Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Glycan Node analyse: En bottom-up tilnærming til glycomics

Published: May 22, 2016 doi: 10.3791/53961
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, The Biodesign Institute – Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Introduction

Glykolipider, glykoproteiner, proteoglykaner og glykosaminoglykaner utgjør de fire hovedklasser av komplekse, heterogene karbohydrater kollektivt kjent som glykaner. Som allestedsnærværende og integrerte komponenter av plasmamembranen, glycocalyx, og ekstracellulær matriks og væsker, glykaner delta i slike forskjellige biokjemiske prosesser som endocytose, intracellulær handel, celle motilitet, signaltransduksjon, molekylær gjenkjennelse, reseptoraktivering, celleadhesjon, vert-patogen interaksjon , inter kommunikasjon, immunosurveillance, og immunrespons innvielse. 1 Tilstede i nesten hvert domene for livet, enzymer som kalles glycosyltransferases som bygger sukker polymerer handle i tandem med glycoside hydrolaser (også kjent som glycosidases, som bryter ned glykaner) for å konstruere, oppussing, og til slutt produserer ferdigstilt sukker polymerer 2. Selv om hver glykosyltransferase kan operere på forskjellige glycoconjugates, en glykosyltransferasevanligvis ildfaste en linkage- og anomer-spesifikke glykosidbinding ved overføring av monosakkarid-delen av en spesiell aktivert nukleotid-sukkerdonor (f.eks, GDP-fucose) til en bestemt kategori av nukleofile akseptorer (f.eks, et lipid, polypeptid, nukleinsyre, eller vokser oligosakkarider). Det har blitt anslått at mer enn 50% av proteiner (spesielt membran og sekretoriske proteiner) er post-translatorisk modifisert ved glykosylering 3 Rudimentære kombinatoriske beregninger gi en forståelse for den betydelige variasjon, allsidighet og spesifisitet tilstås glykoproteiner av glykosylering.; for eksempel, hvis et polypeptid substrat har bare 10 glykosyleringsseter, og hvert område kan danne en glykosidisk binding med en av bare tre forskjellige monosakkariden reduserende ender, da, teoretisk sett, den endelige glykoprotein kan anta 3 10 = 59049 forskjellige identiteter. I glykoproteiner, glykosidiske bindinger som vanligvis dannes med en sidekjede nitrogen of asparaginrester i sekvensen Asn-X-Ser / Thr (X kan være enhver aminosyre bortsett fra prolin), hvilket ga N -glycans 2 og sidekjede hydroksyler av serin og treoninrester, hvilket ga O -glycans 4. Sammensetningen av en celle glycome (dvs. dens komplement av glykolyseringsmetoder produkter) er unikt og begrenset fordi, med få unntak, glycosyltransferases stille strenge donor, akseptor, og sammenhengen spesifisitet. 5 viktige og rikelig blodplasma glykoproteiner lider avvik glykosylering som en nedstrøms konsekvens av unormal glykosyltransferase-ekspresjon og aktivitet på grunn av mange patologiske tilstander, spesielt cancer og inflammatoriske sykdommer. 6-24

Hovedsakelig på grunn av epigenetiske faktorer, er det glycome betydelig mer mangfoldig, dynamisk og komplekst enn proteomet og transkriptom. 25,26 Mens ca 1% av pattedyr genom koder formasjonen, modifikasjon, ogmontering av glykaner, for 27 glykosylering forløper i et ikke-mal-drevet måte-en markert kontrast polypeptid og nukleinsyre biosyntese. Samspillet mellom den relative mengde og aktivitet av glykolyseringsmetoder enzymer og slike miljøfaktorer som næringsstoff og forløper tilgjengelighet til slutt bestemmer innholdet, hastighet og omfanget av glykosylering. 5,28 embryogenese (f.eks, besluttsomhet og differensiering), cellulær aktivering og progresjon gjennom cellecyklusen innflytelse genekspresjon (dvs. transkripsjon og translasjon) og endre identiteten og mengden av tilgjengelige glycosyltransferases, hvis aktivitet er den umiddelbare oppstrøms determinant av cellens glykan profil. Fordi (noen av) den proliferative, lim og invasive egenskapene til kreftceller likne de ordinære embryoceller, konkrete endringer i sukker biosyntetiske baner (f.eks forløper akkumulering, deregulert uttrykk, aberrant modifikasjon, strukturelle trunkering, eller roman dannelse) tjene som universelle kreft biomarkører som indikerer ulike stadier av tumordannelse, progresjon, migrasjon og invasjon 29 Selv om glykosylering er svært sammensatt, tydeligvis bare noen få endringer i glykosylering kan aktivere kreftutvikling og metastasering.; tilsynelatende, visse "avvikende" glykolyseringsmetoder produkter faktisk nytte kreftceller ved å sette dem i stand til å unngå immun anerkjennelse og overleve kravene til migrasjon i ugjestmilde intravaskulære og metastatiske miljøer. 28,30,31 Ikke overraskende har eksperimenter vist at å forstyrre eller hindre mønstre endret genekspresjon og avvikende sukkerdannelse kan stoppe tumorigenesis. 29 Likevel, avvikende glykaner påvist i en biofluid prøve (f.eks, urin, spytt og blod plasma eller serum) er kanskje ikke direkte indikatorer på kreft (eller en annen sykdom), men heller nedstrøms resultatene av subtile ennå betydeligendringer i immunsystemet eller målbare konsekvenser av en skadelig tilstand i en uforutsigbar organ. 32

Selv om de gir universell informasjon om glycome, mange molekylære interaksjonsbaserte glycomics teknikker (f.eks lectin / antistoff arrays og metabolsk / kovalente merking) avhengig av påvisning av hele sukkerstrukturer og gir ikke detaljert strukturell informasjon om de enkelte glykaner. I sterk kontrast, kan massespektrometri (MS) bidra til å identifisere og kvantifisere enkelte sukkerstrukturer og avsløre slike strukturinformasjon som feste områder til polypeptid kjerner. Deregulert uttrykk eller aktivitet av bare en glykosyltransferase kan sette i gang en kaskade av skadelige molekylære hendelser i flere glykosylering veier. Fordi hver glykosyltransferase kan operere på mer enn én glykokonjugat underlaget og på tvers av ulike voksende sukker polymerer, deregulerte biosyntetiske kaskader gi dispropornalt økte mengder bare en sukker produkt, men flere heterogene klasser av avvikende glykaner i intra- eller ekstracellulære væsker. 33 Men slike unike avvik glykaner er ofte ansett upraktisk som biomarkører for kreft eller andre sukker-affektive sykdommer fordi, i forhold til det store bassenget av velregulert glykaner, disse avvikende glykaner representerer en svært liten andel som kan ofte være umulig å oppdage selv av slike svært sensitive teknikker som massespektrometri. For eksempel, i intra- og ekstracellulære kroppsvæsker, kan den brede proteinkonsentrasjon-spektrum (som spenner over åtte størrelsesordener) forhindre deteksjon av knappe glykoproteiner som er maskert av de mer vanlige arten. 32 Videre bestemmelse av glykosyltransferase-aktivitet fortsatt en betydelig praktisk og teoretisk utfordring fordi mange glycosyltransferases er fraværende i kliniske biofluids eller blir inaktive ex vivo. Til tross for vanskelighetene med consistently oppdage og kvantifisere ultra-ørsmå mengder av unike hele glykaner, er utøvere av massespektrometri gjort enorme framskritt mot å ansette intakte glykaner som kliniske markører. Vi har nylig utviklet en komplementær tilnærming til analyse av intakte glykaner som, ved anvendelse av GC-MS, letter påvisningen av alle bestand gren-punkt og koblings-spesifikke monosakkarider ( "glykan noder") som sammen bibringe unikhet til hver glykan og i mange tilfeller direkte tjene som molekyl surrogater som kvantifiserer den relative aktivitet av skyldig glykosyltransferase (r).

Siden sin første rapporterte direkte søknad til sukkeranalyse i 1958, har gasskromatografi (GC) påvist en kraftig teknikk for å analysere per-metylert mono- og disakkarider, 34 bestemme sin anomericity og absolutt konfigurasjon, og skille dem for senere massespektrometrisk analyse. 35 mellom 1984 og 2007, Ciucanu og kollegerinnført og raffinert en fast-fase glykan permethylation teknikk som benyttes natriumhydroksid og jodmetan, etterfulgt av væske / væske ekstraksjon av permethylated glykaner med vann og kloroform. 35,36 Mellom 2005 og 2008, Kang og medarbeidere integrert en tidsbesparende spin -column tilnærming inn i permethylation trinn. 37,38 i 2008 Goetz forskergruppen utviklet en kvantitativ fast-fase permethylation glykan-profilering metode med matrise-assistert laser desorpsjon-ionisering (MALDI) massespektrometri for å sammenligne og potensielt skille invasiv og non -invasive brystkreft celler, 39 da, i 2009, Goetz teamet kombinert enzymatisk og kjemiske utslipp teknikker for å spalte O -glycans fra intakte glykoproteiner i en svært alkalisk fast-fase permethylation ordningen 40 Selv om Goetz prosedyren kles samtidig permethylation og kjemisk utgivelse. av O -glycans, ble det bare brukt på pre-isolerte glycoproteiner. Vi endret denne teknikken i 2013 og tilpasset den for hele ufraksjonerte biofluids og prøver homogenis vev ved å innlemme trifluoreddiksyre (TFA) hydrolyse, reduksjon, og acetylering trinn. 33 Disse ekstra trinn også frigjøre glykaner fra glykolipider og N -bundne glykaner fra glykoproteiner og konvertere dem inn i delvis metylert alditol acetater (PMAAs, figur 1), hvis karakteristiske metylering-og-acetylering mønstre lette analyse ved GC-MS og entydig kjennetegner de konstituerende glykan nodene i den opprinnelige intakte glykan polymer 41 (figur 2). 33 til slutt, denne Fremgangsmåten måten~~POS=HEADCOMP frembringer en sammensatt portrett av alle glykaner i et kompleks biofluid basert på direkte, relativ kvantifisering av unike glykan funksjoner som "kjerne fucosylation", "6-sialylering", "halverer GlcNAc", og "beta 1-6 forgrening" - hver avledet fra en enkelt GC-MS Chromatogrhic topp. Denne artikkelen presenterer ytterligere optimalisering av permethylation, acetylering, isolasjon og oppryddings etapper sammen med forbedringer i modus for relativ kvantifisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsiktig: Unngå hud / øyekontakt med en hvilken som helst av de reagenser som brukes i dette eksperimentet. Ved eksponering, grundig skylle det berørte området med vann og kontakt lege med en gang.

1. Permethylation og Glycan Extraction

  1. kolonne Forberedelse
    1. Få så mange mikrofuge spinnkolonne heter som prøvene som skal analyseres. Bryt og ta av plastbeholderen pipe cap. Plasser en mikro mini filter i hvert reservoar rør. Plasser de monterte mikrofugerør spin kolonner (som inneholder mini filter) i en mikro tube rack.
    2. Skaff et lager av natriumhydroksid (NaOH) perler (20-40 mesh). Overføre noen NaOH til en liten veie båt eller, hvis fuktighet forårsaker klumper, en varm porselen mørtel som arbeids lager av NaOH. Unngå å bruke klumper av NaOH eller knust / pulverisert NaOH perler.
      Forsiktig: NaOH er en potent toksin og etsende basen. Skyll eksponert hud / øynene med vann i 15 min. Thoroughly rydde arbeidsbenken etter å ha fullført forsøket.
    3. Ved hjelp av en liten øse eller spatel, overføre NaOH perler fra arbeids lager til å fylle mikrofugerør mini filtre med NaOH opp til den første ytre skrå (~ 5 mm under kant). Trykk de fylte mikrofugerør filtre på benken-top å pakke / kondensere NaOH perler.
      Merk: I dette eksperiment, for å minimalisere overdreven vann adsorpsjon av hygroskopiske NaOH-perler, opprettholde nivået av noen ekstra væske (for eksempel, acetonitril, dimetylsulfoksyd, analytt-løsning) over overflaten av den NaOH kolonne pakking og begrense direkte kontakt med luft.
    4. Skaff et lager av acetonitril (ACN). Overfør ~ 350 mL ACN til hver NaOH fylte mikrosentrifuge mini filter. Hold NaOH senkes under ACN og fjerne store luftbobler ved å røre med en spiss kruset gel-lasting pipette.
      Forsiktig: Acetonitril er en brennbar irriterende.
    5. kolonne Sentrifugering
      1. Ordne mikrofugerør kolonner symmetrisk inne i en sentrifuge; bruke en balanse rør om nødvendig. Unngå å søle noen NaOH granulater inne i sentrifugen. Lukk sentrifuge lokket.
      2. Sentrifuger søylene (som inneholder NaOH og ACN) for ~ 15 sek på 2400 × g.
      3. Ved ferdigstillelse av sentrifugering, fjern mikrofugerør kolonner fra sentrifugen, og kast ACN inn i en farlig avfallsbeholder. Hold NaOH kolonne pakking intakt.
    6. Legg ~ 350 ul dimetylsulfoksid (DMSO) til hver NaOH fylte mikrosentrifuge mini filter. Hold NaOH senkes under DMSO og fjerne eventuelle store luftbobler med en pipette tips. Som tidligere beskrevet, sentrifuger kolonner for ~ 15 sekunder ved 2400 x g, og kast DMSO samtidig som NaOH pakking intakt.
      Forsiktig: DMSO er et mutagen og irriterende, og er lett absorberes gjennom huden.
    7. Plugg alle mikrofugerør mini filtre med pluggene som inngår i spinn filterkit. Overfør ~ 350 mL DMSO til hver NaOH-pakket microfuge mini filter og bruke en 200 mL pipette tips for å fjerne luftbobler i NaOH pakking slik at DMSO når alle regioner innen da NaOH pakking. Unngå å knuse eller overdrevent skrape NaOH perler; NaOH-pulver er uønsket. Fullfør dette trinnet så raskt som mulig.
  2. Utarbeidelse av Plasma Kvalitetskontroll (QC) Prøve (r)
    Merk: For     å sikre konsistente resultater på tvers av eksperimentelle grupper, vurdere å bruke minst en porsjon av en prøve tatt fra en stor, homogen bulk samling av biologisk materiale av interesse som skal analyseres i hvert parti. For eksempel, hvis analyse av blodplasma, bruker aliquot (e) av en bulk innsamling av blodplasma som QC prøven (e) i hver batch. Prosess QC prøver på samme måte som ukjente prøver.
    1. Sentrifuge et lager prøve av QC plasma i 4 minutter ved ~ 10 000 x g. Under sentrifugeringen, kan noen høy tetthet bunnfall slå seg ned til the bunn og en lav tetthet presipitatet kan flyte til toppen av plasmaet. Unngå både ved fjerning alikvot (r) av plasma.
    2. Gå videre til "1,3) Prøvepreparering" nedenfor. Deretter går du tilbake til dette trinnet etter plasma sentrifugering er fullført.
    3. Uttak 9 ul sentrifugert QC plasma og overføre den til en hensiktsmessig merket 1,5 ml polypropylen-reagensrør utstyrt med en snap-stengelokk (heretter referert til som "1,5-ml plast reagensrør"). Tilsett 1 pl deionisert vann til hver alikvot; hvis ønskelig, bruke dette som en bærer for intern standard (er).
    4. Legg 270 mL DMSO til denne plasma kontroll. Vortex for å sikre fullstendig oppløsning.
  3. Prøvepreparering
    1. Få så mange 1,5 ml plast-reagensrør som antall biologiske (analytt) prøver.
    2. Overføring 9 ul av hvert biologiske (analytt) prøve til dets tilsvarende 1,5-ml plast reagensrør. Overføring av 1 ul avionisert vann og 270 ul DMSO til hvert prøverør.
    3. Kraft mix (f.eks vortex og / eller gjentatte ganger pipette opp og ned) prøvene for å sikre fullstendig oppløsning i DMSO.
      Forsiktig: Utfør følgende trinn inne i en avtrekkshette. Brukes i følgende trinn, jodmetan (CH 3 I), diklormetan (CH 2 Cl 2, aka metylenklorid), og kloroform (CHCI3, triklormetan), er flyktige væsker stand til å oppløse visse typer plast (f.eks nitrilhansker) . Pass på å bruke løsemiddelbestandige hansker. På grunn av deres lave viskositet og høyt damptrykk, kan disse reagensene dryppe fra en pipettespiss i løpet av overføringen. Minimalisere reagenstap og potensiell eksponering ved å holde stamløsning tilstøtende til mottakerfartøyet.
    4. Overføre en tilstrekkelig samlet volum på jodmetan til en liten, rent rør. Hver analyseprøve vil kreve 105 mikroliter jodmetan. Transfer ~ 500 mL diklormetan inn another rent rør. For å hindre sprøyte tilstopping, skyll sprøyten med diklormetan umiddelbart etter jodmetan overføring.
      Forsiktig: Iodomethane er foto, flyktige, og potent toksin i stand til å skade sentralnervesystemet eller forårsaker død ved innånding eller svelging. Diklormetan er et potensielt kreftfremkallende, reproduksjons mutagen, og potent irriterende stand til å skade flere organer eller forårsaker død.
    5. Bruk en analytisk sprøyte for å legge til 105 mL jodmetan til hver analytt prøve. Cap analyse rør umiddelbart for å minimere jodmetan fordampning. Grundig vortex og, om nødvendig, en kort stund sentrifuger alle prøver for å sikre at ingen væske forblir i hetten. Enhver fargeendring (f.eks til brun, lilla eller gul) signaliserer jodmetan degradering, noe som kan true følgende permethylation reaksjon.
    6. Skyll den analytiske sprøyte som brukes for å overføre jodmetan med diklormetan minst 3 ganger. Dette vil hindre at det from tilstopping. Kast denne skylling, sammen med ekstra jodmetan og diklormetan til en organisk farlig avfall fartøy. Plasser brukte prøverør inn i en farlig avfallsbeholder.
    7. Skaff et nytt sett med 2 ml plastreservoar rør. Fjern snap-caps om ønskelig.
    8. Trekk ut mikrosentrifuge mini filtre. Sentrifuger unplugged kolonner for 15 sek ved 2400 × g, og deretter forkaste reservoar rør sammen med DMSO avløpsvannet.
    9. Re-plugg de sentrifugerte sentrifugekolonner, og plassere dem inne i nye reservoar rør. Nummer hver spinnkolonne og dens tilsvarende reservoar rør med samme prøve nummer. Sørg for at mini filter plugger er stramt; potensiell lekkasje kan påvirke det neste trinn. Redusere tiden mellom å fjerne DMSO fra spinnkolonner og overføring av analyseprøvene på spinnkolonner.
    10. Permethylation
      1. Kvantitativt overføre hver prøveoppløsning til sin tilsvarende NaOH-perler fylte mikrofuge sentrifuge column. Bruk en 1000-mL pipette tips for dette trinnet. Etter overføring, krympe ~ 2 mm av enden av en 200 mL tips og la den i innholdet kolonne å bruke som et røreverk. Gjenta for alle prøvene.
        Merk: lav viskositet jodmetan kan føre prøvetap fordi analytten løsningen kan dryppe fra pipettespissen under overføringen. Hold i prøverøret og den spinnkolonne ved siden av hverandre med den ene hånden, og raskt overføre prøveløsning med den andre hånden.
      2. Tillat den permethylation reaksjonen forløpe i 11 min. Omrør hver prøve minst 4-5 ganger i løpet av denne perioden. For å lette effektiv permethylation, som oppstår på overflaten av NaOH perler, bruker tips kruset gel-lasting pipettespisser som røre å forsiktig blande kolonneinnholdet. Aggressiv blanding kan punktere spin filter, pulverisere og suspendere NaOH perler (som kan redusere effekten av etterfølgende væske / væske ekstraksjon), og / eller forårsake prøvetap (som sample-gjennomvåt NaOH granulater kan renne fra kolonnen).
      3. I forberedelse for den etterfølgende væske / væske-ekstraksjon trinn, fremstille en tilstrekkelig mengde av 0,5 M natriumklorid (NaCl) oppløsning i en 0,2 M natriumfosfatbuffer (pH 7,0), for å bli lagret ved romtemperatur. Hver prøve vil kreve et totalt ~ 12 ml NaCl-oppløsning for alle tre sykluser av væske / væske-ekstraksjon.
      4. Ved fullføring av 11-min periode permethylation, straks men forsiktig koble kolonnene og sentrifuger dem i 15 sekunder ved 2400 x g. Kast pluggene.
    11. Fjern umiddelbart spinnkolonner fra sentrifugen og plassere dem i et nytt sett av tomme spinnreservoar rør, slik at gjennomstrømnings oppløsning inneholdende fersk permethylated glykaner bak. Ikke kast noe.
    12. Så snart som mulig, tilsett 300 mL acetonitril (ACN) til de tørre, NaOH fylte spin filtre. Sentrifuger spin filtre for 30 sek ved 9600 × g.
    13. immediately deretter overføre den hoved permethylation løsningen (dvs. den oppløsning som ble inkubert med NaOH perler for 11 min og deretter sentrifugert ved sentrifuge filteret i et sentrifugerør før tilsetning av 300 ul av ACN i det foregående trinn) for å silanisert 13 x 100 mm glass testrør inneholdende 42 3,5 ml 0,2 M natriumfosfatbuffer inneholdende 0,5 M NaCl, pH 7,0 og blandes (vortex) umiddelbart. Unngå å overføre noen solid hvit rest i dette trinnet. Gjør dette for hver prøve før du går videre til neste trinn.
    14. Uten forsinkelse, overføring (kombinere) ACN-spin gjennom i hvert reservoar rør til (med) resten av væskeprøven i sine respektive silanisert glassrøret og bland (vortex) umiddelbart. Igjen, unngå å overføre noe heldekkende hvit rest i dette trinnet. Cap, riste, og virvle glasset tube. Gjenta for hver prøve. Kast NaOH søyler og Pasteur pipetter i egnede avfallsbeholdere.
  4. Væske / væske ExtraDette skjer og Glycan Rensing
    1. Inne i avtrekksskap, tilsett 1,2 ml kloroform til hver prøve. Umiddelbart deretter cap silaniserte glassrørene og kraftig blande innholdet.
    2. Pre-varme blokker av metall til ca. 75 ° C i en fordampning manifold. Bruk varmeblokker med brønner som kan romme de 13 mm × 100 mm glassrør.
    3. Skaff et nytt sett med silaniserte Pasteur pipetter, ikke-silaniserte Pasteur pipetter, og silaniserte glass reagensglass med caps.
      Forsiktig: Kloroform (CHCI3) er et irritasjonsmoment, mutagen, og potensielle kreftfremkallende i stand til å trenge gjennom noen typer hansker.
    4. I korthet sentrifuge (~ 3000 x g) prøve inneholdende glassrørene for å separere de vandige og organiske lag.
    5. Bruke en ikke-silanisert Pasteur pipette for å trekke ut tilstrekkelig av det øvre vandige lag slik at ~ 3 mm av det vandige laget forblir over bunnen organisk sjikt.
    6. Legg 3,5 ml av 0,5 M NaCl-løsning i en 0,2 M natriumfosfatbuffer (pH 7) til hvert glassrør, kraftig blander, og en kort stund sentrifuge (~ 3000 x g). Som i forrige trinn (1.4.3), bruke en ikke-HSTTanBeTiandlet Pasteur pipette for å trekke ut vannlaget.
    7. Gjenta det foregående trinnet (1.4.4), men la ~ 1 ml av det vandige sjiktet.
    8. Bruke en ren silanbehandlet Pasteur-pipette for å overføre det organiske lag til et rent og hensiktsmessig merket silanisert 13 x 100 mm prøverør av glass. Unngå vannforurensning ved å ekstrahere i det følgende måte:
      1. Hold både nåværende og nye silanert glass testrør ved siden av hverandre i en hånd. Med den andre hånden, trykk på pipetten pære for å lage bobler mens du setter pipetten ned gjennom vannlaget.
      2. Inne det organiske lag, stopp av bobler, og holde pipetten pære jevn for å tillate de organiske og vandige lag for å stabilisere og skille igjen. Deretter sakte slipper pære å trekke seg så mye av organisac lag som mulig uten vannforurensning.
      3. Hurtig heve pipettespissen gjennom vannlaget, og motstå den naturlige refleks av lett frigjøring av pæren (som resulterer i å trekke ut noen vannforurensning) samtidig øke pipetten ut av røret.
      4. Overfører man raskt ut flytende organiske lag til det tilstøtende nytt rør. Enhver vandig forurensning vil være synlig som små væskedråper på toppen av det ekstraherte organiske sjikt i de nye glassrør. Hvis vandig / NaCl forurensning er synlig, fjerner du det med en pipette; sentrifuger om nødvendig å samle de vandige dråper til en enkelt dråpe.
    9. Kast gamle glassrør, pipetter og vandig og organiske avfallsløsninger. Vask og resirkulere glass tube caps.
    10. Tørk alle prøvene i henhold til en mild og konstant strøm av nitrogen i en forvarmet fordampning manifold ved 75 ° C i ~ 5 min inne i en avtrekkshette. For å sikre fordamping kjøling under alle tørr-ned steps, må en mild og konstant strøm av nitrogen forstyrre væskeoverflaten uten spruting eller spruter væske. Fjerne prøver fra fordampningen manifolden ved fullstendig tørking av det endelige prøven. Hvite flekker på bunnen av en tørket glassrør indikere buffer / NaCl-forurensning.
    11. Pause prosedyren her hvis det ikke er nok tid igjen i dag for å fullføre TFA hydrolysetrinnet. Midlertidig (dvs. over natten) lagre tørre prøver ved -20 ° C. For å fortsette prosedyren etter lagring, fjerne prøver fra -20 ° C fryser og tillate dem å varme helt før uncapping.
    12. Mens prøvene varme, som en forberedelse til trifluoreddiksyre (TFA) hydrolyse (neste trinn), sett varmekappe slik at temperaturen av de flytende test-innholdet i røret vil nå 121 ° C. Klargjør TFA løsning fra TFA lager (se trinn 2.1 nedenfor).

2. trifluoreddiksyre (TFA) Hydrolyse

  1. Fremstille en tilstrekkelig mengde av en 2,0 M TFA-løsning i avionisert vann. Hver analytt prøve vil kreve 325 ul av 2,0 M TFA-løsning. Konsentrert TFA er 13,0 M.
  2. Legg 325 ul 2,0 M TFA til hver prøve analytt. For å forhindre TFA fordampning og tap av prøven under den etterfølgende tørketrinn (2.3 nedenfor), tett hetten hvert prøverør umiddelbart etter tilsetning av TFA. Marker løsningen nivå i alle glassrør. Vortex hver prøve grundig før neste trinn.
  3. Inkuber tett forseglet prøverør i 2 timer i et passende forhåndsoppvarmet varmeblokk eller ovnen, slik at innholdet når en temperatur på 121 ° C. Ved hjelp av en varmeblokk i stedet for en ovn, for å dekke prøverør med aluminiumsfolie forhindre kondensering av TFA ved toppen av røret, og delvis tørking av prøven rest på bunnen av røret. Sjekk prøveløsningen nivå etter 20-30 min.for å sikre minimal TFA fordampning. Om nødvendig, stramme caps videre eller erstatte caps for en tettere passform.
  4. I løpet av to-timers vente, satt en annen fordampning manifold til 75 ° C for neste trinn (se 2.4 nedenfor).
  5. Når den 2-timers oppvarmingsperiode er fullført, tørre prøver ved 75 ° C under en forsiktig strøm av nitrogengass for ~ 15 min. Ikke la prøver uten tilsyn i mer enn 15 min. Ofte sjekke prøvene, og slutte oppvarming og tørking når alle prøvene er tørre.
  6. Pause prosedyren her hvis det ikke er nok tid igjen i dag for å fullføre reduksjonstrinnet. Midlertidig (dvs. over natten) butikk prøver ved -80 ° C. For å fortsette prosedyren etter lagring, fjerne prøver fra -80 ° C fryser, og tillate dem å varme helt før uncapping.

3. Reduksjon

  1. Inne i et avtrekksskap, fremstille en tilstrekkelig mengde av en 10 g / l natrium-borhydrid (NaBH4) oppløsning i 1 M annomiakkum-hydroksyd (NH4OH). Hver prøve vil kreve 475 ul av denne løsningen. Lag en ny løsning for hvert parti av prøvene. Konsentrert ammoniumhydroksid (27-30% vekt / vekt NH 3) er omtrent 14,5 M.
    Forsiktig: Natriumborhydrid (NaBH4) er en hygroskopisk, vann-reaktivt toksin og potent irriterende at utslipp-upon kontakt med vann meget brannfarlig damp som forårsaker alvorlige brannskader ved innånding, svelging eller øye / hudkontakt.
    Forsiktig: Ammonium hydroxide (NH 4 OH) er en etsende irriterende og toksin stand til å forårsake alvorlige brannskader og irreversible organskade ved innånding, svelging eller øye / hudkontakt. Skyll berørte områder med vann i 30 minutter, og hindre offeret fra å gni eller klø de berørte områdene.
  2. Til hver prøve, tilsett 475 ul av 10 g / l NaBH4 i 1 M NH4OH. Mix prøver grundig for å oppløse eventuelle rester. Cap reagensglass ogat reduksjonsreaksjonen fortsette i 1 time.
  3. I løpet av en-timers vente, satt det oppvarmede fordampning manifold til 75 ° C. Bruke en varmeblokk med passende brønner for glassrørene (se 3.4 nedenfor).
  4. Når en-timers reaksjonsperioden er fullført, tilsettes 63 mL metanol (MeOH) til hver prøve. Dette trinnet og det etterfølgende trinn fjerne rester av bortrifluorid som trimetylborat - en relativt flyktig væske som koker ved 68 ° C.
  5. Tørre prøver (i forvarmet manifold) ved 75 ° C under en forsiktig strøm av nitrogengass for ~ 15 min. Ofte sjekke prøver og ikke la dem uten tilsyn. Små væskedråper på bunnen av glassrørene indikerer at prøven er ikke ennå tørr.
    Merk: For å skille luftbobler fra væskedråper, vippe reagensrør. Bare væskedråper vil flytte etter å vippe, men det motsatte er ikke alltid sant: hvis en boble ikke beveger seg, kan det likevel være en (liten) væskedråper.
  6. Når samples er helt tørre, forberede en 9: 1 (v / v) oppløsning av metanol (MeOH) og eddiksyre (AcOH). Legg 125 ul av denne MeOH: AcOH oppløsning til hver prøve.
  7. Tørre prøver (i forvarmet manifold) ved 75 ° C under en forsiktig strøm av nitrogengass.
  8. Når prøvene er helt tørre, vakuum-tørke prøvene i 20 minutter ved romtemperatur: Plasser prøvene i en plast vakuum kar (slik som de som selges av FoodSaver), lukk vakuum lokk, sett vakuum velgeren på "vakuum", kobler vakuum slange, og slå på støvsugeren. For å demontere vakuum, reversere disse trinnene. Vent til systemet helt dekomprimere før du prøver å åpne vakuum lokket.
  9. Pause prosedyren her hvis det ikke er nok tid igjen i dag for å fullføre reduksjonstrinnet. Midlertidig (dvs. over natten) butikk prøver ved -80 ° C. For å fortsette prosedyren etter lagring, fjerne prøver fra -80 ° C fryser, og tillate dem å varme helt før uncapping.
  10. Mens du venter på prøver å støvsuge tørke (eller varm, etter lagring), forberede reagenser for neste trinn. Få tak i og nummer en silanert konisk bunn autosampler (AS) hetteglass (med cap) for hver prøve. Videre forvarmes både et grunt-brønn AS-ampulle varmeblokk og en dyp brønn glass-rør blokk slik at glassrøret Innholdet vil nå en temperatur på 50 ° C.

4. acetvlering (Utføres i en avtrekkshette)

  1. Legg 18 mL deionisert vann til hver prøve. Cap og grundig vortex alle rør for å løse opp eventuelle utfellinger.
  2. Tilsett 250 ul eddiksyreanhydrid til hvert glassrør. Cap, grundig vortex, og sonicate i et vannbad i 2 minutter for å sikre fullstendig oppløsning av eventuelle rester og utfellinger.
  3. Dekk glassrør med aluminiumsfolie, og inkuber ved en indre temperatur på 50 ° C i 10 min.
  4. Legg 230 mL konsentrert trifluoreddiksyre (TFA) til hver prøve. Umiddelbart cap end blande prøvene. Deretter inkubere prøvene dekket med aluminiumsfolie-i 10 minutter ved en indre temperatur på 50 ° C.
  5. Etter inkubering, tilsett 1,8 ml diklormetan (CH 2Cl 2) til hver prøve. Cap og bland godt.
  6. Tilsett 2,0 ml deionisert vann til hver prøve. Cap og mix prøver også. Sentrifuger fra 0 til 3000 x g for å skille lagene. Bruke en ikke-silanisert Pasteur pipette for å utføre væske / væske-ekstraksjon som er beskrevet i trinn 1.4.6, unngå vanninntrengning.
  7. Gjenta utvinning gang til, for totalt to ekstraksjoner. Bruk silaniserte Pasteur pipetter for å overføre det organiske laget til merket HSTTanBeTiandlet AS ampuller (holdt sikkert i et AS stativ). Fyll AS ampuller til like under randen.
  8. Bruk en forvarmet, grunne brønner oppvarming blokk til tørre prøver (i AS hetteglass) i 15 minutter ved 40 ° C under nitrogengass. Ikke over-dry. Sluttprodukter er kjent som delvis denaturert alditol acetater (PMAAs).

5. gasskromatografi - massespektrometri (GC-MS)

  1. Rekonstituer hver prøve i 100 mL aceton og bland godt. Bruke en autosampler for å injisere 1 mL av hver prøve i delt modus til GC split-modus foring (opprettholdt ved 280 ° C og inneholdende en liten plugg av silanbehandlet glassull). Bruke et deleforhold på 40. Bruk helium som bæregass i konstant strømningsmodus på 0,8 ml / min gjennom en 30-meter DB-5 ms GC-kolonne med en 0,25 mm ID og 0,25 mikron filmtykkelse.
  2. Holde den innledende GC ovnstemperaturen ved 165 ° C i 0,5 min. Etter den første holdetiden programmere ovnen til rampen temperaturen, for hvert forsøk, fra 165 ° C til 265 ° C ved en hastighet på 10 ° C / min (som tar 10 min) og deretter umiddelbart rampe temperaturen 265 ° C til 325 ° C med en hastighet på 30 ° C / min (som tar 2 min) og opprettholde temperaturen ved 325 ° C i 3 minutter. Den totale kjøretid per prøve er 15,5 min.
  3. Bruk en proPerly innstilt og kalibrert massespektrometer for å utsette prøvekomponentene som ble eluert fra GC-kolonnen til elektron ionisering (EI, 70 eV ved 250 ° C). For en TOF masse analysator, analysere fragmenter fra m / z 40 til m / z 800 med en 0,1 sekunders puls summering rate. Sett en EI-filament løsemiddel forsinkelse på 2,5 min.

6. Data Analysis

  1. Ved hjelp av en TOF masse analysator, summerer de mest tallrike og / eller diagnostiske fragmentioner for hver PMAA ved å bruke en masse vindu på 0,15 Da for å oppnå en ekstrahert ion kromatogram. Target ioner for hver PMAA er publisert andre steder, 33 men følgende endringer er gjort: t-GLC ioner er nå 145,1 + 205,1; 2-Man ioner er 161,1 + 189,1; 3-Gal ioner er 161,1 + 233,1, 6-Gal ioner er 161,1 + 189,1 + 233,1; 2,6-Man ion er 189,1; 3,6-Man ioner er 189,1 + 233,1.
  2. Bruk QuanLynx eller annen programvare for å automatisk integrere topparealene for hvert summert hentet ion kromatogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En total ionestrøm kromatogram (TIC) som viser vellykket permethylation, hydrolyse, reduksjon, og acetylering av humane blodplasmaprøver i forhold til tilfeller hvor to kritiske permethylation trinn ble utført på feil måte er vist i figur 3.

Absolutt Yield av HexNAcs forhold til heksoser:

N -acetylhexosamine (HexNAc) delvis denaturert alditol acetates (PMAAs) har en tendens til å ha lavere avkastning enn heksoser. 43 For å beregne den absolutte avkastningen av HexNAcs forhold til heksoser, seks 10-ig prøver av N -acetyllactosamine (en Gal1-4GlcNAc disakkarid) i 10 pl vann ble analysert. TIC topparealer for terminal galaktose (t-Gal) og 4-GlcNAc ble integrert. Prosentandelen av 4-GlcNAc i forhold til den totale mengde av t-Gal og 4-GlcNAc var 11,3 ± 0,7%(SEM). Selv om HexNAc utbytter er reproduserbare (se nedenfor), er det faktum at denne verdien er mye mindre enn den teoretiske verdi på 0,5 indikerer at utbyttet av HexNAcs er fundamentalt lavere enn den for heksoser. (The HexNAc teoretisk er 0,5 fordi N -acetyllactosamine er en 1:. 1 heksoseok-HexNAc disakkarid)

Intra- og inter Reproduserbarhet:

Intra- og inter reproduserbarhet for alle sukker noder som bidrar minst 1% av den totale heksoseok eller HexNAc signal er gitt i tabell 1. Disse dataene ble kjøpt opp av 3 separate analytikere på 3 forskjellige dager, med samme lager av EDTA plasma. Autosampler stabilitetsdata i henhold til denne protokollen er optimalisert for de 18 mest tallrike glykan noder i humant plasma (dvs. de med> 1% av det totale heksose eller HexNAc signal) er gitt i figur 4.

Andre Kjente Observasjoner:

Mens optimalisere permethylation metodikk, fant vi ut at det ikke er nødvendig å hindre absorpsjon av vann av NaOH perler før første gangs vask med acetonitril. Vi har også funnet at tilstedeværelsen av en liten mengde vann under den endelige acetylering trinn i kombinasjon med en kort periode med oppvarming med eddiksyreanhydrid uten TFA bidrar til å lette fullstendig reaksjon. Endelig er den høye oppløsningsevne time-of-flight (TOF) massespektrometri ikke nødvendig for vellykket sukker node analyse: Første resultatene basert på parallell injeksjon av det samme settet av prøver på en GC-TOF-MS og en tradisjonell girkasse kvadrupol -basert GC-MS, som brukes i valgt ion-overvåkingsmodus (SIM) viser lignende resultater i form av den endelige normalis heksoseok og HexNAc relative hopetall.

er.within-page = "1"> Figur 1
. Figur 1. Molekylær oversikt over det globale sukker metylering analyse prosedyre En O -bundne sukker er illustrert; disse frigjøres under den permethylation prosessen, som har blitt tilpasset fra Goetz. 40 Ved å følge permethylation og hydrolyse, er monosakkarider redusert og begynnende hydroksylgrupper "merket" ved acetylering. Den unike mønster av metylering og acetylering i slutt delvis metylerte alditol acetater (PMAAs) tilsvarer den unike "glykan node" i den opprinnelige intakte polymeren og gir det molekylære grunnlaget for separasjon og kvantifisering av GC-MS. N -bundne og glykolipid glykaner er utgitt som trepunkt-merket monosakkarider under syrehydrolyse. Tilpasset fra Borges et al. 33 med tillatelse.> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Konsept oversikt over den analytiske konseptet. En glykosyltransferase oppregulert (for eksempel GnT-V) fører til en økning i mengden av et spesifikt, unikt knyttet glykan monosakkarid rest (a-2,6-bundet mannose "node" i dette eksempel) -som, gjennom den etterfølgende virkning av andre glycosyltransferases, kan føre til dannelse av en blanding av heterogene hel-glykan strukturer ved lavt kopitall hvert-som alle kan være vanskelig å påvise og kvantifisere i rutinemessig måte. Analytisk pooling sammen de "sukker noder" fra blant alle de avvikende sukkerstrukturer gir en mer direkte surrogat måling av GnT-V aktivitet enn noen enkelt intakte glykan. Samtidig måling av N -, O -, og lipid koblet "glyc en noder "i hele biospecimens som er beskrevet her (og opprinnelig steder 33) representerer et konseptuelt nye middel som å oppdage og overvåke sukker-affektive sykdommer som kreft. Faktiske hentet ionekromatogrammer fra 10-mikroliter blod plasmaprøver vist. Tall i tilknytning til monosakkaridrester i glykan strukturer indikerer posisjonen hvor den høyere resten er knyttet til den nedre rest. Hvis ingen koblingsstillinger er angitt i kromatogrammet kommentaren resten er enten i den terminale posisjon, eller frie i løsning (for eksempel glukose). Alle rester . bortsett fra sialinsyre kobling nedad via deres 1-posisjon; sialinsyre-linker nedad via sin 2-stilling delt i kromatogram som viser endring i ekstraherte ionekromatogrammer: m / z 117 129 for heksose- rester og m / z 116 + 158 for N - acetylhexosamine (HexNAc) rester. Hentet fra Borges et al. 33 med tillatelse.61 / 53961fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Representative resultater. Total ionestrøm kromatogrammene (tikk) for glycan node analyse av det samme humane blod EDTA plasmaprøve hvori A) den prøve ble behandlet på riktig måte, b) den hvite rest i permethylation løsningen som ble spunnet gjennom NaOH kolonnen ble ført inn i den etterfølgende blandingen for væske / væske-ekstraksjon, og C) den permethylation løsning som ble spunnet gjennom kolonnen NaOH ble tilsatt til fosfatbufferen, men ikke blandet grundig før tilsetning av kloroform for væske / væske-ekstraksjon. Legend gitt i figur 2. Vennligst klikk here for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Autosampler stabilitet. Autosampler stabilitet over 48 timer for de 18 mest tallrike sukker noder i humant plasma. Ved 22 timer ble prøven ble fullstendig tørket og rekonstituert i 120 mL aceton. Hver klynge av datapunkter som representerer fire på hverandre følgende injeksjoner av den samme prøven. Svarte linjer omfatte ± 15% av gjennomsnittlig normalisert verdi for hver sukker node. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1. intra- og inter reproduserbarhet. Verdiene angir% CV av total heksose eller total HexNAc-normaliserte individuelle sukker noder. Alle sukker noder bidrar med minst 1% av den totale heksose eller HexNAc signal er oppført. Data ble kjøpt opp av 3 separate analytikere på 3 forskjellige dager, med samme lager av EDTA plasma. N = 6 prøver per batch. Klikk her for å laste ned denne tabellen som et Excel-regneark.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Generelt sett er vellykket produksjon av delvis metylerte alditol acetater (PMAAs) fra heksoser fylt med færre problemer og er mer robust enn en vellykket produksjon av N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Den eksakte mekanismen bak dette fenomenet som det utspiller seg i alle trinn i denne prosedyren er ukjent, men må forholde seg til den unike kjemien av N-acetyl-gruppen (heller enn hydroksylgruppe) som er unik for HexNAcs forhold til heksoser. Mekanismen bak dette fenomenet som gjelder syrehydrolyse er forklart andre steder. 43 Kort sagt, kapasiteten for N -methylacetamido å bli positivt ladet under syrehydrolyse gjør glykosidisk binding motstandsdyktig mot syrehydrolyse. Dette forklarer det lave utbyttet av HexNAc i forhold til heksose- (11,3% av total HexNAc + heksose signal, snarere enn 50% av den totale) som beskrevet ovenfor for analyse av N -acetyllactosamine. Spesielt er dette forholdsvis lower utbyttet av HexNAcs gjør dem ikke vanskelig å oppdage i komplekse biofluids og vev, eller være til hinder for lettvinte påvisning av sukker noder som stammer fra store, komplekse glykaner (f.eks 2,4-Man, 2,6-Man, 3,4,6 -Man, og 3,4-GlcNAc, figur 2). 33 Gitt den måte på hvilken Xic topparealene for glykan noder er normalisert (trinn 6.3), så lenge som den relative utbytte av hver enkelt HexNAc forblir uforandret i forhold til andre HexNAcs ( som den gjør det, se tabell 1), nyttig informasjon om de relative mengder av de forskjellige HexNAcs mellom forskjellige prøver kan oppnås. Dette gjelder for heksoser også. Videre har vi tidligere vist at de prosenter av heksoser til HexNAcs vise konsekvent kvantitativ oppførsel samt 33 - et fenomen som er kontinuerlig overvåket via inkorporering av QC prøven (e) i hver gruppe.

Måten som permethylation er utført har størst innvirkning pådet totale utbytte og reproduserbarhet HexNAc PMAAs. Spesielt stor forsiktighet bør tas for å helt unngå eksponering av permethylated glykaner til alkalisk vannforhold. To viktige skritt i denne forbindelse er 1) å forlate alle hvite bunnfallet i spin-gjennom løsninger bak (trinn 1.3.13 og 1.3.14), og 2) umiddelbart blande ring gjennom løsninger når de legges til i fosfatbuffer ( trinn 1.3.13 og 1.3.14). En buffer snarere enn enkel saltløsning er inkludert på dette trinn og for etterfølgende væske / væske-ekstraksjonstrinn for å hindre utilsiktet alkalisering av den vandige oppløsning. Vi tror at under alkaliske betingelser acetylgruppen av det metylerte og acetylerte 2-aminogruppen i HexNAcs kan gjennomgå hydrolyse, noe som resulterer i et mer polart sekundært amin som reduserer den totale utvinning effektiviteten av den tilknyttede glykan i kloroform.

Den mest lett gjenkjennelige trekk uten hell permethylated HexNAcs erintensiteten av 4-bundne GlcNAc (4-GlcNAc) kromatografisk topp i forhold til de av 6-Gal, 3,6-Man, og grunnlinjen intensiteten av bakgrunns i løpet av siste kolonne bake ut (figur 3). Når den absolutte mengde av de 4-GlcNAc PMAA er lav, dens overflod normalisert i forhold til alle andre HexNAcs har også en tendens til å være lav, med en samtidig økning (mest merkbart) 3,4-GlcNAc.

Noen endringer som er utviklet for å optimalisere samlet utbytte og analyse robusthet har blitt gjort siden vår første publikasjon som beskriver denne analytisk tilnærming 33 En av disse endringene er måten de integrerte hentet ionekromatogrammer (XICs) er normalisert. For enkelhets skyld, vi deler nå området for hver enkelt heksoseok XIC med summen av alle heksoseok xic områder; Likeledes er det området av hver enkelt HexNAc XIC dividert med summen av alle HexNAc Xic områder. Som det fremgår av tabell 1, samlet inter / inter-analytiker reproducibilligheten for alle sukker noder som bidrar til> 1% av deres respektive heksose- eller HexNAc signal gjennomsnitt 13% CV.

Så vidt vi vet, er dette den eneste inkarnasjonen av virkelig bottom-up glycomics der glykaner er først brytes ned og deretter deres komponenter analysert for å konstruere en kvantitativ prøve spennende portrett av glykan sammensetning. Her, i stedet for tradisjonell enzymatisk utgivelse, permethylation prosessen ikke-reduktiv eliminerer (utgivelser) O -bundne glykaner fra sine respektive proteiner, 40 mens N -bundne glykaner blir frigjort ved syrehydrolyse. 33 Som en komplementær tilnærming til tradisjonelle top-down glycomics er denne tilnærmingen i stand til basseng unike sukker funksjoner av interesse som "core fucosylation", "6-sialysering", "halverer GlcNAc", og "beta 1-6 forgrening" til enkle analytiske signaler (se, 4,6-GlcNAc , 6-Gal, 3,4,6-Man, og 2,6-Man noder i figur 2, respectively). I tradisjonelle top-down tilnærming, er funksjoner som disse som til slutt avhengige av de unike aktivitetene til en eller to viktige glycosyltransferases 33 vanligvis fordelt på dusinvis av intakte glykaner og kan noen ganger være vanskelig eller umulig å løse (f.eks 3-sialysering vs. 6-sialylering) på grunn av degenerasjonen av noen intakte sukkermasser. Videre har bottom-up tilnærming som presenteres her demonstrert første løftet i ikke-invasiv påvisning av lungekreft. 33 Videre studier er underveis for å validere disse innledende funnene, samt ytterligere, men upubliserte resultater knyttet til påvisning av andre former for kreft.

Den største begrensningen av den metode som er beskrevet her er at det er begrenset med hensyn til grensene for dens deteksjon, hvis det skulle bli brukt til pre-isolerte glykoproteiner. Basert på upubliserte analyser av enkelte sukker standarder uten bærerprotein, begrensninger for kvantifisering for individuelle glykaner synes å ligge i det lave mikrogram rekkevidde. Dette er på ingen måte lave LOQs i absolutte tall, men dette faktum spiller ingen rolle med hensyn til den opprinnelig ment omfanget av assay-som ikke er designet for og har ikke behov for å oppnå lavt LOQs (i det minste for de formål som er beskrevet her og i vår forrige publisering 33). Faktisk inneholder humant plasma / serum glykoproteiner i 10s mg / ml konsentrasjonsområde-noe som betyr at for analyse av blodplasma / serum vi bare injisere ~ 1/100 th av det endelige prøvevolum og delt 40 ut av 41 deler som liten mengde avfall i GC injektor port. Uten denne praksis kan noen av de sukker nodene mette detektoren. Picomol mengder glykoproteiner som kan produsere tilstrekkelige intakte sukker signaler ved konvensjonell top-down MALDI-MS eller LC-MS baserte tilnærminger kan ikke oppdages med denne tilnærmingen. Videreutvikling av metodikken er i gang for å bøte på denne begrensningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium hydroxide beads  367176 Sigma-Aldrich  20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 ml Spin column 69705 Pierce division of ThermoFisher Scientific  Includes  plugs and polyethylene frits 
GC-MS autosampler vial (silanized)* C4000-9 ThermoFisher Scientific Target DP High Recovery Vial, 1.5 ml, 12 mm x 32 mm, includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 ml polypropylene test tubes 05-402-25 ThermoFisher Scientific  Snap-cap lid
2 ml polypropylene test tubes 05-408-138 ThermoFisher Scientific  Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) D8418 Sigma-Aldrich  BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane  I8507 Sigma-Aldrich  Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile A955-4 ThermoFisher Scientific  Optima LC/MS
Microcentrifuge 75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge ThermoFisher Scientific  24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)* 53283-800 VWR 13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes 14-930-15D ThermoFisher Scientific  Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13 mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride  S7653 Sigma-Aldrich  >99.5% pure
Chloroform 4440-08 Macron Fine Chemicals 
Trifluoroacetic acid  299537 Sigma-Aldrich  99% purified by redistillation for protein sequencing 
Sodium borohydride 71321 Fluka Analytical  99%
Ammonium hydroxide solution  320145 Sigma-Aldrich  NH3 content: 28.0-30.0%
Methanol AH230-4 Honeywell Burdick & Jackson HPLC grade
Acetic acid  320099 Sigma-Aldrich  99.70%
Plastic vacuum desiccator  Any model of adequate size FoodSaver
Acetic anhydride  539996 Sigma-Aldrich  99.50%
Dichloromethane  D143SK-4 ThermoFisher Scientific  Stabilized HPLC grade
Acetone  9006-03 J.T.Baker Baker Analyzed 
Heated evaporation manifold (main unit) pi18823 ThermoFisher Scientific  Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator) pi18826 ThermoFisher Scientific  ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold pi18816 ThermoFisher Scientific  Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13 mm dia test tubes, 13 holes (14 mm dia. x 45 mm deep)
Gas chromatograph Model A7890 Agilent  Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer  GCT Premier (Time-of-Flight) Waters 
Split-mode liner (deactivated / silanized) 5183-4647 Agilent Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column 122-5532 Agilent 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane 95541 Sigma-Aldrich 
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization) EW-06536-30 Cole-Parmer 12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, M., Song, L., Qin, X. Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines. J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).
  2. Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans (2009).
  3. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  4. Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).
  5. Rini, J., Esko, J., Varki, A. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).
  6. Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer. Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).
  7. An, H. J., et al. Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer. J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).
  8. Kanoh, Y., et al. Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression. Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).
  9. Kyselova, Z., et al. Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer. J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).
  10. Okuyama, N., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation. Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).
  11. Zhao, J., et al. Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera. J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).
  12. Comunale, M. A., et al. Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma. J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).
  13. Goldman, R., et al. Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis. Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).
  14. Aurer, I., et al. Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma. Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).
  15. Abd Hamid, U. M., et al. A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression. Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).
  16. Kyselova, Z., et al. Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles. Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).
  17. Hongsachart, P., et al. Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma. Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).
  18. Arnold, J. N., et al. Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer. J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).
  19. Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).
  20. Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival. Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).
  21. Chen, G., et al. Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer. J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).
  22. Takeda, Y., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer. Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).
  23. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  24. Mehta, A. S., et al. Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis. J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).
  25. Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation. Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).
  26. Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. Genomics and epigenomics of the human glycome. Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).
  27. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).
  28. Tuccillo, F. M., et al. Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43. Biomed Res Int. , (2014).
  29. Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).
  30. Brockhausen, I. Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions. EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).
  31. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  32. Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).
  33. Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens. Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).
  34. Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography. J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).
  35. Ciucanu, I., Caprita, R. Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis. Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).
  36. Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).
  37. Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis. Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).
  38. Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).
  39. Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells. Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).
  40. Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity. Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).
  41. Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).
  42. Seed, B. Silanizing glassware. Curr Protoc Immunol. 21, A.3K.1-A.3K.2 (1997).
  43. Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen. Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).

Tags

Chemistry glykobiologi glykaner glykosyltransferase kreft permethylation massespektrometri (MS) gasskromatografi (GC) glykoproteiner,
Glycan Node analyse: En bottom-up tilnærming til glycomics
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zaare, S., Aguilar, J. S., Hu, Y.,… More

Zaare, S., Aguilar, J. S., Hu, Y., Ferdosi, S., Borges, C. R. Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics. J. Vis. Exp. (111), e53961, doi:10.3791/53961 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter