а также молекулярные программы, необходимые для регенерации центральной нервной системы. За последние 17 лет, несколько исследовательских групп разработаны методики выделения и культивирования данио нервных клеток 8,9. Эти исследования были направлены на получение эмбриональных нейронов и глиальных клеток в пробирке, но не при поддержании NSCs и исследовать их свойства. Хотя нейросферы были сформированы во взрослом Apteronotus leptorhynchus (Brown Дух Knifefish) 10, A нейросфера формирования анализа в данио осталось установить.
Здесь мы опишем нейросфера формирования анализа , чтобы продемонстрировать роль микроРНК-107 во время данио нейрогенез 11. Протокол позволяет: 1) совокупность взрослых нервных стволовых клеток / клеток-предшественников либо из данио всего мозга или из нескольких вскрытых областей мозга, таких как телэнцефалона, тектуме и мозжечка; 2) генерация фли с плавающей самообновляющихся нейросферы из взрослых клеток нервных стволовых / прогениторных; 3) понижающего и повышающей регуляции экспрессии генов , кодирующих или малых некодирующих РНК 11 в нейросферах, для того , чтобы исследовать их роль в пролиферации и дифференцировки нервных стволовых клеток / клеток - предшественников.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Данио штамма WT CF были подняты и поддерживается в соответствии с протоколами , утвержденными Institutional Animal Care и использование комитета Йельского университета (IACUC номер протокола 2012-11473) путем. Все эксперименты должны быть сначала одобрены всеми соответствующими правительственными и институциональными этики регулирующих органов в отношении использования животных в исследовательских целях.
1. Подготовка
- Приготовьте 10 мл рассечение среды, добавляют 200 мкл 100x пенициллина-стрептомицина в 9,8 мл DMEM / F12.
- Готовят L-цистеин раствора: 10 мл воды для культуры ткани, добавляют 120 мг L-цистеина. Хранить L-цистеин раствор при температуре 4 ° С в течение до 2-х недель, или в аликвотах при -20 ° С в течение до 1 года.
- Приготовьте раствор ДНКазы I: к 1 мл воды для культуры ткани, добавляют 10 мг ДНКазы I. Храните I раствор ДНКазы при 4 ° С в течение до 2-х месяцев.
- Приготовьте папаин решение: подготовить папаин Solutиона, добавьте 100 мкл папаина (примерно 140 единиц), 100 мкл ДНКазы I (1%) и 200 мкл L-цистеин (12 мг / мл) в 5 мл DMEM / F12. Свеже подготовить папаин Solution каждый раз, когда и стерилизовать с фильтром с размером пор 0,22 мкм перед использованием.
- Приготовьте моющий раствор: для приготовления 100 мл промывочного раствора, добавляют 650 мкл 45% глюкозы, 500 мкл HEPES 1 М и 5 мл FBS в 93.85 мл DPBS 1x. Стерилизация моющего раствора с фильтром с размером пор 0,22 мкм перед использованием. Храните моющий раствор при 4 ° С в течение до 2-х месяцев.
- Готовят раствор инсулина: подготовить 2 мл раствора инсулина, добавить каплю 25 мкл 10 N NaOH и 100 мг инсулина в 2 мл воды для культуры тканей.
- Готовят EGF и FGF решения: Растворить как митогены в DMEM / F12 при 100 мкг / мл концентрацию. Хранить в 10 мкл аликвоты при -20 ° С.
- Подготовка B-27 и N-2 СМИ: магазин B-27 и N-2 добавки при -20 ° С до 500 мкл и 1 мл аликвоты, respectivEly.
- Приготовьте Z-дифференцирование состояние среды: подготовить 100 мл Z-дифференциации условий среды, добавляют 40 мкл инсулина (50 мг / мл), 500 мкл B-27, 1 мл N-2, 650 мкл глюкозы на 45% и 1 мл 100 х пенициллин-стрептомицина в 97,81 мл DMEM / F12. Стерилизовать Z-дифференциацию состояние среды с фильтром с размером пор 0,22 мкм перед использованием. Храните Z-дифференциацию состояние среды при 4 ° С в течение до 1 недели.
- Приготовьте Z-состояние среды: подготовить 50 мл Z-состояния носителя, добавляют 10 мкл EGF и 10 мкл FGF в 50 мл стерильной Z-дифференциации условий среды (20 нг / мл). Храните Z-состояние среды при 4 ° С в течение до 1 недели.
- Приготовьте раствор для покрытия для дифференциации культуры: по 5 мл внеклеточного раствора для покрытия, добавляют 100 мкл раствора внеклеточной матрицы в 4,9 мл DMEM / F12 (например, Матригель.). Оттепели внеклеточный раствор матрицы при температуре 4 ° С на льду. После того, как размораживать, хранить при температуре 4 ° С для ир 2-х недель.
2. Препарирование мозга взрослых данио
- Подготовка рассечение постели, заполнив 100 мм х 15 мм чашки Петри с помощью гель-пакеты со льдом. Затем поместите крышку на чашку Петри и не инкубировать при температуре -20 ° С до замерзает геля. На верхней части крышки места квадрат чистой фильтровальной бумаги и обернуть как фильтровальную бумагу и чашки Петри с помощью пластиковой пленки.
- Чистый и стерилизовать все инструменты микродиссекции от 70% этанола или тепла перед каждым использованием. Поместите все простерилизованные инструменты рассечение рядом с рассекает микроскопом и, прямо перед эвтаназии, поместите рассечение кровать под микроскопом с оптической подсветкой волокна.
- Соберите 2 взрослых данио для всего препарата мозга нейросфера; и от 3 до 4 данио для генерации нейросферы из вскрытых областей головного мозга.
- Эвтаназии взрослых данио (8-12 месяцев) с использованием протокола, одобренного по уходу и использованию комитета Institutional животных путем. Затем погрузить рыбу в 75% этилового спирта в течение 5-10 с и быстро разместить в секционном слое с последующей декапитации на уровне жабры с использованием хирургическим скальпелем.
- Для эвтаназии животных, управлять передозировку (300 мг / л) Tricaine метансульфоната до сердца бить животного постепенно замедляется и циркуляция прекращается, а затем погружают в воду со льдом.
- Поверните голову спинной стороной вниз, и с помощью ножниц делают продольный разрез со стороны разреза до устья. С помощью щипцов обнажить основание черепа и удалить все прилегающие ткани. Обрежьте боковые стенки черепа с начала спинного мозга к тектуме.
- Используя ножницы, вырезать и удалить зрительные нервы, а затем удалить обе стороны самой боковой части черепа на уровне тектуме. Поверните голову вентральной стороной вверх. Использование щипцов, шелушится остальную часть самой верхушечной части черепа.
- Перенести мозг вместе с остальной частью черепа в новое блюдо Wiго рассечение среды (1.1). Очистите мозговую ткань в рассечение среде с использованием пластиковой ручкой микро ножа, сохраняя все структуры мозга нетронутыми.
- С этой точки зрения, по-прежнему протокол, используя весь мозг данио.
- В качестве альтернативы адаптировать этот протокол для конкретных областей мозга, чтобы генерировать нейросферы от всего данио мозга или из телэнцефалоне, тектум / диэнцефалона или мозжечка расчлененным со свежим скальпелем. Используйте нейронную специфический флуоресцентный данио нейронную трансгенной линии рассекать область мозга проценты в соответствии с фиг.3 и ссылки 11.
3. Single Cell диссоциация мозг взрослого человека
- Выполните всю последующую работу в кабинете биологической безопасности. Передача ткани головного мозга в 1,5 мл пробирку, содержащую 800 мкл среды рассечение (полученного на стадии 1.1). Удалите рассечение среду пипеткой, не касаясь ткани мозга.
- Добавьте 500 мкл раствора папаина (этап 1.4), и переваривают ткани мозга при 37 ° С в течение 10 мин. Не инкубировать дольше, чем 15 мин, поскольку это может привести к снижению жизнеспособности клеток.
- После инкубации перенести мозговой ткани с 500 мкл раствора папаина в 15 мл коническую трубку с помощью 1000 мкл сократить пипеткой наконечник на ~ 0,25 дюйма от дна. Осторожно диссоциировать мозговую ткань, медленно пипетированием вверх и вниз 10 раз, с тем же самым кончиком. Не пипеткой вверх и вниз более чем в 15 раз и не генерируют пузырьки воздуха во время этого этапа, поскольку это может изменить жизнеспособность клеток.
- Выдержите ткани мозга снова при 37 ° С в течение 10 мин с последующим пипетированием вверх и вниз 10-13 раз с использованием режиссерский 1000 мкл регулярного наконечника. Не пипеткой вверх и вниз более чем в 15 раз, чтобы избежать гибели клеток.
- Остановить ферментную пищеварение путем добавления 2 мл промывочного раствора (шаг 1,5), и центрифуга клеточной суспензии при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Аккуратно перелейте Supernatant и ресуспендируют осадок в оставшемся растворе, нажав на трубку энергично с пальцем, а затем с помощью пипетки вверх и вниз с 1000 мкл регулярного наконечника. Затем добавляют 2 мл промывочного раствора.
- На данном этапе проверки под микроскопом, который был получен суспензии отдельных клеток. Центрифуга клеточной суспензии снова при 800 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант и повторно приостанавливать осадок с помощью 1 мл свежей Z-состояния среды (шаг 1.10).
- Пятно клетки с помощью трипанового синего 12 и подсчета живых клеток с помощью гемоцитометра путем исключения синих мертвых клеток. Готовят 24-луночный планшет с 200 мкл суспензии клеток и 300 мкл свежей Z-состояния среды в каждой лунке. Семенной клеток при плотности ~ 500 клеток / мкл. Поддерживать культивируемые клетки в инкубаторе при температуре 30 ° C в 5% CO 2, так как данио полученный из головного мозга нейросферы не очень хорошо растут при 37 ° С.
4. Генерация первичного нейросферах </ Р>
- Через 1 день в пробирке (Div1), наблюдать за клеточную суспензию , полученную от взрослого всего мозга под микроскопом и отметить ли мусор накапливается в центре колодца. Осторожно удалите мусор с помощью пипетки приблизительно 100 мкл среды (меньше, если это возможно). Затем добавьте 100 мкл свежей Z-состояния среды. Одноклеточных суспензий должны наблюдаться в это время (рис 2А див1).
- Через 2 дня в пробирке (div2), расширить культивируемые клетки. С помощью 1000 мкл пипетки с разрезом наконечник, собирать и передавать 250 мкл клеточной суспензии из каждой лунки в новую скважину. Добавьте 250 мкл свежей Z-состояния среды во все лунки. Перед тем как расширение культивируемых клеток, гомогенизируют суспензию очень осторожно пипеткой вверх и вниз по всей скважине.
- Повторите шаги 4.1 и 4.2 для следующих 4 дней в пробирке (div4). Прогрессивное увеличение размера нейросферах должно быть VIможные в центре и по краям колодца на div3 и div4 (рис 2B и C).
Примечание: Первичные нейросферы могут быть обработаны для прохождения или дифференцировки для оценки мультипотентность. В качестве альтернативы, они могут быть обработаны для nucleofection или липо-трансфекцией 11 , чтобы охарактеризовать роль специфических генов в процессе дифференцировки.
5. Пассирование первичного нейросферах
- Удалить 250 мкл тканевой культуры из каждой лунки и механически диссоциируют div4 нейросферы с 1 мл пипетки. Не пипеткой вверх и вниз слишком быстро, как формирование воздушного пузыря может увеличена гибель клеток.
- Граф клеток с помощью гемоцитометра и распределить ниже 800 клеток / мкл в 250 мкл первичного супернатанта культуры в каждую лунку 24-луночного планшета.
- Добавьте 250 мкл Z-состояния среды в каждую лунку.
- Через 2 дня в пробирке (div2), расширить культивируемые клетки , как сообщается в шаге 4.2d 4.3.
6. Дифференциация первичного нейросферах
- Стерилизовать покровные стекла путем погружения в 70% этаноле в течение 10 мин, а затем сухие покровные стекла при комнатной температуре, поместив их в каждую лунку 12-луночного планшета.
- Добавьте 300 мкл раствора для покрытия внеклеточной (этап 1.11) в центре покровного стекла таким образом, что он может расширить широко и охватывать весь покровного стекла. Затем инкубируют при 37 ° С в течение 1 ч (с использованием увлажненного для культивирования клеток-инкубатор).
- Удалить внеклеточный раствор для покрытия, после инкубации, и высушить покровного стекла в течение 2 ч при 37 ° С.
- Удалить 250 мкл тканевой культуры из каждой лунки. Механически диссоциируют все первичные нейросферы div4 на лунку с 1 мл пипетки (с более широкого конца наконечника) с помощью пипетки вверх и вниз.
- Семенной диссоциированы нейросфера клеточных суспензий при плотности клеток 4 х 10 3 клеток / мл на предварительно подготовленной внеклеточного матрикса coverglasses покрытием (шаг 6.1-6.3) и удерживать в течение не менее 30 мин, при 30 ° С в 5% CO 2, до тех пор , пока прикреплен к подложке. Затем удалите питательную среду и быстро прибавляют 1 мл подогретого свежего Z-дифференциации состояния среды (этап 1.9) перед культивированием клеток в течение 24 ч при 30 ° С в 5% CO 2.
- Каждые два дня, заменить половину состояния среды Z-дифференцировки в течение времени клеточной дифференциации.
7. Gene Manipulation первичного нейросферах
- Сбор DiV3-4 первичных нейросферы (этап 4.3) при центрифугировании в течение 8 мин при 80 х г при 4 ° С. Подготовка к липосомной трансфекции коммерческих oligonucleoatides , как описано Previouly 11 или Núcleo трансфекции плазмидной ДНК векторов.
- Ресуспендируют осадок нейросфера при плотности клеток 4 х 10 3 клеток / мкл в 100 мкл реакционной смеси (82 мкл раствора nucleofactor и 18 мкл дополнения).
- Смешайте нейросфера suspensiпо 5 мкл плазмидной ДНК векторов выбора (плазмидных запасов в количестве от 1 мкг / мкл). Перенести смесь нейросфера / ДНК в кювете для Nucleofector nucleotransfection и выберите Nucleofector программу в соответствии с инструкциями изготовителя, предоставляемые комплектом Nucleofector.
- Сразу же после того, как nucleofection, добавьте объем 500 мл подогретого Z-состояния носителя (1.10) к клеткам и пластинчатые трансфектированных нейросферы для изучения их обновление клеток и / или свойства дифференциации, как было описано выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Генеральная схема взрослых данио нейросфера культуры
Здесь мы опишем все этапы протокола в нейросфера формирования анализа выполненных из взрослых данио мозга. Во- первых, взрослые нервные клетки стволовые / предшественники, были собраны либо из данио всего мозга или из нескольких вскрытых областей мозга , таких как телэнцефалона, тектуме и мозжечка (1А-С). Одноклеточной суспензии клеток взрослого нервных стволовых / прогениторных были затем использованы для создания плавучих и самообновлению нейросферы (рис 1D, E). И, наконец, нейросферы играют важную роль в изучении простои и повышающая регуляция экспрессии генов , кодирующих или малых некодирующих РНК 11 для того , чтобы исследовать их роль в пролиферации и дифференцировки данио нервных стволовых клеток / клеток - предшественников.
Рыбок данио первичные нейросферы могут самообновлению после нескольких проходов. Для создания нейросферы при прохождении 1 и 2, стадии 5.1-5.4 были повторены дважды, в общей сложности 6-8 дней. Из DiV2-4, размер нейросферах увеличилась примерно до 50 мкм в диаметре. Вторичные и третичные нейросферы также были получены после прохождения 1 и 2, соответственно (рис 2D). При прохождении 3, данио нейросферы были , однако , не может расти в критический размер диаметра 50 мкм и не самообновлению, предполагая , что наше состояние культуры , а выбирает пул стволовых клеток / клеток - предшественников , чем чистой популяции нервных стволовых клеток ; 4 ,
нейросфера Дифференциация
Первичные, вторичные или третичные нейросферы, получаемый из Wholе мозга или из конечного мозга, мозжечковая и tectal площадь взрослых данио были протестированы на их дифференциации потенциальных возможностей. От 1 до 3 дней в пробирке в условиях дифференцировки (DiVd1-DiVd3), монослой прилипших клеток наблюдалось (фиг.3а, б). Как показано на фиг.3С, на DiVd4, аксональная выступами, а также глиальные клетки были видны и различимы иммуногистохимического или генной экспрессии анализирует 11, оценивая , что нейронные стволовые клетки / клетки - предшественники дифференцировались. Точно так же, нейроны и глиальные клетки дифференцируются из нервных стволовых клеток / клеток- предшественников , выделенных из разных территорий головного мозга (Рисунки 3D, Е).
Экспрессия гена Манипуляция в данио нейросферах
Мы проверили роль микроРНК-107 на нейронную и глиальной дифференцировки всей данио мозга-де привели к расколу нейронные стволовые клетки / клетки - предшественники (рисунок 4). Мы показали , что понижающая регуляция MIR-107 анти-MIR-107 не влияет на нейросфера формации , а измененное нейрональной дифференцировке, как указано аномальный рост аксонов процессов (фиг.4А, В). экспрессии генов ОТ-ПЦР анализ подтвердил, что ингибирование микроРНК-107 приводит к увеличению экспрессии обоих нейробласте маркера Neurogenin-1 (СПП-1) и аксон-специфических молекул, таких как МАП-2 и альфа-тубулина, не затрагивая глиальных выражение клеточный маркер (S-100, GFAP, Olig2) (рис 4C). Таким образом , усиление экспрессии микроРНК-107 с помощью микроРНК-107-мимические вызывало снижение neuroblast- и Аксон-специфической экспрессии маркера (рис 4D), оценивая , что в лабораторных условиях , MIR-107 действует в качестве нейронного регулятора дифференцировки во время данио нейрогенез 11.
/53617/53617fig1.jpg "/>
Рисунок 1:. Схематическое представление протокола Шаги Процедуры и связанные с ними сроки включают рассечение либо весь мозг или конечного мозга, tectal и мозжечка областей взрослого данио мозга (А, В), obtention одной клетки суспензии (C ), поколение плавающих нейросферах (D) и дифференциации нейросферах (Е).
Рисунок 2: Формирование рерио мозга производный нейросферах. (A - C) представитель фазового контраста изображения всего головного мозга , полученных первичных плавающих нейросферах наблюдался в 1 -й день (Div1, А), 3 -й день (div3, B) и 4 -й день (div4, C). (D) , диаграмма , представляющая относительное число Н.Е.urospheres в Проходы 1 и 2 по сравнению с числом нейросфера при прохождении 0. После прохождения 2, нейросферы формация резко уменьшилось. Шкала бар: 25 мкм.
. Рисунок 3: Разграничение рерио полученный из головного мозга нейросферах (А - С, Е) фазового контраста изображения всего головного мозга , полученных нейросферах , культивированных в Z-дифференцировки среды в течение 1 (A, DiVd1), 3 (В, DiVd3) и 4 (C и D, DiVd4) дней. (E) Спинной вид на весь мозг 12 - месячного Tg (GFAP: DsRed) данио. Телэнцефалона (тел), Tectum (Tec) и мозжечок (Cer) были разрезаны и собраны, как показано на рисунке. (D) Изображения DiVd4 нейросферах , полученных из тектума, телэнцефалоне и мозжечка при переходе 0 (P0), 1 (P1) И 2 (Р2). Шкала бар: 25 мкм.
Рисунок 4: Анализ. Нейросферах Сформированный следующие MiR107 Манипуляция (А) фазового контраста изображения , показывающие Div4d нейросферы лечение в div4 с указанными олигонуклеотидами. Черные ящики в верхних панелях указывают область увеличенного в нижней панели. (B) Верхний график представляет собой количественную оценку числа нейросферах , образованных с, или без него , miR107. Нейросферы их на подгруппы (размером 20-30 мкм, 31-50 мкм,> 51 мкм в диаметре). Нижняя диаграмма показывает количественное определение аксонов проекций от нейросферах обработанных и к югу, сгруппированных, как указано выше. (C, D) Анализ экспрессии QRT-ПЦР указанных генов с помощью Div4d нейросферах ранее обработанных указанными олигонуклеотидами в div4. Данные представляют собойсреднее значение ± SEM, * р <0,05, п = 3. Scr: карабкаться. Шкала бар: 25 мкм.
| проблема | Возможная причина | Решение |
| Восстановление слишком много мертвых клеток | Временная задержка при подготовке мозг, прежде чем ферментативной обработки | Убедитесь, что рассечение настройки и средства массовой информации готовы прежде, чем пожертвовать рыбу (также проверить стерильность, температура) |
| Строгие лечение папаин | Механические диссоциации должна быть достаточно тонкий, чтобы создать живой одноклеточной суспензии, но достаточно сильны, чтобы избежать оставляя за собой слишком много сгустки ткани. Соблюдайте рекомендованные времени и температуры инкубации периодов / центрифугирования | |
| Нейросферах не появляются или слабо растут | Неправильная температура | Убедитесь, что инкубатор при 30 ° С, обеспечивающий грдый правильный температура. |
| Растущие шарики удалены с мусором | Для каждой лунки, стремление мусора должна быть выполнена наилучшим образом на верхней части среды. Не вводите в среду с вашей пипеткой | |
| Целостность некоторых реагентов (B27 добавка, EGF, FGF) ослабляется | Эта целостность является ограничивающими факторами роста клеток. Проверьте номер партии, и образцы были сохранены путь. Избегайте оттепели / замораживать циклов любого отобранного реагента, используемых в культуре | |
| Наличие отдельных клеток | Режим передачи / расширение нейросферах слишком суровым | Этот шаг является шагом расширение / разведение, так как слишком много сфер образуются в скважине. Избегайте резкой коллекции сферы во время передачи для предотвращения нейросфера диссоциации на отдельные клетки |
| Отсутствие клеток на Матригель | Матригель не была должным образом оттаивают / разбавили | Матригель от -20 ° C требуется по меньшей мере 30 мин при температуре 4 ° С, чтобы разморозить и тщательно остается вязкой пипеткой |
| Нет адгезия Матригель | Объем клеточной суспензии должен быть достаточно мал, чтобы позволить осаждение клеток на Матригель пальто | |
| Дайте больше времени для осаждения клеток (до 2 часов, если используются большие объемы) | ||
| Свежая дифференциация средней слишком холодно | При замене клеточного прикрепления среды, дифференцировка среда должна быть нагрета до 30 ° С для предотвращения теплового удара на осажденных клеток | |
| Бедный nucleofection | Мертвые клетки | Убедитесь, что вы не генерировать пузырьки воздуха при выполнении nucleofection. Использование векторов ДНК высокого качества с использованием Maxi-препаратов. По крайней мере, 1 - 2 ч после nucleofection заменить культуральной среды с использованием либо свежей Z-дифференциации состояние среды или Z-состояние среды. |
| Несколько положительных нейросферы | Нейросферах различных размеров может привести к ухудшению nucleofection. Использование нейросферы в div2 и div3 идеально подходят для nucleofection. Плотность клеток не должна превышать 4 х 10 3 нейросферах мл -1 в реакции 100 мл. |
Таблица 1: Устранение неисправностей Советы Листинг, для каждого шага протокола, возможные проблемы и способы для их решения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основной целью этого протокола является, чтобы изолировать и культуры взрослых данио мозга, полученных нейросферы для изучения клеточных и молекулярных особенностей нервных стволовых клеток / клеток-предшественников. Здесь мы сообщаем о том , как выбрать мультипотентных нервных клеток и генерировать три нервных типов клеток, т.е. астроциты, нейроны и олигодендроциты, от взрослых данио мозга. Протокол имеет большое значение, так как воспроизводимый нейросфера формирования анализа не было установлено в данио до сих пор.
Несколько важных шагов в протоколе должны быть соблюдены и были recapitutaled в инструкций по устранению неполадок (таблица 1). Во-первых, гибель клеток происходит как во время рассечения взрослого данио мозга и одной процедуры клеточной суспензии. Для того чтобы ограничить продлить гибели клеток, необходимо использовать чистые и острые инструменты, а также строго соблюдать сроки и температуру инкубации, рекомендованный в настоящем протокол. Во-вторых, нейросфера культура должна быть выполнена свежеприготовленными средствами и с тщательной техникой пипетирования. В-третьих, рекомендации плотности клеток необходимо следовать, чтобы получить надежное обновление или дифференцировки клеток нейросфера. Имея это в виду, любой специалист в области методов клеточной культуры должны быть в состоянии использовать протокол и осуществлять изоляцию, культуры и генной манипуляции взрослых данио мозга, полученных нейросферах.
Сфера формирования анализы в данио страдает от тех же ограничений , описанных ранее у видов млекопитающих 4: 1) поведение нервных стволовых клеток / клеток - предшественников изменяется после их изоляции от их естественной нише мозга; 2) нейросферы не является гомогенной популяции стволовых клеток, но включают стволовые клетки, клетки-предшественники, а также постмитотические дифференцированных клеток. Это к тому же стоит отметить, что наш протокол генерирует aclonal культуры нейросфера. Плотность клеток культуркритическим параметром в сфере формирования анализов , так как она определяет клональности, то есть, является ли клоновая, полу-клоновая или aclonal культура. Клональный условия позволяют точно охарактеризовать и количественно различные бассейны, присутствующих в культуре стволовых клеток и клеток-предшественников. Мы не были в состоянии выполнить клеток Клональность анализы до сих пор, и наши условия культивирования все еще нужно больше оптимизации, прежде чем мы можем различить нервные стволовые клетки из других пулов клеток-предшественников.
Рыбок данио культур нейросфера может использоваться для широкого спектра экспериментов. Они позволяют анализа экспрессии генов, а также манипулирование экспрессии генов во время нейрогенеза , как показано в нашем исследовании оценивающего микроРНК-107 функции в тканях специфического определения нервных клеток судьбы (рис 4 и 11). Дополнительные приложения включают в себя стратегии редактирования генома, такие как система CRISPR / cas9, для того, чтобы проверить роль нейронных генов стволовых / прогениторных в neurogeНесис и мозг ремонт 13. И, наконец, наш протокол показывает , что данио нейросферы могут быть получены из различных областей мозга , открывая возможность для изучения специфических для региона особенности нейронов и глиальных клеток и для изучения клеточной и молекулярной основе нейронных клеток гетерогенность в различных желудочковых доменов данио мозга 14 ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS 1x | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1x | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1 M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural stem cell isolation and characterization. Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
- Winter, M., et al. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing. Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).
- Gage, F. H.
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes. Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).
- Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio). PloS one. 8, e57539 (2013).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Ristori, E., et al. A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis. Dev Cell. 32, 546-560 (2015).
- Louis, S. K., SIegel, A. C. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods. Methods Mol Bio. 740, (2011).
- Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J.
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
