Introduction
Glicolipidi, glicoproteine, proteoglicani, glicosaminoglicani e costituiscono i quattro classi principali di complessi carboidrati eterogenee noti collettivamente come glicani. Come componenti onnipresenti e integrali della membrana plasmatica, glicocalice, e la matrice extracellulare e fluidi, glicani partecipano in questi diversi processi biochimici come l'endocitosi, traffico intracellulare, motilità cellulare, trasduzione del segnale, riconoscimento molecolare, l'attivazione del recettore, adesione cellulare, l'interazione ospite-patogeno , intercellulare comunicazione, immunosorveglianza, e l'iniziazione risposta immunitaria. 1 Presente in quasi tutti i campi della vita, enzimi noti come glicosiltransferasi che costruiscono i polimeri glycan agire in tandem con glicosidasi (noto anche come glicosidasi, che abbattere glicani) per la costruzione, ristrutturazione, e infine produrre polimeri finalizzato glycan 2. Anche se ogni glycosyltransferase può operare su diversi glicoconiugati, un glycosyltransferasegeneralmente forgia una sul sollevatore e anomero specifico legame glicosidico trasferendo la frazione monosaccaride di un particolare nucleotide attivato zucchero donatore (ad esempio, il PIL-fucose) per una determinata categoria di accettori nucleofili (ad esempio, un lipide, polipeptide, acidi nucleici, o la coltivazione oligosaccaride). È stato stimato che più del 50% di proteine (specie di membrana e proteine secretorie) sono post-traduzionali modificato glicosilazione 3 calcoli combinatori rudimentali prevedono un apprezzamento per la notevole variabilità, versatilità, e specificità riconosciuta alle glicoproteine di glicosilazione.; per esempio, se un substrato polipeptide ha solo 10 siti di glicosilazione e ogni sito può formare un legame glicosidico con 1 di soli 3 diversi monosaccaridi estremità riducenti, teoricamente, la glicoproteina finale può assumere 3 10 = 59.049 identità distinte. In glicoproteine, legami glicosidici comunemente formano con la catena laterale di azoto oresidui f asparagina nella sequenza Asn-X-Ser / Thr (X può essere qualsiasi aminoacido prolina tranne) per produrre N -glycans 2 e della catena laterale idrossili di residui di serina e treonina per produrre O -glycans 4. La composizione di glycome di una cellula (ad esempio, il suo complemento dei prodotti di glicosilazione) è unico e limitato perché, con poche eccezioni, glicosiltransferasi mostrano donatore rigorosa, accettore, e il collegamento specificità. 5 glicoproteine importanti e abbondanti plasma sanguigno soffrono glicosilazione aberrante come conseguenza a valle di espressione glycosyltransferase anormale e l'attività a causa di molte condizioni patologiche, in particolare il cancro e le malattie infiammatorie. 6-24
Principalmente a causa di fattori epigenetici, il glycome è significativamente più diversificata, dinamica e complessa di quella del proteoma e del trascrittoma. 25,26 Mentre circa l'1% del genoma dei mammiferi codifica la formazione, la modifica emontaggio di glicani, 27 procede di glicosilazione in un non-template-driven modo, un contrasto marcato per polipeptide e la biosintesi degli acidi nucleici. L'interazione tra la quantità relativa e l'attività degli enzimi di glicosilazione e fattori ambientali come la disponibilità di nutrienti e precursore in ultima analisi, determina la natura, la frequenza e l'estensione di glicosilazione. 5,28 Embriogenesi (ad esempio, la determinazione e la differenziazione), attivazione cellulare, e la progressione attraverso l'espressione genica influenza ciclo cellulare (cioè, trascrizione e traduzione) e modificare l'identità e la quantità di glicosiltrasferasi disponibili, la cui attività è il determinante monte immediata del profilo glycan della cellula. Perché (alcuni dei) del proliferativa, adesivi, e le proprietà invasive di cellule cancerose sono simili a quelle delle cellule embrioniche ordinarie, modifiche del vie biosintetiche glycan (ad esempio, l'accumulo di precursore, espressione deregolamentato, aberrant modifica, troncamento strutturale, o la formazione di romanzo) servono biomarcatori tumorali come universali che indicano varie fasi di formazione del tumore, la progressione, la migrazione e l'invasione 29 Anche se la glicosilazione è molto complesso, evidentemente, solo poche alterazioni glicosilazione possono abilitare la carcinogenesi e metastasi.; a quanto pare, alcuni prodotti di glicosilazione "aberranti" infatti beneficiare cellule cancerose, consentendo loro di eludere il riconoscimento immunitario e sopravvivere alle esigenze di migrazione in ambienti intravascolari e metastatici inospitali. 28,30,31 Non sorprendentemente, gli esperimenti hanno rivelato che interrompere o prevenire modelli di alterata l'espressione genica e la formazione glycan aberranti possono fermare tumorigenesi. 29 Tuttavia, i glicani aberranti rilevati in un campione BIOFLUID (ad esempio, urina, saliva, e plasma sanguigno o siero) non possono essere indicatori diretti di cancro (o un'altra malattia), ma piuttosto a valle esiti di sottile ma significativocambiamenti nel sistema immunitario o ramificazioni quantificabili di una condizione perniciosa in un organo imprevedibile. 32
Anche se forniscono informazioni circa l'universale glycome, molti molecolari glicomica interazione basati su tecniche (ad esempio, lectina / array di anticorpi e metabolico / etichettatura covalente) dipenderà l'individuazione di strutture intere glycan e non forniscono informazioni strutturali dettagliate sui singoli glicani. In netto contrasto, la spettrometria di massa (MS) può aiutare a identificare e quantificare singole strutture glycan e rivelare tali informazioni strutturali come i siti di attacco per core polipeptide. dell'espressione o dell'attività di un solo glicosiltrasferasi deregolamentato possono iniziare una cascata di eventi molecolari dannosi in molteplici vie glicosilazione. Poiché ogni glycosyltransferase può operare su più di un substrato glicoconiugati e tra i diversi polimeri glycan crescita, cascate biosintetici liberalizzati resa disproporzionale maggiore quantità di un solo prodotto glicani ma diverse classi eterogenee di glicani aberranti nei fluidi intra o extracellulare. 33 Tuttavia, tali glicani aberranti unici sono a volte considerati poco pratico come biomarcatori per il cancro o altre patologie glycan-affettiva perché, rispetto alla grande piscina di glicani ben regolamentata, questi glicani aberranti rappresentano una frazione molto piccola che possono spesso rimangono rilevabili anche da tecniche come altamente sensibili come la spettrometria di massa. Ad esempio, nei fluidi corporei intra ed extracellulari, l'ampio spettro proteina-concentrazione (che attraversa otto ordini di grandezza) può impedire il rilevamento di glicoproteine scarse mascherati dalle specie più abbondanti. 32 Inoltre, la determinazione dell'attività glycosyltransferase rimane una notevole pratica e la sfida teorica perché molti glicosiltransferasi sono assenti in biofluidi clinici o diventare inattivo ex vivo. Nonostante la difficoltà di consistently rilevare e quantificare le quantità ultra-minuti di glicani tutto unico, praticanti di spettrometria di massa hanno fatto enormi passi avanti verso l'impiego glicani intatti come marcatori clinici. Abbiamo recentemente sviluppato un approccio complementare all'analisi dei glicani intatte che, impiegando GC-MS, facilita il rilevamento di tutti branch-point costituente e monosaccaridi specifici di collegamento ( "nodi glicani") che insieme conferiscono unicità ad ogni glicani e in molti casi servono direttamente surrogati come molecolari che quantificano l'attività relativa del glycosyltransferase colposo (s).
Fin dalla sua prima applicazione diretta riferito all'analisi glicani nel 1958, gascromatografia (GC) ha dimostrato una tecnica potente per l'analisi per-metilato mono e disaccaridi, 34 determinare la loro anomericity e configurazione assoluta, e separarli per la successiva analisi di spettrometria di massa. 35 tra il 1984 e il 2007, Ciucanu e colleghiintrodotto e affinato una tecnica glycan permethylation in fase solida che ha impiegato idrossido di sodio e iodometano, seguita da estrazione liquido / liquido di glicani permethylated con acqua e cloroformio. 35,36 Tra il 2005 e il 2008, Kang e collaboratori integrati un risparmio di tempo di rotazione approccio -column nella fase permethylation. 37,38 nel 2008, il gruppo di ricerca Goetz messo a punto un solido-fase quantitativa permethylation metodo glycan-profiling usando matrix-assisted laser desorbimento-ionizzazione (MALDI) spettrometria di massa per confrontare e distinguere invasiva e non potenzialmente non invasiva delle cellule del cancro al seno; 39 poi, nel 2009, il team di Goetz combinato enzimatica e tecniche di rilascio di sostanze chimiche per fendere O -glycans da glicoproteine intatte in uno schema permethylation in fase solida altamente alcalini 40 Anche se la procedura di Goetz facilitato permethylation simultanea e rilascio di sostanze chimiche. di -glycans O, è stato applicato solo alle pre-isolata glicoproteine. Abbiamo modificato questa tecnica nel 2013 e adattato per intere biofluidi non frazionate e campioni di tessuto omogeneizzati incorporando acido trifluoroacetico (TFA) idrolisi, riduzione e acetilazione passi. 33 Questi passaggi aggiuntivi anche rilasciare glicani da glicolipidi e N -linked glicani da glicoproteine e convertire li in acetati parzialmente metilati alditolo (PMAAs, Figura 1), il cui pattern di metilazione-and-acetilazione distintivo facilitare l'analisi mediante GC-MS e unicamente caratterizzare i nodi glicani costituenti in originale intatta polimero glicani 41 (Figura 2). 33 in definitiva, questo procedura produce un ritratto composito di tutti i glicani in un complesso a base di BIOFLUID diretta, quantificazione relativa di caratteristiche uniche come glycan "fucosilazione core", "6-sialylation", "bisettrice GlcNAc", e "beta 1-6 ramificazione" - ogni deriva da un unico chromatograp GC-MSpicco hic. Questo articolo presenta un'ulteriore ottimizzazione della permethylation, acetilazione, l'isolamento, e le fasi di pulizia insieme con il miglioramento della modalità di quantificazione relativa.
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Protocol
Attenzione: evitare il contatto della pelle / degli occhi con uno qualsiasi dei reagenti utilizzati in questo esperimento. Al momento dell'esposizione, sciacquare a fondo l'area interessata con acqua e consultare un medico immediato.
1. Permethylation e Glycan Estrazione
- Preparazione colonna
- Ottenere un numero di unità di colonne microcentrifuga rotazione come i campioni da analizzare. Rompere e staccare i tappi tubo serbatoio in plastica. Mettere un filtro microcentrifuga mini in ogni tubo serbatoio. Posizionare le colonne di spin microcentrifuga assemblati (che contengono i mini filtri) in un rack provetta per microcentrifuga.
- Ottenere uno stock di idrossido di sodio (NaOH) perline (20-40 mesh). Trasferimento alcuni NaOH ad una piccola barca di peso o, se l'umidità sta causando aggregazione, un mortaio di porcellana caldo come lo stock di lavoro di NaOH. Evitare l'uso di ciuffi di perline NaOH NaOH o schiacciati / polvere.
Attenzione: NaOH è un potente tossina e base corrosivo. Lavare la pelle / occhi esposti con acqua per 15 minuti. ThorougHLY pulire il banco di lavoro dopo aver completato l'esperimento. - Utilizzando un piccolo scoop o una spatola, trasferire perline NaOH dal magazzino al lavoro per riempire le mini filtri microcentrifuga con NaOH fino al primo smusso esterno (~ 5 mm sotto il bordo). Toccare i filtri microcentrifuga pieni sul banco per il confezionamento / condensare le perline NaOH.
Nota: In questo esperimento, per minimizzare eccessivo assorbimento dell'acqua da perline NaOH igroscopici, mantenere il livello di tutti i liquidi aggiunti (ad esempio, acetonitrile, dimetilsolfossido, soluzione analita) sopra la superficie del riempimento della colonna NaOH e limitare il contatto diretto con l'aria. - Ottenere uno stock di acetonitrile (ACN). Trasferire ~ 350 microlitri ACN per ogni mini filtro microcentrifuga NaOH ricco. Mantenere il NaOH sommerso sotto ACN e rimuovere grosse bolle d'aria mescolando con un gel-carico punta della pipetta punta arricciata.
Attenzione: Acetonitrile è un irritante infiammabile. - centrifugazione colonna
- Disporre le colonne microcentrifuga simmetricamente all'interno di una centrifuga; utilizzare un tubo di bilanciamento, se necessario. Evitare di versare i granuli NaOH all'interno della centrifuga. Chiudere il coperchio della centrifuga.
- Centrifuga le colonne (contenente NaOH e ACN) per ~ 15 sec a 2.400 × g.
- Al termine della centrifugazione, rimuovere colonne microcentrifuga dalla centrifuga, e scartare l'ACN in un contenitore per rifiuti pericolosi. Mantenere la colonna NaOH imballaggio intatto.
- Aggiungere ~ 350 microlitri dimetilsolfossido (DMSO) per ogni mini filtro microcentrifuga NaOH ricco. Mantenere il NaOH sommerso sotto DMSO e rimuovere eventuali grosse bolle d'aria con un puntale. Come descritto in precedenza, le colonne centrifugare per ~ 15 sec a 2.400 × g, ed eliminare il DMSO mantenendo il NaOH imballaggio intatto.
Attenzione: DMSO è un agente mutageno e irritanti ed è facilmente assorbito attraverso la pelle. - Collegare tutti i mini filtri microcentrifuga con i tappi inclusi nel filtro rotativokit. Trasferire ~ 350 ml di DMSO a ogni mini filtro microcentrifuga NaOH ricco e utilizzare una punta della pipetta 200 ml per eliminare le bolle d'aria nella confezione NaOH in modo che DMSO raggiunga tutte le regioni entro allora imballaggio NaOH. Evitare di schiacciare o eccessivamente raschiando le perle NaOH; NaOH in polvere è indesiderabile. Finire questo passaggio il più rapidamente possibile.
- Preparazione di Controllo Qualità del plasma (QC) del campione (s)
Nota: Per assicurare risultati coerenti in lotti sperimentali, considerare l'utilizzo di almeno una aliquota di un campione prelevato da una grande raccolta, omogenea massa del materiale biologico che interessa da analizzare in ciascun lotto. Ad esempio, se l'analisi plasma sanguigno, utilizzare aliquota (s) di una collezione massa di plasma sanguigno come campione QC (s) in ciascun lotto. campioni Processo QC nello stesso modo dei campioni sconosciuti.- Centrifuga uno stock campione di QC plasma per 4 min a ~ 10.000 × g. Durante la centrifugazione, alcuni precipitato ad alta densità può comporre a the inferiore e qualche precipitato bassa densità possono galleggiare all'inizio del plasma. Evitare sia durante la rimozione aliquota (s) di plasma.
- Passare a "1.3) Preparazione del campione" di seguito. Poi, tornare a questo passo dopo centrifugazione il plasma è completa.
- Prelievo 9 ml di plasma, QC, centrifugato e trasferirlo ad una provetta da 1,5 ml in polipropilene opportunamente etichettati dotato di un tappo di chiusura a scatto (qui di seguito denominata "provetta di plastica da 1,5 ml"). Aggiungere 1 ml di acqua deionizzata per ogni aliquota; se desiderato, utilizzare questo come un vettore per standard interno (s).
- Aggiungere 270 ml di DMSO a questo controllo del plasma. Vortex per garantire la completa dissoluzione.
- Preparazione del campione
- Ottenere come molti provette di plastica da 1,5 ml come il numero di campioni (analita) biologici.
- Trasferimento 9 microlitri di ciascun campione biologico (analita) nella provetta di plastica da 1,5 ml corrispondente. Trasferire 1 ml di acqua deionizzata e 270 ml DMSO ad ogni provetta.
- Mescolare energicamente (ad esempio, vortex e / o più volte pipetta su e giù) i campioni per garantire la completa dissoluzione in DMSO.
Attenzione: Effettuare le seguenti operazioni all'interno di una cappa aspirante. Usato nelle seguenti fasi, iodomethane (CH 3 I), diclorometano (CH 2 Cl 2, alias cloruro di metilene), e cloroformio (CHCl 3, triclorometano), sono liquidi volatili in grado di sciogliere alcuni tipi di plastica (ad esempio, guanti di nitrile) . Assicurarsi di utilizzare guanti resistenti ai solventi. A causa della loro bassa viscosità e ad alta tensione di vapore, questi reagenti può gocciolare da un puntale durante il trasferimento. Ridurre al minimo la perdita di reagente e potenziale esposizione tenendo la soluzione di riserva adiacente alla nave ricevente. - Trasferire un volume totale sufficiente di iodomethane ad una piccola provetta pulita. Ogni campione analita richiederà 105 iodomethane ml. Trasferimento ~ 500 microlitri diclorometano in anothER provetta pulita. Per evitare che la siringa intasamento, lavare la siringa con diclorometano subito dopo il trasferimento iodomethane.
Attenzione: Iodometano è fotosensibile, volatile, e potente tossina in grado di danneggiare il sistema nervoso centrale o causare la morte se inalato o ingerito. Diclorometano è un potenziale cancerogeno, mutageno riproduttiva e potente irritante in grado di danneggiare diversi organi o causare la morte. - Utilizzare una siringa per analitica di aggiungere 105 microlitri iodomethane ad ogni campione da analizzare. tubi analiti Cap immediatamente per ridurre al minimo l'evaporazione iodomethane. Completamente vortice e, se necessario, centrifugare brevemente tutti i campioni per assicurare che rimanga liquido nel cappuccio. Qualsiasi cambiamento di colore (ad esempio, al marrone, viola o giallo) segnala il degrado iodometano, che possono mettere in pericolo la seguente reazione permethylation.
- Sciacquare la siringa analitico utilizzato per trasferire iodomethane con diclorometano almeno 3 volte. Questo gli impedirà from intasamento. Smaltire questo risciacquo, insieme a iodomethane supplementare e diclorometano in un vaso di rifiuti pericolosi organici. Posizionare provette utilizzate in un contenitore per rifiuti pericolosi.
- Ottenere una nuova serie di tubi di serbatoio in plastica da 2 ml. Rimuovi snap-caps se lo si desidera.
- Staccare i filtri microcentrifuga mini. Centrifuga le colonne scollegato per 15 sec a 2.400 × g, e poi scarta i tubi del serbatoio con l'effluente DMSO.
- Re-inserire le colonne di spin centrifugati, e metterli dentro i nuovi tubi serbatoio. Numero Ciascuna colonna e il suo tubo serbatoio corrispondente con lo stesso numero del campione. Assicurarsi che i mini spine di filtro sono stretti; perdita potenziale può avere un impatto il passo successivo. Minimizzare il tempo tra la rimozione DMSO dalle colonne di rotazione e di trasferimento dei campioni analiti sulle colonne di rotazione.
- Permethylation
- Trasferire quantitativamente ogni soluzione campione al suo corrispondente NaOH-bead-riempita microcentrifuga rotazione colonna. Utilizzare una punta della pipetta 1000 microlitri per questo passo. Dopo il trasferimento, crimp ~ 2 mm l'estremità di una punta 200 microlitri e lasciare nei contenuti della colonna da utilizzare come agitatore. Ripetere l'operazione per tutti i campioni.
Nota: La bassa viscosità di iodomethane può causare la perdita di esempio perché la soluzione analita può gocciolare dalla punta della pipetta durante il trasferimento. Tenere il tubo campione e la colonna di spin adiacente all'altro con una mano, e trasferire rapidamente la soluzione campione con l'altra mano. - Lasciare che la reazione permethylation di procedere per 11 min. Mescolare ogni campione almeno 4-5 volte durante questo periodo. Per facilitare permethylation efficiente, che si verifica in corrispondenza della superficie di perline NaOH, utilizzare punte gel-loading pipette tip-crimpato come agitatori per miscelare delicatamente il contenuto della colonna. miscelazione aggressivo può forare il filtro rotativo, polverizzare e sospendere perline NaOH (che può ridurre l'efficacia di successivi / estrazione liquido-liquido), e / o causare la perdita del campione (come sample intriso di granuli NaOH possono traboccare dalla colonna).
- In preparazione per la successiva fase di estrazione liquido / liquido, preparare una quantità sufficiente di M cloruro di sodio (NaCl) soluzione 0,5 in un tampone fosfato 0,2 M di sodio (pH 7,0), per essere conservati a temperatura ambiente. Ogni campione richiede un totale di ~ 12 ml di soluzione NaCl per tutti e tre cicli di estrazione liquido / liquido.
- Al termine del periodo permethylation 11-min, subito ancora scollegare attentamente le colonne e centrifugare per 15 secondi a 2400 × g. Eliminare le spine.
- Trasferire quantitativamente ogni soluzione campione al suo corrispondente NaOH-bead-riempita microcentrifuga rotazione colonna. Utilizzare una punta della pipetta 1000 microlitri per questo passo. Dopo il trasferimento, crimp ~ 2 mm l'estremità di una punta 200 microlitri e lasciare nei contenuti della colonna da utilizzare come agitatore. Ripetere l'operazione per tutti i campioni.
- Rimuovere immediatamente le colonne di spin dalla centrifuga e metterli in una nuova serie di tubi di spin serbatoio vuoto, lasciando la soluzione a flusso continuo contenente glicani appena permethylated dietro. Non gettare nulla.
- Non appena possibile, aggiungere 300 ml acetonitrile (ACN) per i secchi, i filtri di spin NaOH-riempite. Centrifugare i filtri di rotazione per 30 sec a 9.600 × g.
- immediately successivamente, trasferire la soluzione permethylation principale (cioè, la soluzione che è stato incubato con le perline NaOH per 11 min quindi filata attraverso il filtro rotativo in un tubo da centrifuga prima dell'aggiunta di 300 ml di ACN nel passaggio precedente) per silanizzato 13 x provette di vetro 100 mm 42 contenente 3,5 ml di 0,2 M tampone di fosfato di sodio contenente 0,5 M NaCl, pH 7.0 e mescolare (vortex) immediatamente. Evitare il trasferimento di qualsiasi residuo solido bianco durante questa fase. Fate questo per ogni campione prima di procedere alla fase successiva.
- Senza ritardo, trasferimento (combinare) ACN spin attraverso ciascun tubo serbatoio per (con) il resto del campione liquido nella rispettiva tubo di vetro silanizzato e miscelare (vortex) immediatamente. Anche in questo caso, evitare di trasferire qualsiasi residuo solido bianco durante questa fase. Cap, scossa, e vortex il tubo di vetro. Ripetere l'operazione per ogni campione. Eliminare le colonne NaOH e pipette Pasteur in appositi contenitori per rifiuti.
- Liquido / liquido Extraction e Glycan Purificazione
- All'interno della cappa, aggiungere 1,2 ml di cloroformio per ogni campione. Subito dopo, tappare i tubi di vetro silanizzato e vigorosamente mescolare il contenuto.
- Pre-calore blocchi di metallo a circa 75 ° C in un collettore di evaporazione. Utilizzare blocchi di riscaldamento con i pozzi che possono ospitare i 13 mm × 100 mm tubi di vetro.
- Ottenere una nuova serie di pipette silanizzati Pasteur, pipette Pasteur non silanizzati, e provette di vetro silanizzata con tappi.
Attenzione: Cloroformio (CHCl 3) è un irritante, mutageno, cancerogeno e potenziale in grado di permeare attraverso alcuni tipi di guanti. - Centrifugare brevemente (~ 3.000 × g) tubi di vetro contenenti campioni per separare gli strati acquosi e organici.
- Utilizzare una pipetta Pasteur silanizzata non per estrarre sufficiente dello strato acquoso superiore tale che ~ 3 mm di strato acquoso rimane sopra lo strato organico inferiore.
- Aggiungere 3,5 ml di 0,5 M Nasoluzione Cl in tampone fosfato 0,2 M di sodio (pH 7) a ciascuna provetta di vetro, vigorosamente mescolare e centrifugare brevemente (~ 3000 × g). Come nel passaggio precedente (1.4.3), utilizzare una pipetta Pasteur silanizzata non per estrarre lo strato acquoso.
- Ripetere il passaggio precedente (1.4.4), ma lasciare ~ 1 ml di strato acquoso.
- Utilizzare un pulito silanizzata pipetta Pasteur per trasferire lo strato organico ad una provetta di vetro silanizzata mm pulita e adeguatamente etichettati 13 × 100. Evitare la contaminazione acquosa estraendo nel modo seguente:
- Tenere entrambe le provette di vetro silanizzato attuali e nuovi adiacenti gli uni agli altri in una mano. Con l'altra mano, premere il bulbo della pipetta per creare bolle durante l'inserimento della pipetta giù attraverso lo strato acquoso.
- Una volta dentro lo strato organico, fermare la creazione di bolle, e tenere la lampadina pipetta costante per consentire gli strati organici e acquosi per stabilizzare e separare di nuovo. Poi, lentamente, rilasciare il bulbo di ritirare la maggior quantità di organic livello possibile, senza alcuna contaminazione acquosa.
- Rapidamente sollevare la punta della pipetta attraverso lo strato acquoso, e resistere alla riflesso naturale del rilasciando leggermente la lampadina (che si traduce in ritiro qualche contaminazione acquosa), aumentando nel contempo la pipetta dal tubo.
- Rapidamente trasferire lo strato organico a bassa viscosità per il nuovo tubo adiacente. Qualsiasi contaminazione acquosa sarà visibile come piccole gocce di liquido sulla parte superiore dello strato organico estratto in nuove provette di vetro. Se acquosa / contaminazione NaCl è visibile, rimuoverla con una pipetta; centrifugare, se necessario, di mettere in comune le goccioline acquose in una singola goccia.
- Smaltire di tubi vecchio vetro, pipette e aromatiche e soluzioni rifiuti organici. Lavare e riciclare tappi tubo di vetro.
- Essiccare tutti i campioni sotto un flusso delicato e costante di azoto in un collettore di evaporazione preriscaldato a 75 ° C per 5 min ~ all'interno di una cappa aspirante. Per garantire un raffreddamento per evaporazione durante tutte ste secca-downps, un flusso delicato e costante dell'azoto deve disturbare la superficie del liquido senza spruzzi o schizzi liquido. Rimuovere campioni dal collettore di evaporazione sulla completa asciugatura del campione finale. macchie bianche sul fondo di un tubo di vetro secchi indicano tampone / contaminazione NaCl.
- Pausa la procedura qui se non c'è abbastanza tempo rimanente nel corso della giornata per completare il passaggio di idrolisi TFA. Temporaneamente (vale a dire, durante la notte) conservare i campioni a secco a -20 ° C. Per continuare la procedura dopo il magazzinaggio, rimuovere i campioni dal congelatore a -20 ° C e consentire loro di riscaldare completamente prima di togliere il cappuccio.
- Mentre i campioni calda, in preparazione per l'acido trifluoroacetico (TFA) idrolisi (fase successiva), impostare il mantello riscaldante tale che la temperatura del contenuto provetta liquidi raggiungerà 121 ° C. Preparare la soluzione TFA TFA da magazzino (vedi punto 2.1 qui di seguito).
2. trifluoroacetico Acid (TFA) idrolisi
3. Riduzione 4. acetilazione (eseguita in un Cappa aspirante) 5. gascromatografia - spettrometria di massa (GC-MS) Analisi 6. Dati
Attenzione: boroidruro di sodio (NaBH4) è una, la tossina idroreattivo igroscopico e potente irritante che rilascia-upon contatto con i vapori di acqua altamente infiammabile che causano gravi ustioni al contatto inalazione, ingestione, o gli occhi / pelle.
Attenzione: idrossido di ammonio (NH 4 OH) è un irritante corrosivo e la tossina in grado di provocare gravi ustioni e danni d'organo irreversibili al contatto inalazione, ingestione, o gli occhi / pelle. Lavare l'area interessata con acqua per 30 minuti, e impedire che la vittima da sfregamento o graffiare le zone colpite.
Nota: Per distinguere bolle d'aria dalla goccioline liquide, inclinare la provetta. Solo goccioline liquide si muoveranno dopo inclinando, ma il contrario non è sempre vero: se una bolla non si muove, può ancora essere un (molto piccola) goccia di liquido.
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Representative Results
Un cromatogramma corrente ionica totale (TIC) mostrando permethylation successo, idrolisi, riduzione e acetilazione dei campioni di plasma umano rispetto ai casi in cui sono state eseguite correttamente due passi permethylation critici sono mostrati in Figura 3.
Assoluta Resa HexNAcs relativa a esosi:
N -acetylhexosamine (HexNAc) acetati alditolo parzialmente metilati (PMAAs) tendono ad avere rendimento inferiore rispetto esosi. 43 Per stimare il rendimento assoluto di HexNAcs rispetto al esosi, sei campioni di 10 mg di N -acetyllactosamine (un disaccaride Gal1-4GlcNAc) in sono stati analizzati 10 ml di acqua. aree dei picchi TIC per galattosio terminale (t-Gal) e 4-GlcNAc sono stati integrati. La percentuale di 4-GlcNAc rispetto alla quantità totale di t-Gal e 4-GlcNAc era 11,3 ± 0,7%(SEM). Sebbene rese HexNAc sono riproducibili (vedi sotto), il fatto che questo valore è molto inferiore al valore teorico di 0,5 indica che la resa di HexNAcs è fondamentalmente inferiore a quella di esosi. (La resa teorica HexNAc è 0,5 perché N -acetyllactosamine è un 1: 1. Esoso-HexNAc disaccaride)
Intra e interseriale riproducibilità:
Intra e riproducibilità interdosaggio per tutti i nodi glycan che contribuiscono almeno l'1% del totale esoso o il segnale HexNAc sono riportati nella Tabella 1. Questi dati sono stati acquisiti da 3 analisti separati su 3 giorni separati, utilizzando lo stesso magazzino di plasma EDTA. Dati di stabilità Autosampler ai sensi del presente protocollo ottimizzato per i 18 più abbondanti nodi glycan nel plasma umano (cioè quelli con> 1% del totale esoso o il segnale HexNAc) sono forniti in Figura 4.
Altre osservazioni degni di nota:
Mentre ottimizzare la metodologia permethylation, abbiamo scoperto che non è necessario per evitare assorbimento di acqua dalle perline NaOH Prima della messa lavaggio con acetonitrile. Abbiamo anche trovato che la presenza di una piccola quantità di acqua durante la fase finale di acetilazione in combinazione con un breve periodo di riscaldamento con anidride acetica senza TFA contribuisce a facilitare reazione completa. Infine, la potenza ad alta risoluzione del tempo di volo (TOF) spettrometria di massa non è necessaria per il successo dei nodi glicani: risultati iniziali basate sull'iniezione parallelo lo stesso set di campioni su un GC-TOF-MS e un quadrupolo trasmissione tradizionale basata su GC-MS operato nel monitoraggio ionico selezionato il modo (SIM) dimostrare risultati simili in termini di esoso normalizzato finale e HexNAc abbondanze relative.
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. Figura 1. Panoramica molecolare della procedura glycan globale di analisi della metilazione Un O -linked glycan è illustrata; questi vengono rilasciati durante il processo permethylation, che è stato adattato da Goetz. 40 Dopo permethylation e all'idrolisi, monosaccaridi sono ridotti e gruppi ossidrilici nascenti "contrassegnati" di acetilazione. Il modello unico di metilazione e l'acetilazione in finale acetati alditolo parzialmente denaturato (PMAAs) corrisponde alla unico "nodo glycan" nel polimero intatto originale e fornisce le basi molecolari per la separazione e la quantificazione mediante GC-MS. N linked e glicani glicolipidiche vengono rilasciati come monosaccaridi linkage-marcato durante la idrolisi acida. Adattato da Borges et al. 33 con il permesso.> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. panoramica concettuale del concetto analitico. Un glycosyltransferase upregulated (ad esempio, GnT-V) provoca un aumento della quantità di uno specifico residuo di monosaccaride glicani, legata in modo univoco (a Mannosio "nodo" 2,6-linked in questo esempio) -che, attraverso la successiva azione di altri glicosiltrasferasi, può portare alla formazione di una miscela di strutture integrali glycan eterogenee low copy number each-ognuno dei quali può essere difficile da rilevare e quantificare in modo di routine. Analiticamente riunendo insieme i "nodi" da glycan tra tutte le strutture glycan aberranti fornisce una misura surrogata più diretto di attività GnT-V rispetto a qualsiasi singolo glycan intatti. La misurazione simultanea di N - O -, e dei lipidi legati "GLYC un nodi "in campioni biologici interi come descritto qui (e in origine altrove 33) rappresenta un concettualmente romanzo mezzo per rilevare e monitorare le malattie glycan-affettivi, come il cancro. effettivi cromatogrammi ionici estratto da campioni di plasma sanguigno di 10 microlitri indicati. I numeri adiacenti residui monosaccaridi in strutture glicani indicano la posizione in cui il residuo più elevato è legato al residuo inferiore. Se posizioni linkage sono indicati nella nota cromatogramma residuo è nella posizione terminale o liberi in soluzione (ad esempio, glucosio). Tutti i residui . eccezione collegamento acido sialico verso il basso attraverso la loro posizione 1; link di acido sialico verso il basso attraverso il suo 2 posizioni diviso in cromatogramma indica cambiamento cromatogrammi ionici estratti: m / z 117 129 per i residui esosi e m / z 116 + 158 per N - acetilesosamina (HexNAc) residui. Adattato da Borges et al. 33 con il permesso.61 / 53961fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Risultati rappresentativi. Ionici totale cromatogrammi attuali (alle TIC) per l'analisi dei nodi glycan dello stesso campione di sangue EDTA plasma umano in cui A) il campione è stato elaborato correttamente, B) il residuo bianco nella soluzione permethylation che è stata filata attraverso il NaOH colonna fu portato nella successiva miscela per estrazione liquido / liquido, e C) la soluzione permethylation che è stata filata attraverso la colonna NaOH è stato aggiunto al tampone fosfato ma non miscelato accuratamente prima dell'aggiunta di cloroformio per estrazione liquido / liquido. Leggenda fornito nella Figura 2. Cliccate here per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. stabilità campionatore di stabilità. Autosampler più di 48 ore per i 18 più abbondanti nodi glycan nel plasma umano. A 22 ore il campione è stato completamente asciugato e ricostituito in 120 microlitri di acetone. Ogni gruppo di punti di dati rappresenta quattro iniezioni consecutive dello stesso campione. Le linee nere comprendono ± 15% del valore medio normalizzato per ogni nodo glicani. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. intra e riproducibilità interassay. I valori rappresentano% CV di esoso totale o HexN totaleAc-normalizzati singoli nodi glycan. Sono elencati tutti i nodi glycan contribuiscono almeno l'1% del totale esoso o il segnale HexNAc. I dati sono stati acquisiti da 3 analisti separati su 3 giorni separati, utilizzando lo stesso magazzino di plasma EDTA. N = 6 campioni per partita. Clicca qui per scaricare questa tabella come un foglio di calcolo di Excel.
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Discussion
In generale, la produzione di successo di acetati alditolo parzialmente denaturato (PMAAs) da esosi è irto di difficoltà meno ed è più robusto rispetto alla produzione di successo di N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. L'esatto meccanismo dietro questo fenomeno in quanto svolge in ogni fase di questa procedura è sconosciuta, ma deve riferirsi alla chimica unica del gruppo acetil N (anziché gruppo ossidrile) che è unico per HexNAcs rispetto al esosi. Il meccanismo dietro questo fenomeno si riferisce ad idrolisi acida è spiegato altrove. 43 In breve, la capacità per il -methylacetamido N diventi carica positiva durante l'idrolisi acida rende resistente all'idrolisi acida legame glicosidico. Questo spiega la bassa resa di HexNAc rispetto al esosi (11,3% del totale del segnale HexNAc + esoso, piuttosto che il 50% del totale) come descritto sopra per l'analisi di N -acetyllactosamine. In particolare, questo relativamente lotenza resa HexNAcs non li rende difficili da individuare in biofluidi e tessuti complessi, o precludere il rilevamento facile dei nodi glycan derivati da grandi, glicani complessi (ad esempio, 2,4-Man, 2,6-Man, 3,4,6 -Man, e 3,4-GlcNAc, Figura 2). 33 Dato il modo in cui XIC aree dei picchi nodi glicani sono normalizzati (passo 6.3), finché la resa relativa di ogni singola HexNAc rimane relativamente costante ad altre HexNAcs ( cosa che fa, vedi Tabella 1), utili informazioni sulle quantità relative dei vari HexNAcs tra diversi campioni possono essere ottenuti. Questo vale per esosi pure. Inoltre, abbiamo già dimostrato che i rapporti di esosi a HexNAcs mostrare un comportamento coerente quantitativa e 33 - un fenomeno che viene continuamente monitorato tramite incorporazione di QC campione (s) in ogni lotto.
Il modo in cui viene eseguita permethylation ha il maggiore impatto sullail rendimento complessivo e la riproducibilità di HexNAc PMAAs. In particolare, grande attenzione dovrebbe essere presa al fine di evitare completamente l'esposizione di glicani permethylated ad alcalino condizioni acquose. Due passaggi fondamentali a tale riguardo sono 1) lasciando tutto precipitato bianco nelle soluzioni attraverso spin-dietro (Procedura 1.3.13 e 1.3.14), e 2) immediatamente miscelazione delle soluzioni di spin-through una volta che vengono aggiunte al tampone fosfato ( passi 1.3.13 e 1.3.14). Un buffer piuttosto semplice soluzione salina è incluso in questa fase e per le successive fasi liquido / estrazione liquido per prevenire alcalinizzazione involontaria della soluzione acquosa. Abbiamo il sospetto che in condizioni alcaline gruppo acetile del gruppo 2-ammino metilato e acetilata HexNAcs può subire idrolisi, con conseguente un'ammina secondaria più polare che diminuisce l'efficienza di estrazione complessiva del glycan associato in cloroformio.
La caratteristica più facilmente riconoscibile di HexNAcs senza successo permethylated èl'intensità del GlcNAc 4-linked (4-GlcNAc) cromatografico picco relativo a quelli di 6-Gal, 3,6-Man, e l'intensità di base dello sfondo durante finale colonna bake-out (Figura 3). Quando l'abbondanza assoluta del 4-GlcNAc PMAA è basso, la sua abbondanza normalizzata rispetto a tutti gli altri HexNAcs tende ad essere bassa, con un concomitante aumento (più evidente) di 3,4-GlcNAc.
Alcuni cambiamenti progettati per ottimizzare la robustezza complessiva resa e test sono stati fatti dal nostro prima pubblicazione descrive questo approccio analitico 33 Uno di questi cambiamenti è il modo in cui i cromatogrammi ionici estratti integrati (XICs) sono normalizzati. Per semplicità, ora dividere l'area di ogni singolo XIC esosi dalla somma di tutte le aree esoso XIC; analogamente, l'area di ogni individuo HexNAc XIC è diviso per la somma di tutte le aree HexNAc XIC. Come si vede nella tabella 1, interassay generale / inter-analista reproducibillità per tutti i nodi glycan che contribuiscono a> 1% dei rispettivi esosi o HexNAc segnale in media il 13% CV.
A nostra conoscenza, questa è l'unica incarnazione di glicomica realmente bottom-up, in cui glicani sono dapprima ripartiti e poi loro componenti analizzate per costruire un ritratto quantitativa a livello di campione della composizione glycan. Qui, invece di rilascio enzimatico tradizionale, il processo permethylation elimina non riduttivamente (stampa) O glicani linked dalle rispettive proteine, 40 mentre N -linked glicani vengono rilasciati durante l'idrolisi acida. 33 Come approccio complementare alla tradizionale glycomics top-down , questo approccio è in grado di mettere in comune le caratteristiche uniche glycan di interesse come "fucosilazione core", "6-sialylation", "bisettrice GlcNAc", e "beta 1-6 ramificazione" in segnali analitici singoli (vedi, 4,6-GlcNAc , 6-Gal, 3,4,6-Man e 2,6-Man nodi in figura 2, faucibusctively). Negli approcci top-down tradizionali, caratteristiche come queste che alla fine dipendono dalle attività uniche di uno o due glicosiltransferasi principali 33 sono tipicamente distribuiti in decine di glicani intatti e possono a volte essere difficile o impossibile da risolvere (ad esempio, 3-sialylation vs. 6-sialylation) a causa della degenerazione di alcune masse glycan intatte. Inoltre, l'approccio bottom-up qui presentata ha dimostrato promessa iniziale nel rilevare in modo non invasivo il cancro ai polmoni. 33 Ulteriori studi sono in corso per convalidare questi risultati iniziali, così come risultati non pubblicati supplementari, ma relativi alla rilevazione di altre forme di cancro.
Il limite maggiore dell'approccio qui descritto è che esso è vincolato in termini di limiti di rilevamento, se dovesse essere applicato glicoproteine pre-isolate. Sulla base delle analisi inedite di singole norme glycan senza proteina carrier, limiti di quantificazione foR singoli glicani sembrano essere comprese nella banda microgrammi basso. Questi sono affatto bassi LOQ in termini assoluti, ma questo fatto non importa quanto riguarda l'ambito originariamente previsto del saggio-che non è stato progettato per e non ha bisogno di ottenere basse LOQ (almeno per gli scopi descritti qui e nella nostra precedente pubblicazione 33). Infatti, plasma umano / siero contiene glicoproteine nelle 10s di concentrazione mg / ml gamma-senso che per l'analisi delle plasma / siero abbiamo solo iniettare ~ 1/100 del volume campione finale e dividere 40 di 41 parti di che piccole quantità di rifiuti nel porto GC iniettori. Senza questa pratica, alcuni dei nodi glicani possono saturare il rivelatore. quantità picomole di glicoproteine in grado di produrre adeguati segnali glycan intatti dal convenzionale top-down approcci basati MALDI-MS o LC-MS non possono essere rilevate con questo approccio. Ulteriore affinamento della metodologia è in corso per porre rimedio a questa limitazione.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium hydroxide beads | 367176 | Sigma-Aldrich | 20-40 mesh, reagent grade 97% |
| 0.9 ml Spin column | 69705 | Pierce division of ThermoFisher Scientific | Includes plugs and polyethylene frits |
| GC-MS autosampler vial (silanized)* | C4000-9 | ThermoFisher Scientific | Target DP High Recovery Vial, 1.5 ml, 12 mm x 32 mm, includes Teflon-lined pierceable caps |
| 1.5 ml polypropylene test tubes | 05-402-25 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
| 2 ml polypropylene test tubes | 05-408-138 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D8418 | Sigma-Aldrich | BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0% |
| Iodomethane | I8507 | Sigma-Aldrich | Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99% |
| Acetonitrile | A955-4 | ThermoFisher Scientific | Optima LC/MS |
| Microcentrifuge | 75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424 |
| 13 x 100 glass test tube (silanized)* | 53283-800 | VWR | 13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish |
| Caps for glass test tubes | 14-930-15D | ThermoFisher Scientific | Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13 mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner. |
| Sodium chloride | S7653 | Sigma-Aldrich | >99.5% pure |
| Chloroform | 4440-08 | Macron Fine Chemicals | |
| Trifluoroacetic acid | 299537 | Sigma-Aldrich | 99% purified by redistillation for protein sequencing |
| Sodium borohydride | 71321 | Fluka Analytical | 99% |
| Ammonium hydroxide solution | 320145 | Sigma-Aldrich | NH3 content: 28.0-30.0% |
| Methanol | AH230-4 | Honeywell Burdick & Jackson | HPLC grade |
| Acetic acid | 320099 | Sigma-Aldrich | 99.70% |
| Plastic vacuum desiccator | Any model of adequate size | FoodSaver | |
| Acetic anhydride | 539996 | Sigma-Aldrich | 99.50% |
| Dichloromethane | D143SK-4 | ThermoFisher Scientific | Stabilized HPLC grade |
| Acetone | 9006-03 | J.T.Baker | Baker Analyzed |
| Heated evaporation manifold (main unit) | pi18823 | ThermoFisher Scientific | Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function |
| Heated evaporation manifold (overhead evaporator) | pi18826 | ThermoFisher Scientific | ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module |
| Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold | pi18816 | ThermoFisher Scientific | Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13 mm dia test tubes, 13 holes (14 mm dia. x 45 mm deep) |
| Gas chromatograph | Model A7890 | Agilent | Equipped with CTC PAL autosampler |
| Mass spectrometer | GCT Premier (Time-of-Flight) | Waters | |
| Split-mode liner (deactivated / silanized) | 5183-4647 | Agilent | Containing a small plug of silanized glass wool |
| DB-5ms GC column | 122-5532 | Agilent | 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness |
| Chlorotrimethylsilane | 95541 | Sigma-Aldrich | |
| Glass vacuum desiccator (for glassware silanization) | EW-06536-30 | Cole-Parmer | 12" wide; 230 mm plate size |
| *Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator. | |||
References
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